禽流感病毒檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

禽流感病毒檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展［關(guān)鍵詞］禽流感病毒；檢測(cè)技術(shù)；禽流行性感冒病毒簡(jiǎn)稱禽流感病毒(AIV)，屬于正粘病毒科、流感病毒屬。流感病毒根據(jù)可溶性抗原不同可分為A、B、３型，只有A型(AIV)易變異［1］，并可在禽、人、豬、馬和海洋哺乳動(dòng)物中爆發(fā)流行，出現(xiàn)輕度呼吸疾病到嚴(yán)重?cái)⊙Y等。1878年AIV在意大利首次爆發(fā)，其后在英、法、德等歐洲國家和美國均有流行。高致病性AIVH5N1于1997年在香港致6人死亡，2022～2022年在亞洲致4人死亡，2022年H7N7在荷蘭致１人死亡［2］。AIV給人類安康已帶來嚴(yán)重威脅，引起全球的極大關(guān)注，AIV檢測(cè)技術(shù)也隨之成為人們研究的熱點(diǎn)?，F(xiàn)就近年來AIV檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展作一綜述。1病原學(xué)檢測(cè)雞胚別離培養(yǎng)是檢測(cè)病禽組織中AIV的一種經(jīng)典、準(zhǔn)確、敏感的病原學(xué)診斷方法，可以作為金標(biāo)準(zhǔn)，特異性和敏感度均可以到達(dá)100%［2］。2血清學(xué)檢測(cè)21病毒中和試驗(yàn)〔NT〕作為經(jīng)典方法，病毒中和實(shí)驗(yàn)操作繁瑣、耗時(shí)、費(fèi)料，臨床幾乎不用。22血凝〔HA〕和血凝抑制〔HI〕試驗(yàn)AIV可以與雞紅細(xì)胞發(fā)生凝集現(xiàn)象，這種紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象又可被特異性免疫血清所抑制，即紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)。血凝和血凝抑制試驗(yàn)可以鑒定病毒、檢測(cè)血清中的抗體程度。用抗不同血凝素的抗血清，由血凝抑制試驗(yàn)來確定HA亞型。23神經(jīng)氨酸酶抑制〔NI〕試驗(yàn)微量神經(jīng)氨酸酶〔NA〕抑制劑抑制NA的活性，并以半抑制濃度I50鑒定NA亞型。Hurt等［3］用5g的抗病毒藥物zanaivir建立的熒光NI試驗(yàn)，檢測(cè)陽性樣本H1N1、H1N2，符合率分別為N1955%，N2897%，平均935%〔187/200〕。該方法本錢低，適于大規(guī)模地應(yīng)用。24瓊脂凝膠擴(kuò)散試驗(yàn)〔AGP〕用于檢測(cè)AIV共同抗原核蛋白或基質(zhì)蛋白。由于所有的AIV都具有型特異性共同抗原，用一種AIV的抗原或抗血清就可對(duì)所有AIV的抗體或抗原進(jìn)展鑒定。免疫雙向擴(kuò)散及免疫電泳中以沉淀線斷定可以定性，免疫單輻射擴(kuò)散試驗(yàn)可以定量。25免疫熒光技術(shù)(IFT)將抗原或抗體標(biāo)記上熒光素，再進(jìn)展抗原抗體反響。最早用于流感病毒是鑒定和定位病毒感染細(xì)胞中特異性的抗原、核蛋白(NP)或基質(zhì)蛋白(P)抗原。用NP抗原的熒光抗體染色，主要出現(xiàn)核內(nèi)熒光；用P抗原的熒光抗體主要出現(xiàn)胞質(zhì)熒光，核內(nèi)也可出現(xiàn)局部熒光。26酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)運(yùn)用ELISA原理建立的AIV檢測(cè)方法較多，如用單克隆抗體介導(dǎo)的、經(jīng)生物素一親和素系統(tǒng)放大的H5亞型禽流感病毒捕獲ELISA檢測(cè)方法，為進(jìn)一步研究檢測(cè)試劑盒提供根底［4］。AIV抗體膠體金檢測(cè)試紙條那么是膠體金免疫層析分析法，用純化病毒與膠體金顆粒偶聯(lián)，吸附在玻璃纖維上制作而成，不需要其他試劑,一步完成,反響時(shí)間只需要幾分鐘(5～10in)，是一種檢測(cè)微量AIV抗體快速、簡(jiǎn)便的方法［5］。鄭其升等［6］用基因工程重組HA蛋白作為抗原建立了檢測(cè)AIV抗體的間接ELISA方法，可以檢測(cè)H3、H5、H7、H9亞型血清，特異性高，與傳統(tǒng)HI方法比擬，符合率為971%〔774/807〕?；谥亟MHA蛋白的間接ELISA方法可望用于AIV的保護(hù)性抗體程度檢測(cè)。3單鏈構(gòu)型多態(tài)性(SSP)作為檢測(cè)基因變異的手段已得到廣泛應(yīng)用，其原理是單個(gè)核苷酸的置換引起DNA單鏈構(gòu)象改變,在非變性電泳中足以導(dǎo)致泳動(dòng)率變化。Quint等［7］用高通量SSP與限制性片段長(zhǎng)度多性〔RFLP〕分析法對(duì)照，檢測(cè)了近50株流感病毒的400多個(gè)基因片段，符合率為98%。4核酸擴(kuò)增方法41RTPR基于P、NP基因的高度保守區(qū)的引物，RTPR可以鑒定AIV［810］。Lee等［9］在此根底上針對(duì)H1～H15又分別設(shè)計(jì)了15對(duì)HA基因的特異性引物，同時(shí)進(jìn)展15管RTPR，可以檢測(cè)H1H15的HA亞型，該法所測(cè)80株病毒樣品，與血清學(xué)方法符合率為100%。但單管單測(cè)，操作繁瑣。Phipps等［11］建立了相對(duì)簡(jiǎn)便的RTPR的AIV檢測(cè)法，僅用一對(duì)引物擴(kuò)增出H1～H15的HA2基因，產(chǎn)物由雙脫氧核酸鏈中止法測(cè)序分析，盲測(cè)12株標(biāo)準(zhǔn)病毒和30株樣品病毒，并與HI對(duì)照，完全相符。為進(jìn)步擴(kuò)增的靈敏度和特異性，也可采用巢式或半巢式RTPR［8］。42多重RTPR(RTPR)RTRR是在RTPR根底之上實(shí)現(xiàn)單管多檢的相對(duì)快速和經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)方法。alik等［12］建立的RTPR方法，檢測(cè)3種不同的鳥類呼吸道病毒，與單管單檢RTPR方法結(jié)果完全相符。Yaada等［13］建立了包括5對(duì)引物的RTPR體系，可鑒別5種亞型AIV。BellauPujl等［14］運(yùn)用多重半巢式RTPR可以檢測(cè)包括AIV的12種呼吸道RNA病毒，使檢測(cè)范圍進(jìn)一步擴(kuò)展，其203個(gè)樣本與培養(yǎng)方法及直接免疫熒光法對(duì)照，綜合敏感度為98%。43RealtieRTPR(RRTPR)運(yùn)用特異性的熒光水解探針的RRTPR方法可使檢測(cè)時(shí)間縮短為4h［10，15］。Lee等［10］建立的檢測(cè)H5、H7亞型AIV的RRTPR方法，與傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法比擬，并以EiD50〔50%雞胚致病指數(shù)〕為評(píng)價(jià)指標(biāo)，呈正相關(guān)〔r=0972〕，T檢驗(yàn)無顯著差異〔P021〕。其重復(fù)性試驗(yàn)呈正相關(guān)〔r=0902〕，靈敏度H5為1fg或10２RNA拷貝，H7為10-1fg或10RNA拷貝，所測(cè)病毒濃度均低于1010EID50，該靈敏度高于培養(yǎng)方法。44依賴核酸序列的擴(kuò)增〔NASBA〕NASBA是一種快速、等溫的RNA擴(kuò)增技術(shù)，整個(gè)反響有賴于AV逆轉(zhuǎn)錄酶、T7RNA多聚酶和核酸酶H(RNaseH)共同協(xié)作而完成，不需特殊儀器，不需溫度循環(huán)，是以轉(zhuǎn)錄為根底，單鏈核苷酸的連續(xù)擴(kuò)增，其反響產(chǎn)物是單鏈RNA。擴(kuò)增產(chǎn)物與磁珠上的捕捉探針及釕標(biāo)記的電化學(xué)發(fā)光寡核苷酸探針雜交后，形成復(fù)合物，經(jīng)NuliSens閱讀器直接檢測(cè)電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度［1617］。llins等［16］檢測(cè)了亞歐地區(qū)H5亞型AIV，同時(shí)還鑒別出高致病及低致病H5亞型。Lau等［17］建立的NASBA技術(shù)可以檢測(cè)H1～H15亞型的AIV，并能區(qū)分出H5及H7亞型，整個(gè)過程從核酸別離、擴(kuò)增、檢測(cè)在6h以內(nèi)，靈敏度與雞胚培養(yǎng)相當(dāng)。45環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增〔lpediatedistheralaplifiatin,LAP〕Pn等［18］介紹了一種新的更加簡(jiǎn)便的擴(kuò)增方法，即環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增,特異性地針對(duì)6個(gè)獨(dú)立的結(jié)合位點(diǎn)設(shè)計(jì)兩對(duì)引物擴(kuò)增，以看家基因或外源性RNA分子作為陽性對(duì)照。由于反響中產(chǎn)生大量焦磷酸鎂，可以肉眼判斷結(jié)果，無需凝膠電泳。作者用該方法檢測(cè)了SARS病毒后，又檢測(cè)了H1～H3的AIV，與常規(guī)方法比擬符合率為100%。5基因芯片將RTPR獲得的DNA固化于芯片，利用核酸探針技術(shù)構(gòu)建的檢測(cè)流感病毒A、B及其亞型的芯片平臺(tái)，y3、y5標(biāo)記的核酸探針與靶DNA雜交，可以進(jìn)一步鑒別混合體系中擴(kuò)增產(chǎn)物。Li等［19］用DNA芯片及RTPR對(duì)流感病毒進(jìn)展檢測(cè)及分型，結(jié)果顯示DNA芯片為基于PR的診斷技術(shù)提供了補(bǔ)充，因?yàn)榛赑R的方法，直接從DNA擴(kuò)增片段大小缺乏以證明是目的產(chǎn)物。王秀榮等［20］根據(jù)蛋白進(jìn)展基因型別鑒定和HA基因亞型鑒定，用y5熒光標(biāo)記，在基因芯片平臺(tái)上構(gòu)建檢測(cè)H5、H7、H9亞型禽流感病毒(AIV)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)模型，檢測(cè)AIV的DNA，雜交到達(dá)預(yù)期結(jié)果。Kessler等［21］考慮到三維芯片潛在的優(yōu)勢(shì)〔因其增加了幾何面積，使反響效率進(jìn)步，同時(shí)動(dòng)態(tài)的流質(zhì)也使雜交時(shí)間縮短〕，將芯片技術(shù)進(jìn)一步改良，建立了檢測(cè)流感病毒A、B的三維芯片平臺(tái)，通過比擬實(shí)驗(yàn)，選擇了特異性強(qiáng)的隨機(jī)RTPR擴(kuò)增方法，和低背景的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法，檢測(cè)了AIV〔H1N1、H1N2、H3N2、H5N1〕和流感病毒B，特異性好，全部檢測(cè)過程不超過5h。6展望病毒別離培養(yǎng)和血凝抑制試驗(yàn)經(jīng)常作為評(píng)價(jià)新的檢測(cè)AIV方法的對(duì)照，但病毒別離培養(yǎng)耗時(shí)長(zhǎng)，至少需7d，不利于快速診斷，病毒別離的實(shí)驗(yàn)條件要求較高，同時(shí)有高致病性的危險(xiǎn)，對(duì)毒株的檢測(cè)及管理上要嚴(yán)格考慮生物平安措施。AIV在雞胚培養(yǎng)過程中還可能發(fā)生發(fā)生變異［22］。血凝及血凝抑制試驗(yàn)特異性好，但其操作相對(duì)繁瑣，同時(shí)必須具備一定血凝效價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)病毒和新穎制備的紅細(xì)胞。血清學(xué)檢查對(duì)最后確診有回憶性診斷價(jià)值，一般只能在發(fā)病23周甚至更長(zhǎng)時(shí)間才能有抗體陽性出現(xiàn)［17］。由于AIV血清型眾多，新的變異株不斷出現(xiàn)，制備血清型特異性單克隆抗體相對(duì)困難，且在各種免疫接種的情況下，血凝抑制試驗(yàn)等血清學(xué)診斷方法也會(huì)失去作用。核酸擴(kuò)增技術(shù)〔NAT〕檢測(cè)AIV，選擇好靶基因和引物及優(yōu)化反響參數(shù)，均可獲得高靈敏度和特異性［23］。對(duì)于血清型眾多的AIV，不同亞型致病性不同，宿主分布不同，故快速、特異地分型在AIV診斷中顯得尤為重要，而當(dāng)前的核酸擴(kuò)增技術(shù)尚不能高通量地鑒別出所有HA或NA的亞型。RTPR方法可以獲得所有AIV的HA亞型，但最終結(jié)果尚需借助測(cè)序方法［10］，不能作為常規(guī)檢測(cè)手段。要實(shí)現(xiàn)高通量、大規(guī)模的檢測(cè)，有望借助生物芯片這項(xiàng)技術(shù)。生物芯片正逐步應(yīng)用于細(xì)菌及病毒的檢測(cè)，它不僅能克制PR擴(kuò)增技術(shù)中難題，對(duì)PR擴(kuò)增技術(shù)還能起到補(bǔ)充作用［19］。目前人們針對(duì)病毒，甚至AIV檢測(cè)芯片不斷優(yōu)化雜交條件；將核酸擴(kuò)增產(chǎn)物片段化，以減少核酸二、三級(jí)構(gòu)造效應(yīng)對(duì)雜交的影響；以及對(duì)芯片載體構(gòu)造和檢測(cè)方法進(jìn)展改良，都為建立快速、靈敏、特異的AIV檢測(cè)方法提供平臺(tái)［21］。［參考文獻(xiàn)］［1］ZABNThepathgenesisfinfluenzainhuans［J］.RevedVirl，2001，11:227241［2］STNEB,BURRSJ,SHEPETIUKS,etalRapiddetetinandsiultaneussubtypedifferentiatinfinfluenzaAvirusesbyrealtiePR［J］.JVirlethds，2022，117：103112［3］HURTA,BARRIG,KADINAN,etalAnveleansfidentifyingtheneurainidasetypefurrentlyirulatinghuanA(H1)influenzaviruses［J］.VirusRes，2022，103：7983［4］王傳彬，田新生，曹振，等H5亞型禽流感病毒單抗一生物素捕獲ELISA的建立［J］.中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2022，l2〔4〕：204207［5］林志雄,田純見,朱道中,等.GIA檢測(cè)高致病性禽流感抗體方法的建立［J］.2022,15(2)：1214［6］鄭其升，劉華雷，張曉勇，等H9N2亞型AIVHA基因的原核表達(dá)及間接ELISA方法的建立［J］.中國病毒學(xué)，2022，20(3)：293297［7］QUINTJD,ANGK.Ahighthrughputsinglestrandednfratinplyrphisassayfrdetetin,subtypingandgentypingfinfluenzaviruses［J］.InternatinalngressSeries，2022，1263：653657［8］STARIKE,RERBERDRFERA，ERNERTypeandsubtypespeifiRTPRassaysfravianinfluenzaAviruses(AIV)［J］.JVetedInfetDisVetPubliHealth,2000，47〔4〕：295301［9］LEES,HANGP,SHIENJH,etalIdentifiatinandsubtypingfavianinfluenzavirusesbyreversetransriptinPR［J］.JVirlethds，2001，97：1322［10］LEE,SUAREZDLAppliatinfrealtieRTPRfrthequantitatinandpetitiverepliatinstudyfH5andH7subtypeavianinfluenzavirus［J］.JVirlethds，2022，119：151158［11］PHIPPSLP,ESSENS,BRNIHGenetisubtypingfinfluenzaAvirusesusingRTPRithasinglesetfpriersbasednnservedsequenesithintheHA2dingregin［J］.JVirlethds,2022,122：119122［12］ALIKYS,PATNAYAKDP,GYALS.Detetinfthreeavianrespiratryvirusesbysingletubeultiplexreversetransriptinplyerasehainreatinassay［J］.JVetDiagnInvest,2022，16(3):244248［13］YAADAA,LAL,TAJSTypingandsubtypingfinfluenzavirusesandrespiratrysynytialvirusesbyultiplexRTPR［J］.InternatinalngressSeries,2022,1263:381385［14］BELLAUPUJLS,VABRETA,LEGRANDL,etalDevelpentfthreeultiplexRTPRassaysfrthedetetinf12respiratryRNAviruses［J］.JVirlethds,2022,126：5363［15］STNEAB,BURRSJ,SHEPETIUKS,etalRapiddetetinandsiultaneussubtypedifferentiatinfinfluenzaAvirusesbyrealtiePR［J］.JVirlethds,2022，117：103112［16］LLINSRA,KLS,SKL,etalDetetinfhighlypathgeniandlpathgeniavianinfluenzasubtypeH5(Eurasianlineage)usingNASBA［J］.JVirlethds,2002,103:213225［17］LAULT,BANKSJ,AHERNER,etalNulEiaidsequenebasedaplifiatinethdstdetetavianinfluenzavirus［J］.BiheiBiphysiResun，2022，313：336342［18］PNLL,LEUNGS,