植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)

關(guān)于植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)第1頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)10分，星期五

單細(xì)胞的分離由完整的植物器官分離單細(xì)胞由培養(yǎng)組織（如愈傷組織）中分離單細(xì)胞第2頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)10分，星期五1由完整的植物器官分離單細(xì)胞機(jī)械法酶解法

葉片是分離單細(xì)胞的最好材料第3頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)10分，星期五1.1機(jī)械法

方法A：用刀片刮葉片

(花生成熟葉片)第4頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)10分，星期五具體方法:撕去表皮露出葉肉細(xì)胞用解剖刀刮下細(xì)胞第5頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)10分，星期五

方法B：葉片研碎、離心輕輕研磨加研磨介質(zhì)過濾、離心第6頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)10分，星期五

研磨介質(zhì)：40ml20umolSucrose10umolMgCl2

20umoltris—HCL(三羥甲基氨基甲烷

)PH7.8注意：只有薄壁組織排列松散，細(xì)胞間結(jié)觸點(diǎn)很少時(shí)用機(jī)械法分離葉肉細(xì)胞才能取得成功。第7頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)10分，星期五注意：大麥、小麥和玉米很難通過酶解法使細(xì)胞分離。（葉肉細(xì)胞伸長(zhǎng)，并在許多地方收縮，細(xì)胞間形成一種互鎖結(jié)構(gòu)）第8頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)10分，星期五事例分離籬天劍葉肉細(xì)胞的機(jī)械方法葉片消毒勻漿過濾離心植板75％酒精，7％次氯酸鈉10ml培養(yǎng)基1.5克1cm2葉片低速，去碎屑，游離細(xì)胞沉降第9頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)10分，星期五1.2酶解法Takebe等（1968）最早報(bào)道：用果膠酶處理可以分離大量的葉肉細(xì)胞加果膠酶過濾、離心第10頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)10分，星期五1.3機(jī)械法和酶解法比較機(jī)械法酶解法細(xì)胞不受到酶的傷害；不用質(zhì)壁分離；細(xì)胞產(chǎn)量低；細(xì)胞易破。細(xì)胞受到酶的傷害；要質(zhì)壁分離；細(xì)胞產(chǎn)量高；細(xì)胞不易破。第11頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)10分，星期五2由培養(yǎng)組織（愈傷組織）分離單細(xì)胞材料：胡蘿卜肉質(zhì)根步驟：1誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織2愈傷組織反復(fù)繼代，使組織不斷增殖，提高愈傷組織的松散性；第12頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)10分，星期五搖床用于振蕩繼代懸浮3Subculture

將愈傷組織在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，建立懸浮培養(yǎng)物優(yōu)點(diǎn)：細(xì)胞團(tuán)成小細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞；在培養(yǎng)基中均勻分布；有空氣交流。第13頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)10分，星期五植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)（Suspensionculture）特點(diǎn)：細(xì)胞可以不斷增殖，形成高密度的細(xì)胞群體，適于大規(guī)模培養(yǎng)；能夠提供大量較為均勻的細(xì)胞，為研究細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化創(chuàng)造方法和條件。必須指出：懸浮培養(yǎng)中既有單細(xì)胞，也有小細(xì)胞團(tuán)。概念：是指一種在受到不斷搖動(dòng)的液體培養(yǎng)基里，培養(yǎng)單細(xì)胞及小細(xì)胞團(tuán)的組織培養(yǎng)系統(tǒng)。第14頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)10分，星期五1、起始懸浮液的制備愈傷組織液體培養(yǎng)基搖床振蕩懸浮培養(yǎng)質(zhì)地疏松，細(xì)胞分散程度大；質(zhì)地緊密，細(xì)胞分散程度小，不適于懸浮培養(yǎng)轉(zhuǎn)速30～150rpm防細(xì)胞破裂第15頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)10分，星期五第16頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)10分，星期五2、懸浮培養(yǎng)的基本形式分批培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)第17頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)10分，星期五2.1分批培養(yǎng)（Batchculture）2.1.1含義：將細(xì)胞分散在一定容積的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中除了氣體和揮發(fā)性代謝產(chǎn)物可以同外界空氣交換外，一切都是密閉的。它是進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞分裂的生理生化研究常用的培養(yǎng)方法。第18頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)10分，星期五2.1.2特點(diǎn)

培養(yǎng)基體積固定當(dāng)培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)耗盡時(shí)，細(xì)胞的分裂和生長(zhǎng)也停止必須適當(dāng)攪拌第19頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)10分，星期五2.1.3繼代的方法和最佳時(shí)期繼代方法：用注射器或移液管吸取一定量的含單細(xì)胞和小細(xì)胞團(tuán)的懸浮培養(yǎng)物，并移到含有新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶里，繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。

注意：要適當(dāng)稀釋第20頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)10分，星期五繼代第21頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)10分，星期五最佳繼代時(shí)期：

選擇指數(shù)生長(zhǎng)期和直線生長(zhǎng)期。第22頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)10分，星期五2.1.4細(xì)胞生長(zhǎng)曲線在整個(gè)培養(yǎng)過程中，細(xì)胞數(shù)目不斷發(fā)生變化，呈現(xiàn)出明顯的由慢到快，再到慢，最后增長(zhǎng)停止的細(xì)胞周期。

細(xì)胞的生長(zhǎng)呈S形曲線第23頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)10分，星期五滯后期

(lagphase)指數(shù)生長(zhǎng)期(exponentialphase)直線生長(zhǎng)期(linearphase)減慢期(progressivedecelerationphase)靜止期(stationaryphase)培養(yǎng)時(shí)間培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)目1234512345第24頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)10分，星期五滯后期

(lagphase)

細(xì)胞很少分裂，其時(shí)間長(zhǎng)短取決于在繼代時(shí)原種培養(yǎng)細(xì)胞所處的生長(zhǎng)期和轉(zhuǎn)入細(xì)胞數(shù)量的多少培養(yǎng)時(shí)間培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)目123451第25頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)10分，星期五指數(shù)生長(zhǎng)期(exponentialphase)

細(xì)胞分裂活躍，細(xì)胞數(shù)目迅速增加培養(yǎng)時(shí)間培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)目123452第26頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)10分，星期五直線生長(zhǎng)期(linearphase)細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育最快的時(shí)期培養(yǎng)時(shí)間培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)目123453第27頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)10分，星期五減慢期(progressivedecelerationphase)

由于培養(yǎng)基中某些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)已經(jīng)耗盡，或是由于有毒代謝產(chǎn)物的積累，細(xì)胞的增長(zhǎng)逐漸減慢培養(yǎng)時(shí)間培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)目123454第28頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)10分，星期五

生長(zhǎng)幾乎處于停止?fàn)顟B(tài)，細(xì)胞數(shù)目增加極少，甚至開始死亡。靜止期(stationaryphase)培養(yǎng)時(shí)間培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)目123455第29頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)10分，星期五小結(jié)：

（1）滯后期的長(zhǎng)短主要取決于在繼代時(shí)原種培養(yǎng)細(xì)胞所處的生長(zhǎng)期和轉(zhuǎn)入細(xì)胞數(shù)量的多少。（2）加入條件培養(yǎng)基可以縮短滯后期。條件培養(yǎng)基：曾培養(yǎng)過一段時(shí)間組織或細(xì)胞的培養(yǎng)基。（3）縮短兩次繼代時(shí)間間隔，則可使懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞一直保持指數(shù)生長(zhǎng)期。（4）如果使處在靜止期的細(xì)胞懸浮液保持時(shí)間太長(zhǎng)，則會(huì)引起細(xì)胞的大量死亡和解體。第30頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)10分，星期五操作注意事項(xiàng)：對(duì)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞繼代時(shí)，進(jìn)液口的孔徑要小，只能通過單細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)（2～4細(xì)胞），使用吸管或注射器。繼代前，培養(yǎng)容器靜置短時(shí)間，大細(xì)胞團(tuán)沉降，再吸上層懸浮液。依此，多次，可建立良好的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物。第31頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)10分，星期五2.2連續(xù)培養(yǎng)（Continuousculture）加入培養(yǎng)基排出培養(yǎng)基及其培養(yǎng)物

二者體積相等分：開放式連續(xù)培養(yǎng)封閉式連續(xù)培養(yǎng)第32頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)10分，星期五開放式和封閉式區(qū)別封閉式中：排出液中的細(xì)胞用機(jī)械方法收集后，又放入原培養(yǎng)基，所以其培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)目不斷增加；開放式中：在注入新鮮培養(yǎng)基的同時(shí)，培養(yǎng)細(xì)胞隨同培養(yǎng)液一起流出。第33頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)10分，星期五連續(xù)培養(yǎng)意義：植物細(xì)胞代謝調(diào)節(jié)的研究某種生長(zhǎng)限制因子對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響次生物質(zhì)的大量生產(chǎn)

紫杉醇是獲得美國(guó)FDA(1992)認(rèn)證的優(yōu)良抗腫瘤藥物。紅豆杉樹皮中紫杉醇的含量為萬分之二，其在國(guó)際市場(chǎng)上售價(jià)為20萬美元/kg

第34頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)10分，星期五

由懸浮細(xì)胞再生植株的途徑由懸浮細(xì)胞直接形成體細(xì)胞胚先將懸浮細(xì)胞在半固體培養(yǎng)基上誘導(dǎo)形成愈傷組織，然后再由愈傷組織分化植株第35頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)10分，星期五3細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)基3.1懸浮培養(yǎng)對(duì)培養(yǎng)基的要求能用來建立生長(zhǎng)快、易散碎的愈傷組織的培養(yǎng)基，一般也適用于建立該物種的懸浮培養(yǎng)。在活躍生長(zhǎng)的懸浮培養(yǎng)物中，無機(jī)磷酸鹽的消耗很快，不久成為限制因子。

第36頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)10分，星期五Noguchi等(1977)證明，把煙草懸浮培養(yǎng)物保存在一種含有標(biāo)準(zhǔn)的MS無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，培養(yǎng)開始3d之內(nèi)無機(jī)磷酸鹽的濃度就幾乎下降為零，即使把培養(yǎng)基中磷酸鹽的濃度提高到原來的水平的3倍，5d之內(nèi)也會(huì)被細(xì)胞全部用完。高等植物的懸浮培養(yǎng)，B5和ER培養(yǎng)基。第37頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)10分，星期五3.2條件培養(yǎng)基把在液體培養(yǎng)基里培養(yǎng)4～6周的高濃度細(xì)胞濾掉，而用他的培養(yǎng)基制成懸滴或薄層來培養(yǎng)單細(xì)胞或低密度細(xì)胞群體。第38頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)10分，星期五3.3培養(yǎng)基的振蕩防治細(xì)胞缺氧死亡防治大的細(xì)胞團(tuán)的形成第39頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)10分，星期五3.4懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的同步化

同步培養(yǎng)：指在培養(yǎng)中大多數(shù)細(xì)胞都能同時(shí)通過細(xì)胞周期的各個(gè)階段。

應(yīng)用：為了便于研究細(xì)胞分裂和細(xì)胞代謝第40頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)10分，星期五3.4.1物理方法A按細(xì)胞團(tuán)的大小通過對(duì)細(xì)胞物理特性（細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)的大小）的控制，以實(shí)現(xiàn)高度的同步化B低溫休克法通過對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境條件（光照、溫度等）的控制，以實(shí)現(xiàn)高度的同步化第41頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)10分，星期五3.4.2化學(xué)方法A饑餓法先對(duì)細(xì)胞斷絕一種細(xì)胞分裂所必須的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)成分或激素，使細(xì)胞停滯在G1或G2期，經(jīng)過一段時(shí)間的饑餓后，當(dāng)重新在培養(yǎng)基中加入這種限制因子時(shí)，靜止細(xì)胞就會(huì)同步進(jìn)入分裂。第42頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)10分，星期五

細(xì)胞周期（cellcycle)是指細(xì)胞從第一次分裂結(jié)束產(chǎn)生新細(xì)胞到第二次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的全過程，分為間期與分裂期兩個(gè)階段。

間期又分為三期、即DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）與DNA合成后期（G2期）。細(xì)胞分裂期：前期，中期，后期，末期

第43頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)10分，星期五3.4.2化學(xué)方法B抑制法使用DNA合成抑制劑，如5-氨基尿嘧啶、羥基尿和胸腺嘧啶脫氧核苷當(dāng)細(xì)胞受到化學(xué)藥物抑制時(shí)，細(xì)胞周期只能進(jìn)行到G1，細(xì)胞滯留在G1期S期的邊界上。第44頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)10分，星期五4懸浮培養(yǎng)中細(xì)胞生長(zhǎng)量的計(jì)算細(xì)胞計(jì)數(shù)細(xì)胞密實(shí)體積（PCV）5％鉻酸或0.25％果膠酶使懸浮細(xì)胞團(tuán)分散用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行。將體積已知、均勻分散的懸浮液放入一個(gè)15ml的離心管中，3000rpm離心，用每毫升培養(yǎng)液中細(xì)胞總體積的毫升數(shù)表示。細(xì)胞鮮重細(xì)胞干重第45頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)10分，星期五細(xì)胞鮮重：細(xì)胞培養(yǎng)物過濾，洗去培養(yǎng)基，真空抽濾，稱重。細(xì)胞干重：60℃干燥12h，稱重。以每毫升培養(yǎng)物或106個(gè)細(xì)胞的重量表示。第46頁(yè)，共50頁(yè)，2022年，5月20日，