激活轉(zhuǎn)錄因子 Nrf2 對(duì)肝細(xì)胞胰島素抵抗的影響及信號(hào)通路

激活轉(zhuǎn)錄因子Nrf2對(duì)肝細(xì)胞胰島素抵抗的影響及信號(hào)通路〔〕:

摘要：目的轉(zhuǎn)錄因子Nrf2在保護(hù)細(xì)胞對(duì)抗氧化損害時(shí)發(fā)揮重要作用，姜黃提取物〔Curcumin，Cur〕可上調(diào)細(xì)胞抗氧化酶的表達(dá)。本研究擬討論Cur在肝臟細(xì)胞中能否通過(guò)誘導(dǎo)Nrf2核轉(zhuǎn)位發(fā)揮抗氧化作用并進(jìn)而減輕其胰島素抵抗〔Insulinresistance，IR〕。方法人肝細(xì)胞系L02被分成4組，分別正常培養(yǎng)〔Control組〕、與葡萄糖氧化酶〔Glucoseoxidase〕共培養(yǎng)〔GO組〕、與Cur及GO共培養(yǎng)〔Cur+GO組〕、與Wortmannin〔Wor〕和Cur及GO共培養(yǎng)〔Cur+GO+Wor組〕后，分別檢測(cè)細(xì)胞氧化程度、細(xì)胞損害程度、Nrf2核轉(zhuǎn)位狀況及IR程度。結(jié)果GO共培養(yǎng)后顯著增加了人肝細(xì)胞ROS、MDA、LDH及AST濃度，減低了GSH濃度，誘導(dǎo)肝細(xì)胞IR。L02使用Cur預(yù)處理后再與GO共培養(yǎng)可以減低GO引起的肝細(xì)胞損害所致指標(biāo)升高，并能有效減低GO引起細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化及IR，這與Cur產(chǎn)生的促進(jìn)Nrf2核轉(zhuǎn)位效應(yīng)一致。Wor能局部抑制Cur誘導(dǎo)的Nrf2核轉(zhuǎn)位。結(jié)論Cur可以減低ROS導(dǎo)致的人肝細(xì)胞IR，可能是通過(guò)促進(jìn)Nrf2核轉(zhuǎn)位發(fā)揮作用。

關(guān)鍵詞：姜黃提取物；肝細(xì)胞L02；氧化損害；胰島素抵抗

本文引用格式：李強(qiáng),張鼎,師喜云,等.激活轉(zhuǎn)錄因子Nrf2對(duì)肝細(xì)胞胰島素抵抗的影響及信號(hào)通路[J].世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘,2022,19(80):55-57.

EffectofActivatingTranscriptionFactorNrf2onHumanHepatocyteInsulinResistanceandSignalingPathway

LIQiang,ZHANGDing,SHIXi-yun,CHENGYan-hui,WANGBao-jian*

(DepartmentofInternalMedicine,NO.988thHospitalofPLA,ZhengzhouHenan)

ABSTRACT:ObjectiveNrf2isatranscriptionfactorthatplaysacrucialroleinthecellularprotectionagainstoxidativestress.Curcumin(Cur)hasbeenreportedtoupregulatetheexpressionofnumerousreactiveoxygenspecies(ROS)detoxifyinggenesincells.ThisstudywasdesignedtoinvestigatewhetherCurcouldinducedNrf2nucleartranslocationandreduceROS-mediatedinsulinresistance(IR)inculturedhepatocytes.MethodsHumanL02hepatocytesweredividedintofourgroups.CellsinControlgroupwereincubatedwithoutspecial.CellsinGOgroupwereincubatedwithglucoseoxidase(GO).CellsinCur+GOgroupwereincubatedwithGOandCur.CellsinCur+GO+WorgroupwereincubatedwithGO,CurandWortmannin(Wor,PI3Kinhibitor).Thenoxidativestress,cellulardamage,Nrf2nucleartranslocationandinsulinresistanceweremeasured.ResultsGOexposuresigni?cantlyincreasedROS,MDA,LDHandASTlevel,aswellascausingIR.Curpretreatmentsigni?cantlyattenuatedthesedisturbancesinintracellularROS,liverenzymeactivityandsigni?cantlyantagonizedthelipidperoxidation,GSHdepletionandIRinducedbyGOinL02hepatocytes.TheseeffectsparalleledNrf2nucleartranslocationinducedbyCur.WorpartiallyblockedCur-inducedNrf2nucleartranslocation.ConclusionThese?ndingssuggestthatCurcouldreduceROS-mediatedIRinhepatocytes,atleastinpartthroughnucleartranslocationofNrf2.

KEYWORDS:Curcumin;L02hepatocytes;Oxidativestress;Insulinresistance

0引言

氧化應(yīng)激可使肝臟內(nèi)活性氧簇(reactiveoxygenspecies,ROS)增加進(jìn)而導(dǎo)致肝細(xì)胞損害【1】。假設(shè)不能及時(shí)去除這些分子，可能誘導(dǎo)脂質(zhì)過(guò)氧化并誘發(fā)急慢性組織損害、癌變及老化等【2】。肝細(xì)胞可以通過(guò)復(fù)原型谷胱甘肽和異生物代謝酶等對(duì)細(xì)胞內(nèi)氧化劑進(jìn)展清理。核因子E2相關(guān)因子2〔Nrf2〕可以調(diào)節(jié)多種抗氧化酶表達(dá)，其通常以無(wú)活性形式存在于細(xì)胞漿中，承受信號(hào)刺激時(shí)轉(zhuǎn)移至胞核中發(fā)揮作用【3】，在肝臟中Nrf2對(duì)于防御氧化損傷有重要作用，Nrf2基因敲除的小鼠肝臟DNA損害程度明顯升高【4】。IR參與多種肝臟疾病發(fā)病過(guò)程。既往一項(xiàng)研究顯示高濃度的過(guò)氧化氫及其代謝物導(dǎo)致ROS在細(xì)胞內(nèi)蓄積，可導(dǎo)致脂肪細(xì)胞3T3-L1的IR【5】。在高脂肪飲食的小鼠中，人們發(fā)現(xiàn)IR產(chǎn)生之前肝臟中ROS的基因表達(dá)上調(diào)，因此ROS可能是導(dǎo)致高脂肪食物誘發(fā)IR的重要原因【6】。

Cur是傳統(tǒng)草藥姜黃中的效應(yīng)元素，具備抗氧化等多種作用。有研究發(fā)現(xiàn)Cur可以在人單核細(xì)胞中通過(guò)調(diào)控Nrf2增加HO-1的表達(dá)程度【7】。觸發(fā)激酶信號(hào)通路是Nrf2激活的關(guān)鍵步驟，PI3K等信號(hào)通路均參與Nrf2的激活[8]。盡管Cur可以激活轉(zhuǎn)錄因子Nrf2有效調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化復(fù)原平衡，但目前尚不清楚其通過(guò)何種形式影響ROS介導(dǎo)的IR。在本研究中我們將討論在人肝細(xì)胞內(nèi)能否通過(guò)Cur減輕GO誘導(dǎo)的IR。

1材料與方法

1.1材料

人肝細(xì)胞系L02購(gòu)自武漢典型生物保藏中心；胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；Cur購(gòu)自Sigma公司；Wor購(gòu)自CellSignaling公司；Nrf2抗體購(gòu)自Abzoom公司；FITC標(biāo)記的羊抗兔的第二抗體購(gòu)自Abcam公司；胰島素購(gòu)自Sigma公司；超氧化物探針〔DHE〕購(gòu)自碧云天公司；丙二醛〔MDA〕和GSH檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成公司；細(xì)胞蛋白提取試劑盒購(gòu)自APPLYGEN公司；光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡購(gòu)自?shī)W林巴斯公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自bio-rad公司；全自動(dòng)生化分析儀購(gòu)自貝克曼公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)將人肝細(xì)胞系L02在細(xì)胞培養(yǎng)箱中與RPMI1640及15%胎牛血清共培養(yǎng)48h，每個(gè)培養(yǎng)皿中置入5x106個(gè)L02細(xì)胞。Control組細(xì)胞未予特殊處理；GO組培養(yǎng)皿參加含有100U/LGO的培養(yǎng)液孵育2h誘導(dǎo)細(xì)胞氧化損害模型；Cur+GO組培養(yǎng)皿中肝細(xì)胞參加含30MCur〔Cur+GO+Wor組再參加0.1MWor〕孵育12h，后參加含有100U/LGO的培養(yǎng)液孵育2h。細(xì)胞使用PBS洗滌2次，參加含有100nM胰島素〔Sigma公司〕的培養(yǎng)液孵育30min。

1.2.2免疫組化L02置于玻片上生長(zhǎng)48h后，分別將含15及30MCur的培養(yǎng)液參加玻片上干預(yù)6h及12h，局部Cur預(yù)處理后的細(xì)胞參加含0.1M的Wor的培養(yǎng)液干預(yù)12h，之后將標(biāo)本用固定液作用30min，再參加1：100羊多克隆Nrf2抗體作用2h，PBS沖洗5次后再參加1：50FITC標(biāo)記的羊抗兔的第二抗體孵育1h，封片后在熒光顯微鏡下顯像。

1.2.3WesternBlot實(shí)驗(yàn)搜集細(xì)胞用于WesternBlot實(shí)驗(yàn)，按說(shuō)明提取各組細(xì)胞蛋白質(zhì)，將蛋白質(zhì)加載到聚丙烯酰胺上進(jìn)展凝膠及電泳后分別用不同的多克隆抗體〔IR、p-IR、IRS-1、p-IRS-1、JNK、p-JNK〕培養(yǎng)，后進(jìn)展顯色。

1.2.4流式細(xì)胞檢測(cè)各組細(xì)胞收獲并沖洗后與4M的超氧化物探針室溫下避光孵育30min，分別在激發(fā)波長(zhǎng)〔488nm〕及發(fā)射波長(zhǎng)〔525nm〕下使用流式細(xì)胞儀測(cè)定。

1.2.5生化檢測(cè)搜集各組細(xì)胞，分別采用硫代巴比妥酸及微板試劑盒〔南京建成公司〕測(cè)量MDA及GSH程度。搜集各組細(xì)胞培養(yǎng)液使用全自動(dòng)生化分析儀〔貝克曼公司〕檢測(cè)AST、LDH及Glu濃度。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

各組數(shù)據(jù)以s顯示，采用ANOVA分析及q檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)使用SPSS20軟件進(jìn)展分析。Ple;0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組細(xì)胞內(nèi)Nrf2核轉(zhuǎn)位的比擬研究結(jié)果證實(shí)Cur預(yù)處理過(guò)的L02細(xì)胞系內(nèi)Nrf2核轉(zhuǎn)位程度明顯高于Control組。在同等濃度條件下，干預(yù)12h較6h可增加Nrf2核轉(zhuǎn)位。L02細(xì)胞胞漿內(nèi)Nrf2程度未見(jiàn)顯著變化，Wor干預(yù)后明顯抑制了Nrf2核轉(zhuǎn)位〔圖1〕。

提取各組胞漿及胞核中的蛋白質(zhì)進(jìn)展westernblotting實(shí)驗(yàn)，研究結(jié)果顯示W(wǎng)or局部抑制了Cur誘導(dǎo)的Nrf2核轉(zhuǎn)位，然而，細(xì)胞胞漿內(nèi)Nrf2程度與是否承受Cur及Wor干預(yù)無(wú)明顯關(guān)系〔圖2〕。

2.2各組細(xì)胞DHE、GSH、MDA、ALT、LDH及Glu的比擬GO組的Glu濃度較Control組明顯升高，Cur+GO組Glu濃度較GO組明顯降低，Cur+GO+Wor組Glu濃度那么介于GO組和Cur+GO組之間。GO組較Control組DHE、MDA、LDH及AST濃度顯著升高，GSH濃度顯著降低；Cur+GO組DHE、MDA、LDH及AST濃度程度較GO組顯著減低；Cur+GO+Wor組上述指標(biāo)程度介于GO組及Cur+GO組之間〔表1〕。

2.3各組細(xì)胞胰島素抵抗指標(biāo)的比擬參加胰島素干預(yù)后，細(xì)胞內(nèi)IR磷酸化啟動(dòng)。搜集各組細(xì)胞后使用westernblotting檢測(cè)IR及IRS-1程度。GO組較Control組未見(jiàn)明顯IR磷酸化升高，且IR磷酸化程度與Cur及Wor干預(yù)無(wú)明顯關(guān)系；與Control組比擬，GO組IRS-1磷酸化程度顯著降低，Cur+GO組IRS-1明顯升高，Cur+GO+Wor組IRS-1磷酸化程度那么介于GO組和Cur+GO組之間；與Control組比擬，GO組JNK磷酸化程度顯著升高，Cur+GO組JNK較GO組減低，Wor干預(yù)那么局部抑制了Cur減低JNK磷酸化的效應(yīng)〔圖3〕。

3討論

肝臟細(xì)胞常受氧化損害影響，可導(dǎo)致肝功能異常、肝細(xì)胞死亡并影響肝細(xì)胞受損后修復(fù)過(guò)程。因此，肝臟細(xì)胞中嚴(yán)密的氧化復(fù)原調(diào)節(jié)非常重要[9,10]。在本實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)姜黃提取物干預(yù)能促使Nrf2向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移并減輕L02細(xì)胞系氧化所致?lián)p害。同時(shí)我們研究發(fā)現(xiàn)Wor能降低姜黃提取物的這種作用，證明PI3K途徑參與了姜黃提取物誘導(dǎo)的Nrf2核轉(zhuǎn)位。氧化損害及抗氧化劑激活PI3K信號(hào)通路后可以調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白微絲的重排，且肌動(dòng)蛋白的重排破壞了Nrf2-Keap1復(fù)合物，進(jìn)而促進(jìn)Nrf2核轉(zhuǎn)位[11,12]。Wor不但抑制了Nrf2核轉(zhuǎn)位，而且阻礙姜黃提取物發(fā)揮抗氧化及抗IR作用。因此在人肝細(xì)胞系L02中PI3K可能參與了Nrf2核轉(zhuǎn)位。既往研究發(fā)現(xiàn)氧化代謝產(chǎn)物可以抑制下游PI3K-Akt信號(hào)通路[13]。另一項(xiàng)有關(guān)高脂飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠的研究證實(shí)在肝臟及脂肪組織出現(xiàn)IR之前曾發(fā)生過(guò)ROS及氧化損害上調(diào)情況，并且ROS生成可能是高脂肪飲食誘發(fā)IR的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[14]。在本研究中，我們發(fā)如今人肝細(xì)胞系L02中ROS同樣可以誘發(fā)IR，而姜黃提取物干預(yù)可以降低ROS程度進(jìn)而改善IR。

IRS-1和IRS-2激酶磷酸化可以抑制ROS介導(dǎo)的IR[15,16]。前期研究已經(jīng)證實(shí)ROS通過(guò)JNK途徑促進(jìn)IRS-1上Ser307位點(diǎn)磷酸化，進(jìn)而通過(guò)IGF1受體抑制IRS-1上的Tyr608[17]。在本研究中我們證實(shí)ROS激活JNK后抑制了IRS-1的磷酸化程度，而姜黃提取物預(yù)處理過(guò)的肝細(xì)胞內(nèi)ROS程度減低，減少了JNK參與，從而增加IRS-1磷酸化進(jìn)而改善IR。

HO-1在體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)中均能改善IR[18]，Cur能促進(jìn)Nrf2核內(nèi)轉(zhuǎn)移有效上調(diào)HO-1程度[19]。在本研究中我們證實(shí)了Cur同樣可以改善人肝細(xì)胞L02中的IR，分析與Cur能降低L02內(nèi)ROS程度及升高HO-1程度有關(guān)。我們的研究結(jié)果提示Nrf2在減輕L02細(xì)胞系IR過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。因此Nrf2可能成為治療IR的新靶點(diǎn)。通過(guò)Cur等藥物作用激活Nrf2進(jìn)而減輕患者肝臟疾病所致IR可能成為一種新的治療策略。

Cur能改善IR作用已經(jīng)在動(dòng)物模型中得到了證實(shí)[20]，有研究者發(fā)現(xiàn)對(duì)高脂飲食大鼠提供姜黃提取物后其IR明顯減輕[21]。然而目前尚缺乏姜黃提取物對(duì)人類(lèi)IR有無(wú)影響的報(bào)導(dǎo)。我們的研究結(jié)果提示姜黃提取物可以促進(jìn)Nrf2向核內(nèi)轉(zhuǎn)移進(jìn)而調(diào)節(jié)氧化損害及IR，并且證明在人L02細(xì)胞系中姜黃提取物可以通過(guò)調(diào)節(jié)Nrf2向胞核轉(zhuǎn)移改善ROS誘發(fā)的IR。鑒于很多水果和蔬菜中姜黃提取物含量較高，食用富含姜黃提取物的食物可能成為改善肝臟疾病的氧化損害及IR有效手段。此外，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明有效激活Nrf2可能成為預(yù)防及治療代謝綜合癥患者的IR的探究方向。

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