法醫(yī)物證學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

法醫(yī)物證學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)法醫(yī)物證學(xué)教研室2009年編寫(xiě)實(shí)驗(yàn)須知一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康蘑俜ㄡt(yī)物證檢驗(yàn)是法醫(yī)學(xué)鑒定工作中的一項(xiàng)不可缺少的重要內(nèi)容，在掌握了收集、采取和送驗(yàn)物證的基礎(chǔ)上，進(jìn)行物證檢驗(yàn)，以達(dá)到鑒定的目的。②學(xué)習(xí)物證檢驗(yàn)的基本操作(Basicoperation)技術(shù)和研究方法(Researchmethods),為今后從事法醫(yī)工作打下良好的基礎(chǔ)。③培養(yǎng)學(xué)生科學(xué)的思維方法和實(shí)事求是的工作作風(fēng)，防止主觀主義，草率從事。二、實(shí)驗(yàn)要求①實(shí)驗(yàn)前必須先預(yù)習(xí)，做到胸中有數(shù)，才能有條不紊的做好實(shí)驗(yàn)，獲得較好的結(jié)果。預(yù)習(xí)的重點(diǎn)在于：實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、?shí)驗(yàn)原理。實(shí)驗(yàn)的主要步驟及實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)特別注意的問(wèn)題。并計(jì)劃好實(shí)驗(yàn)儀器及大致的時(shí)間分配，做到有計(jì)劃。有步驟地做實(shí)驗(yàn)。②實(shí)驗(yàn)中要求操作正規(guī)，取試劑要準(zhǔn)確。仔細(xì)觀察實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，如實(shí)記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。養(yǎng)成認(rèn)真細(xì)致，實(shí)事求是的科學(xué)態(tài)度，并聯(lián)系有關(guān)理論進(jìn)行分析，提出正確結(jié)論，寫(xiě)好實(shí)驗(yàn)報(bào)告。三、實(shí)驗(yàn)程序①準(zhǔn)備工作⑴實(shí)驗(yàn)前要預(yù)習(xí)，做到胸中有數(shù)。(2)清點(diǎn)實(shí)驗(yàn)儀器(Instruments)和藥品(Drug),如有短缺應(yīng)報(bào)告教師補(bǔ)給。⑶清理實(shí)驗(yàn)桌面，有秩序地放好儀器和藥品，實(shí)驗(yàn)中不用的書(shū)籍雜物不要放在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上。②實(shí)驗(yàn)操作⑴按指定的編組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)時(shí)按講義規(guī)定的順序，用正規(guī)的操作方法進(jìn)行操作。⑵如實(shí)驗(yàn)中需使用多種不同試劑時(shí)，注意分清各自的滴管?？潭任芗霸嚬艿?，各試劑的瓶塞滴管均不能混錯(cuò)，以免污染試劑。⑶在試驗(yàn)過(guò)程中，不能直接用手接觸檢材，以免污染。(4)每次實(shí)驗(yàn)均要寫(xiě)實(shí)驗(yàn)報(bào)告，并于當(dāng)天交給指導(dǎo)教師評(píng)閱記分，作為平時(shí)成績(jī)。③實(shí)驗(yàn)后的清理實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，應(yīng)將試劑瓶，公用吸管等排列整齊，未用完的抗血清應(yīng)用膠布或膠塞封好瓶后，立即放回冰箱，將所用的儀器。玻璃器皿等洗凈收好，整理桌面。值日生應(yīng)負(fù)責(zé)打掃實(shí)驗(yàn)室，離開(kāi)實(shí)驗(yàn)室之前要檢查水、電、門、窗、是否關(guān)好。四、實(shí)驗(yàn)室規(guī)則①遵守課堂紀(jì)律，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)禁止抽煙吃零食，不許打鬧，保持安靜。不遲到，不無(wú)故缺課。②愛(ài)護(hù)儀器。盡量避免損壞，精密儀器必須在教師指導(dǎo)下嚴(yán)格按操作規(guī)程使用。節(jié)約使用抗血清等試劑及水電。③廢液可倒入水槽(Gutter)并放水沖走，固體廢物(包括血凝塊(Includebloodclot))切勿倒入水槽，以免阻塞下水道。④儀器(Instrument)如有破損，應(yīng)如實(shí)報(bào)告教師，填寫(xiě)破損登記表后補(bǔ)領(lǐng)。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)一切物品，未經(jīng)教師同意不攜出室外。⑤保護(hù)好實(shí)驗(yàn)臺(tái)，防止強(qiáng)酸(Strongacid),強(qiáng)堿(Strongbase)和高溫物品損壞臺(tái)面，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，必須時(shí)刻注意安全，以免發(fā)生意外。⑥學(xué)生實(shí)驗(yàn)中損壞的實(shí)驗(yàn)器皿(Experimentalcontainers)應(yīng)折價(jià)賠償。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告的書(shū)寫(xiě)格式㈠實(shí)驗(yàn)名稱(Nameoftheexperiment)㈡實(shí)驗(yàn)H的(Purposeoftheexperiment)㈢實(shí)驗(yàn)原理(Experimentalprinciple)㈣實(shí)驗(yàn)儀器(Experimentalapparatus)㈤實(shí)驗(yàn)試劑(Reagents)伉)操作步驟(Steps)(-t)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(Experimentresults)(A)分析討論(Analysisdiscussion)W實(shí)驗(yàn)者及實(shí)驗(yàn)日期第一篇 玻璃儀器(Glasswareinstrument)的洗滌和使用實(shí)驗(yàn)?zāi)康?練習(xí)和掌握玻璃儀器(Glasswareinstrument)的洗滌方法。.復(fù)習(xí)吸管(Sucker)的使用。講解、示教㈠玻璃儀器(Glasswareinstrument)的洗滌1.洗滌劑(Detergent)①肥皂水，去污劑(洗衣粉)為乳化劑，可降低油水之間的表面張力，使脂肪、蛋白質(zhì)及其他污物溶解或脫落。常用于敞口的器皿及酶學(xué)檢查所用器皿的洗滌。②堇銘酸鉀(KChO,-H2sO,清潔液)配制：配制的方法：KzCmO7先溶于50ml水中，將500ml的H2sO,慢慢倒入KzCnCh溶液中洗滌時(shí)，主要是KzCrO?和H2s起作用，反應(yīng)式如下：K2Cr2O7+4H2SO4-K2SO4+Cr2(SO4)2+4H?O+3⑼所產(chǎn)生的3分子[0],其氧化力很高，另外H2sO’也能使很多物質(zhì)溶解下來(lái)。③Na3Po4一般配成5%的Na3PCM堿性)，可清洗油污。@乙二胺四乙酸二納(EDTA-Na?)為一絡(luò)合劑，可使玻璃器皿(Glassware)上的金屬離子以絡(luò)合物的形式脫離下來(lái)。一般配成5—10%的濃度。⑤鹽酸 酒精(Hydrochloricacid——Alcohol)用于去除器皿上的染料，一般配成3%的濃度。⑥其他硝酸：用于去除水銀。王水：用于洗去所有金屬鹽。尿素：用于清洗蛋白質(zhì)。實(shí)驗(yàn)中最常用的是⑴、⑵兩種。2.玻璃儀器(Glasswareinstrument)的洗滌①?般玻璃儀器(Glasswareinstrument)如試管(Testtube)、燒杯(Beaker)、錐形瓶(Erlenmeyerflask)等容量要求不嚴(yán)格的器皿。先用自來(lái)水洗刷至無(wú)污物，再選用大小合適的毛刷沾取洗衣粉或肥皂水，將器皿內(nèi)外壁細(xì)心刷洗，再用自來(lái)水沖洗干凈，洗至容器內(nèi)壁光潔不掛水珠即可，最后用蒸播水沖洗2—3次，放于清洗處待水滴干后，放入烤箱內(nèi)(100—125℃)烤干，?？竞蟛灰⒓创蜷_(kāi)烤箱門，防止溫差造成玻璃器皿(Glassware)的爆炸。②容量分析儀器(Capacityoftheinstruments)如吸量管(Pipette)、滴定管(Burette)。量瓶等。使用后立即浸泡于涼水，勿使物質(zhì)干涸，并及時(shí)用流水沖洗干凈，然后再用重鋁酸鉀(PotassiumDichromate)清洗液浸泡數(shù)小時(shí)，用自來(lái)水反復(fù)沖洗干凈，最后用蒸儲(chǔ)水沖洗2—3次，涼干或放入37C孵箱中干燥(移液管(One-markpipette)、容量瓶(Measuringflask)及結(jié)構(gòu)復(fù)雜的器皿嚴(yán)禁烤干)。③沉降管沉降管使用后應(yīng)用吸管逐管沖洗，然后每管內(nèi)加入清潔液(不要有氣泡)，24小時(shí)后逐管吸出清潔液，放回清潔槽(或瓶)內(nèi)，再用自來(lái)水、蒸儲(chǔ)水沖洗沉降管，甩干水份，放入烤箱內(nèi)烤干。㈡吸管的種類和使用：.種類(1)移液管(大肚吸管)(One-markpipette)屬單標(biāo)吸管，放液時(shí)管尖的殘余液體不得吹出。(2)奧氏吸量管屬單標(biāo)吸管，放液時(shí)管尖的殘余液體必須吹出至容器內(nèi)。(3)多刻度吸量管①普通吸量管：直筒狀，有多種不同規(guī)格，刻度方法有自上而下和自下而上兩種，每種刻度法又有刻度到尖端和刻度不到尖端兩種?？潭鹊郊舛苏撸褂脮r(shí)必須把管尖殘留液體吹入容器內(nèi)(一般注有“吹”字)，刻度不到尖端者，管尖殘留液體不要吹出。當(dāng)液體不再流出時(shí),應(yīng)將管尖在容器內(nèi)壁上停15—30分秒，同時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)吸量管。②莫氏吸量管：總量刻度在尖端以上，放液體時(shí)按刻度進(jìn)行。.吸量管的使用(復(fù)習(xí))㈢離心機(jī)(Centrifuge)的使用(復(fù)習(xí)).離心機(jī)(Centrifuge)的種類。.離心機(jī)(Centrifbge)的使用方法。.離心機(jī)(Centrifuge)使用的注意事項(xiàng)。第二篇 血型檢驗(yàn)(Bloodtest)一、新鮮血液紅細(xì)胞血型測(cè)定(Determinationofbloodtypefreshblood)(-)ABO血型測(cè)定(ThetestofABObloodgroup)實(shí)驗(yàn)?zāi)康蘑僬莆誂BO血型(ABObloodgroup)測(cè)定方法。②掌握紅細(xì)胞混懸液(Erythrocytesuspensions)的制備方法。③熟悉紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象(Erythrocyteagglutination),能根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確判定血型(Bloodgroup)o實(shí)驗(yàn)原理正常人類紅細(xì)胞表面含彳/ABO型抗原(ABOantigens),而血清(Serum)中含有其相應(yīng)的抗體(Antibody)。采用標(biāo)準(zhǔn)抗A、抗B血清和標(biāo)準(zhǔn)A型、B型紅細(xì)胞來(lái)與待測(cè)的血液紅細(xì)胞或血清(Serum)作用，觀察是否有凝集反應(yīng)(Agglutination)出現(xiàn)，而判斷血型(Bloodgroup)。用標(biāo)準(zhǔn)抗血清檢驗(yàn)紅細(xì)胞的抗原(Antigen)為正定型。用標(biāo)準(zhǔn)A型和B型紅細(xì)胞檢測(cè)血清中的抗體為反定型。在實(shí)際工作中將兩者結(jié)果相互對(duì)照以便獲得準(zhǔn)確的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)儀器白瓷板、試管(Testtube)、試管架(Testtubeholder)、離心機(jī)(Centrifuge)、顯微鏡、刺血針、消毒用品、滴管、玻璃鉛筆、天平(Balance)。實(shí)驗(yàn)試劑.標(biāo)準(zhǔn)抗A及抗B血清。.生理鹽水。操作方法.紅細(xì)胞混懸液(Erythrocytesuspensions)的制備⑴取生理鹽水約2ml放入小試管內(nèi)。(2)用酒精(Alcohol)棉球消毒手指，待酒精(Alcohol)蒸發(fā)干后，用消毒針頭刺入適當(dāng)深度，即有血液流出，然后用滴管取3滴血放入裝有生理鹽水的試管內(nèi)，混勻。⑶在天平上配平，即另取一小試管盛水，作平衡管。在天平上平衡。然后把試管放入離心機(jī)中相對(duì)應(yīng)的位置上，以2000rpm的速度離心一分鐘棄去上清液，這樣反復(fù)洗滌三次后。棄去上清液。(4)取1滴壓積紅細(xì)胞(Hematocritredbloodcells),加49滴生理鹽水，配成2%的紅細(xì)胞混懸液(Erythrocytesuspensions),或取1滴壓積紅細(xì)胞(Hematocritredbloodcells),加99滴生理鹽水，配成1%的紅細(xì)胞混懸液(Erythrocytesuspensions)?.ABO型血型(ABObloodgroup)正定型 凝集原測(cè)定(Agglutinationoftheoriginaldetermination)A.試管法(Tubemethod)(1)取二支試管分別標(biāo)明“A”、“B”。⑵按標(biāo)記分別加入抗A、抗B血清各1滴。(3)分別加入2%的被測(cè)紅細(xì)胞懸液(Erythrocytesuspensions)1滴。(4)混勻，以lOOOrpm的速度離心1分鐘。⑸輕搖試管，使管底沉降的紅細(xì)胞懸浮，觀察并記錄結(jié)果。如陰性結(jié)果室溫中靜置30分鐘，再離心觀察結(jié)果。B.玻片法(Slidemethod)(1)在玻片兩端分別標(biāo)明“A”、"B”字樣。⑵按標(biāo)記分別加標(biāo)準(zhǔn)抗A、抗B血清各一滴。(3)各加?滴被檢2%紅細(xì)胞懸液(Erythrocytesuspensions)--滴。(4)室溫下應(yīng)左右旋轉(zhuǎn)玻片，使之混勻：靜置15分鐘后，轉(zhuǎn)動(dòng)玻片觀察結(jié)果，必要時(shí)可用顯微鏡核對(duì)。C.結(jié)果判定出現(xiàn)凝集塊者為陽(yáng)性；反之不出現(xiàn)凝集塊則為陰性。凝集強(qiáng)弱的標(biāo)準(zhǔn)：++++呈一個(gè)大凝集塊，無(wú)游離的紅細(xì)胞，背景清亮。+++凝集塊稍小，有小量游離紅細(xì)胞，背景仍較清亮。++凝集塊更小，有1/2的游離紅細(xì)胞，背景較紅。+凝集塊呈細(xì)小沙粒狀，游離紅細(xì)胞更多，背景紅。ABO血型結(jié)果判定——正定型抗A抗B血型判定——0+—A—+B++AB.AB0血型反定型一一凝集素的測(cè)定⑴試管法(Tubemethod).取二支試管，分別標(biāo)明“A”、“B”。.分別加入2滴被測(cè)的人血清。.加1滴2%A型標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞于A管中，力U1滴2%B型標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞于B管中。.混勻，以1000轉(zhuǎn)/分的速度離心1分鐘。.輕搖，觀察結(jié)果。⑵結(jié)果判定ABO血型判定一一反定型A型RBCB型RBC血型判定++0—+A+—B——AB⑶注意事項(xiàng)①陰性結(jié)果可在室溫中靜置30分鐘，離心觀察結(jié)果。②一般不用玻片法作ABO反定型，因?yàn)檠逯械目笰、抗B抗體與標(biāo)記紅細(xì)胞作用,若不經(jīng)離心，難以形成肉眼可見(jiàn)的凝集反應(yīng)。㈡MN血型測(cè)定實(shí)驗(yàn)原理正常人類紅細(xì)胞表面含有MN血型系統(tǒng)的抗原，用免疫制得的抗M,抗N血清與待測(cè)血液的紅細(xì)胞作用，觀察是否有凝集反應(yīng)由現(xiàn)而判斷血型。實(shí)驗(yàn)儀器同ABO型測(cè)定。實(shí)驗(yàn)試劑.標(biāo)準(zhǔn)抗M,抗N血清。.生理鹽水。操作方法.試管法(Tubemethod)(1)取二支試管，分別標(biāo)明“M”、“N”。⑵按標(biāo)記，分別將抗M和抗N血清各一滴加入“M”和“N”管中。(3)在兩管中各加2%被測(cè)紅細(xì)胞混懸液(Erythrocytesuspensions"滴?；靹蚝笠?000轉(zhuǎn)/分離心1分鐘。(4)離心后，輕輕搖動(dòng)，觀察結(jié)果。.玻片法①取一凹玻板，分別在兩端標(biāo)明“M”和“N”孔。②在兩端各加抗M、抗N血清2滴。③于“M"、"N”孔中分別加入1%被檢紅細(xì)胞混懸液(Erythrocytesuspensions/滴。④左右旋轉(zhuǎn)混勻，置室溫(Roomtemperature)下10分鐘內(nèi)觀察結(jié)果。.結(jié)果判定抗M抗N血型判定+——M—+N++MN㈢Rh血型測(cè)定(DeterminationofRhbloodgroup)實(shí)驗(yàn)原理Rh血型抗體(Rhbloodgroupantibodies)多是不完全抗體(Incompleteantibody).用不完全抗體(Incompleteantibody)來(lái)檢測(cè)Rh血型抗原(Rhbloodgroupantigens)由于IgG分子量小，在生理鹽水介質(zhì)中不能使相應(yīng)的RBC直接發(fā)生可見(jiàn)的凝集反應(yīng)(Agglutination),只能使具有相應(yīng)抗原的RBC致敏。因此，需要用清蛋白試驗(yàn)，酶法(Enzymatic)或抗人球蛋白試驗(yàn)(coombstest)進(jìn)行測(cè)定，實(shí)驗(yàn)原理分述如下：清蛋白試驗(yàn)(Albumintest)的原理：清蛋白能提高介質(zhì)的介電常數(shù)，使動(dòng)電位減少，即降低電動(dòng)勢(shì)。從而使紅細(xì)胞易于靠攏而促使RBC在抗體的作用下發(fā)生可見(jiàn)的凝集反應(yīng)。酶法(Enzymatic)的原理：由于紅細(xì)胞膜表面涎酸的竣基(-C00H)族電離后，使紅細(xì)胞表面帶上負(fù)電荷，從而使RBC不易與不完全抗體(Incompleteantibody)發(fā)生凝集反應(yīng)(Agglutination)?若用蛋白水解隨Protease(如無(wú)花果酶，番木瓜酶。菠蘿蛋白酶。胰蛋白酶或神經(jīng)氨酸酶等)處理RBC,使紅細(xì)胞膜上的涎酸殘其釋放，則RBC表面的負(fù)電荷減少，動(dòng)電位也減少。從而縮短了紅細(xì)胞的間距，使紅細(xì)胞能與不完全抗體發(fā)生可見(jiàn)的凝集反應(yīng)?？谷饲虻鞍自囼?yàn)(coombstest)的原理：由于血型抗體本身是球蛋白，具有抗原性，它可以作為抗原來(lái)免疫動(dòng)物而使之產(chǎn)生抗人球蛋白抗體(Anti-humanglobulinantibodies),在已被抗體完全致敏的紅細(xì)胞中再加入抗人球蛋白抗體(Anti-humanglobulinantibodies)后，抗人球蛋白抗體(Anti-humanglobulinantibodies)即與吸附于RBC上的不完全抗體(Incompleteantibody)發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，尤如起一種搭橋的作用，使致敏的紅細(xì)胞出現(xiàn)可見(jiàn)的凝集反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)儀器離心機(jī)、顯微鏡、試管、試管架、記號(hào)筆、天平、37℃恒溫水箱。實(shí)驗(yàn)試劑.標(biāo)準(zhǔn)抗D、抗E、抗C、抗e、抗c血清。.抗人球蛋白(Coombs)血清。3.1%菠蘿蛋白酶液(Thepineappleproteinaseliquid)?4.30%清蛋白液。5.生理鹽水。操作方法.清蛋白試驗(yàn)(Albumintest)①取五只試管，分別標(biāo)記上D、C、c、E、e字樣，按標(biāo)記分別加相應(yīng)的抗D,抗C,抗c,抗E,抗e,血清各2滴。②每管各加待測(cè)血紅細(xì)胞懸液(Erythrocytesuspensions)1滴。③混勻后，以lOOOrpm,離心1,觀察是否出現(xiàn)凝集反應(yīng)。④未出現(xiàn)凝集反應(yīng)者，則每管各加2滴30%清蛋白，混勻，再次以lOOOrpm離心1分鐘。取出試管，輕搖，觀察并記錄結(jié)果，出現(xiàn)凝集現(xiàn)象者為陽(yáng)性反應(yīng)。⑤根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果判斷出被測(cè)血之Rh血型。.酶法①取五只試管，分別標(biāo)記上D、C、c、E、e按標(biāo)記分別加相應(yīng)的抗D、抗C、抗c、抗E、抗e血清各2滴。②每管各加待測(cè)血紅細(xì)胞懸液(Erythrocytesuspensions”滴。③混勻后，立即離心lOOOrpml分鐘，觀察并記錄結(jié)果。④未出現(xiàn)凝集反應(yīng)者，則每管各加配好的1%菠蘿蛋白酶液一滴，混勻后，置37C恒溫水箱內(nèi)放30分鐘.⑤取出試管，以lOOOrpm離心1分鐘，觀察并記錄結(jié)果。出現(xiàn)凝集現(xiàn)象為陽(yáng)性反應(yīng)。陽(yáng)性結(jié)果表明被測(cè)紅細(xì)胞上含有與抗體相應(yīng)的抗原。.抗人球蛋白試管(Coombstest)①取五只試管，分別標(biāo)記上D、C、c、E、eo按標(biāo)記分別加相應(yīng)的抗D、抗C、抗c、抗E、抗e血清各2滴。各管再加入一滴待測(cè)的紅細(xì)胞懸液(Erythrocytesuspensions).混勻。②以lOOOrmp離心1分鐘觀察有無(wú)凝集反應(yīng)。③未出現(xiàn)凝集反應(yīng)，則將試管置37c水箱內(nèi)放30分鐘.④再以lOOOrpm離心1分鐘，觀察有無(wú)凝集。⑤無(wú)凝集者，則用鹽水將試管內(nèi)的紅細(xì)胞離心洗滌3次。盡量棄去上清液，目的在于去除尚未結(jié)合在紅細(xì)胞上的不完全抗體。⑥各管加入抗人球蛋白2滴，混勻以lOOOrpm離心1分鐘，輕搖試管，觀察并記錄結(jié)果，出現(xiàn)凝集者為陽(yáng)性反應(yīng)。陽(yáng)性結(jié)果表明被測(cè)紅細(xì)胞上含有與抗體相應(yīng)的抗原。二、唾液分泌狀態(tài)測(cè)定實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)和掌握和用中和試驗(yàn)(凝集抑制試驗(yàn))測(cè)定唾液分泌狀態(tài)的實(shí)驗(yàn)原理和操作方法。實(shí)驗(yàn)原理分泌型(Secretetype)人的唾液中含有與其紅細(xì)胞ABO血型一致的水溶性血型物質(zhì)。HAB血型物質(zhì)能特異地與標(biāo)準(zhǔn)抗血清中相應(yīng)的抗體結(jié)合，一旦抗體被結(jié)合后，該血清就不能再使相應(yīng)的紅細(xì)胞發(fā)生凝集，將唾液與標(biāo)準(zhǔn)抗血清作用后，再加入相應(yīng)的指示紅細(xì)胞，然后觀察紅細(xì)胞是否出現(xiàn)凝集反應(yīng)，從而判斷被檢者的分泌狀態(tài)及ABO血型。如所加指示紅細(xì)胞不出現(xiàn)凝集，則為中和試驗(yàn)陽(yáng)性，說(shuō)明被檢者為分泌型，如加入指示紅細(xì)胞后，仍出現(xiàn)凝集,則為中和試驗(yàn)陰性，被檢者為非分泌型。實(shí)驗(yàn)儀器試管、試管架、滴管、記號(hào)筆、離心機(jī)、燒杯。實(shí)驗(yàn)試劑.標(biāo)準(zhǔn)抗一A、抗一B血清和抗一H試劑。.已知2%A型、B型、0型紅細(xì)胞生理鹽水懸液。.生理鹽水。.待測(cè)的唾液標(biāo)本。操作方法.抗血清(Serumresistance)的標(biāo)定(1)取24只康氏試管，分為三排，每排8只，分別標(biāo)記上A、B、H,每管加2滴生理鹽水，按標(biāo)記分別將2滴抗一A、抗一B血清及抗一H試劑加入每排第一管中，作2—倍數(shù)系列稀釋，最后一管棄去2滴，其稀釋倍數(shù)為1:256。⑵每管加1滴相應(yīng)的指示紅細(xì)胞混懸液(Erythrocytesuspensions)混勻，A、B、H三排放入離心機(jī)，以lOOOrpm離心1分鐘，觀察結(jié)果，記錄抗血清效價(jià)。⑶以凝集反應(yīng)強(qiáng)度為++的最后一管的倍數(shù)稀釋抗血清，此稀釋液與相應(yīng)指示紅細(xì)胞發(fā)生的凝集反應(yīng)為說(shuō)明抗血清的標(biāo)定和稀釋是正確的，這樣方可用于作中和試驗(yàn)。.唾液的采集和處理(1)唾液的采集：先囑被檢者嗽口后，使其流涎入大口玻璃瓶?jī)?nèi)，收集2-5ml,如要采集嬰兒或幼兒唾液，可叫其喝水后，以棉球擦其口腔底部，直至被唾液濕透，然后將濕棉花的唾液擠出，用同一棉球反復(fù)幾次，便可取得足量。⑵唾液的處理：唾液收集好后，立即在沸水中煮10分鐘，使唾液中的血型分解酶滅活然后離心10分鐘，1500rpm,取上清液備用。.中和試驗(yàn)(Neutralizationtest)(1)唾液的稀釋取30只試管，分為三排，每排10只，分別標(biāo)記上A、B和H與1-10的序號(hào)，用生理鹽水將待測(cè)唾標(biāo)本作2-4倍數(shù)系列稀釋，共稀釋三排，每排的稀釋倍數(shù)為1:2—1:1024。(2)中和A排每管分別加2滴稀釋好的抗一A血清。B排每管分別加2滴稀釋好的抗一B血清。H排每管分別加2滴稀釋好的抗一H試劑。室溫下放置30分鐘，使唾液中所含的血型物質(zhì)充分中和血清中的相應(yīng)抗體。⑶加指示紅細(xì)胞A排各管加1滴2%A型紅細(xì)胞懸液，混勻。B排各管加1滴2%B型紅細(xì)胞懸液，混勻。H排各管加1滴2%O型紅細(xì)胞懸液，混勻。A、B、H、三排加入指示紅細(xì)胞后，放到離心機(jī)上離心，lOOOrpm離心1分鐘，讀結(jié)果。(4)結(jié)果判斷不出現(xiàn)凝集反應(yīng)者為中和試驗(yàn)陽(yáng)性，被連續(xù)抑制3管以上者，可確定唾液中含有相應(yīng)抗原。唾液稀釋倍數(shù)2481632641282565121024結(jié)果判定A+++-H-BH++++++++++++-H-H-+-H-+++4-H-++-H-++-H4--I-H--H--4-H-A分泌型AB-H-H--H-H-4-H-+-H-+++-H-++-H-十-HH-++-H--H-B分泌型H++++-HH-4-H-ABH-H-H-卜+++-H-H--H-H-++++-F-H-l-+++++++-HH-+-H-+-H--H-4--H-+++++-H-++-H-+-H-++++-H--H-O分泌型A+++++-H-B+++++++AB分泌H+-++++-H-型三、人類白細(xì)胞抗原(HLA)的分型(HLA、A、B)位點(diǎn)實(shí)驗(yàn)原理用微量淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn)法(Tracelymphocytespoisoningexperimentmethod|)。被檢活淋巴細(xì)胞膜上的HLA抗原遇相應(yīng)的HLA抗體可與之相結(jié)合(致敏)，在補(bǔ)體存在的情況下，可以破壞細(xì)胞膜。經(jīng)過(guò)染色，使染料進(jìn)入細(xì)胞而著色。在鏡下計(jì)算著色細(xì)胞百分?jǐn)?shù),達(dá)一定標(biāo)準(zhǔn)以上，認(rèn)為是陽(yáng)性反應(yīng)(存在相應(yīng)的抗原)。實(shí)驗(yàn)器材大試管、小試管、小量筒、特制小玻璃套管、注射器、重復(fù)微量加樣器、微量淋巴細(xì)胞毒反應(yīng)板。白細(xì)胞計(jì)數(shù)盤、顯微鏡、離心機(jī)、毛細(xì)吸管。實(shí)驗(yàn)試劑(1)肝素鈉抗凝液(Heparinsodiumanticoagulationliquid)肝素鈉用生理鹽水溶解，使每毫升液體含肝素鈉200單位，經(jīng)9磅15分鐘的高壓消毒，冰箱保存?zhèn)溆?。⑵PBS原液氯化鈉216克，磷酸二氫鈉6克、氯化鉀7克、磷酸氫二鈉(2分子水)32.6克(若用1分子水的則用65.5克)。蒸儲(chǔ)水加至1000ml,經(jīng)9磅15分鐘高壓消毒，冰箱保存?zhèn)溆谩Ｊ褂孟♂屢喝≡?0m1,加蒸鏘水至1000ml。(3)淋巴細(xì)胞分離液(Thelymphocyteseparationfluid)有市售比重為L(zhǎng)077±0.002(18℃)的淋巴細(xì)胞分離液，也可用以下藥品配制：泛影酸5.77g、葡甲胺183g,加蒸馀水至1000ml,調(diào)PH至7.0—7.2。菲可很icoll水溶性聚蔗糖)9g,加蒸儲(chǔ)水溶解，調(diào)比重至1.020(20℃)。取1體積泛影酸、葡甲胺液加2.4體積菲可液，調(diào)比重至1.077(18℃),經(jīng)高壓消毒后保存冰箱備用。(4)淋巴細(xì)胞保養(yǎng)液(Lymphocytemaintainsfluid)10.5gRPMI1640(小行血清培養(yǎng)基)加雙儲(chǔ)水至1000ml,分裝后保存于-20C。(5)白細(xì)胞計(jì)數(shù)稀釋液(DilutionsWBCcount)1.5%醋酸溶液(含少許甲紫)。(6)5%曙紅田0$畝)水溶液(7)中性Formalin液，0.5%酸紅0.4ml加入福爾馬林100ml中(8)補(bǔ)體6支以上兔新鮮血清，應(yīng)無(wú)天然淋巴細(xì)胞毒，且補(bǔ)體活性良好。(9)HLA分型標(biāo)準(zhǔn)血清盤(10)抗淋巴細(xì)胞血清(Antilymphocyteserum)用人淋巴細(xì)胞免疫兔制得。(1D石蠟油(醫(yī)用)淋巴細(xì)胞的準(zhǔn)備(Lymphocytesofpreparation)(1)抗凝血的制備：取一試管盛大1.5ml肝素抗凝液，抽取被檢查者靜脈血液3ml,加入抗凝劑中，輕輕倒置試管，使其混勻。⑵加等量的PBS稀釋抗凝血。(3)取二試管，每管裝2ml與抗凝血比例為1:1.5的淋巴細(xì)胞分離液，將試管微傾斜，把稀釋了的抗凝血小心地加于液面上(注意不要與分離液混合)。放入不平式離心機(jī)離心(1800轉(zhuǎn)/分)20分鐘(20℃)但注意在啟動(dòng)及關(guān)機(jī)時(shí)動(dòng)作避免粗暴。(4)離心后，血液成份被分成數(shù)層，如下圖。用毛細(xì)吸管把血漿及血小板層液體吸出棄去。小心地把淋巴細(xì)胞層(呈白色)混濁)吸至另一盛有數(shù)毫升PBS或淋巴細(xì)胞保養(yǎng)液的試管中(吸出時(shí)注意不要吸取棕多的分離液，因它含有單核細(xì)胞，其比例過(guò)大時(shí)會(huì)干擾試驗(yàn)結(jié)果。⑸混勻后，作第二次離心(1200轉(zhuǎn)/分)離心10分鐘后，棄去上清液，輕搖試管使細(xì)胞懸浮，再加入適量的PBS或保養(yǎng)液，混勻后作第三次離心，(900轉(zhuǎn)/分)，離心8分鐘，小心地把上清液棄去后，加適量的(0.2ml)淋巴細(xì)胞保養(yǎng)液(Lymphocytemaintainsfluid),并使細(xì)胞混勻。(6)淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)：取白細(xì)胞計(jì)數(shù)稀釋液0.78ml于小試管內(nèi)，加入淋巴細(xì)胞液0.02ml,混勻后，吸出少量滴入血細(xì)胞計(jì)數(shù)盤內(nèi)。靜置1-2分鐘后，于低倍鏡下計(jì)算計(jì)數(shù)盤上下左右四大格中淋巴細(xì)胞數(shù)，按下列公式計(jì)算：NX100=細(xì)胞數(shù)/I微升N=四大格細(xì)胞總數(shù)根據(jù)細(xì)胞數(shù)的量，用保養(yǎng)液調(diào)至每微升含淋巴細(xì)胞2000個(gè)。把此細(xì)胞懸液保存于4℃冰箱中備用。HLA抗血清反應(yīng)板的準(zhǔn)備(HLAresistanceofserumreactionplatepreparations)⑴微量淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn)反應(yīng)板一塊(具72個(gè)凹孔，在兩邊上鑄記有標(biāo)記，如圖，并附有蓋玻片和板蓋各一塊)。ABCDE1OOOOOO2OOOOOO3OOOOOO4OOOOOO5OOOOOO6OOOOOO70OOOOO80OOOOO90OOOOO10OO0OOO11OO0OOO12OO0OOO圖二⑵在反應(yīng)板上每個(gè)凹孔中加石臘1小滴。⑶根據(jù)需要用微量加樣器將抗HLA血清加入反應(yīng)板(1A1B凹除外)的各凹孔中，每凹加抗血清1微升。1A孔加入1微升與手中已知HLA型標(biāo)準(zhǔn)淋細(xì)胞相對(duì)應(yīng)的抗淋巴細(xì)胞血清作陽(yáng)性反應(yīng)對(duì)照孔，1B孔加入1微升PBS或保養(yǎng)液作陰性對(duì)照孔。(反應(yīng)板中各抗血清的種類附表于后)。微量淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn)(Tracelymphocytespoisoningexperiment)(1)取血清反應(yīng)板一塊(制備過(guò)程見(jiàn)上項(xiàng))。（2）用微量重復(fù)加樣器把分離計(jì)數(shù)好淋巴細(xì)胞懸液按順序（1A-lFf2Ff2Af3A—3Ff……）加入反應(yīng)板的每凹中。每凹加入1微升（含淋巴細(xì)胞2000個(gè)），要注意加入凹孔血清中。在室溫（20-25℃）入置30分鐘，讓細(xì)胞與抗血清充分作用。⑶于反應(yīng)板的各凹加入補(bǔ)體（兔血清）5微升，放置1小時(shí)（20—25℃。（4）于反應(yīng)板的各凹內(nèi)分別加入5%曙紅3毫升，3分鐘后，再加入中性甲醛（新配）5毫升（中性甲醛使反應(yīng)終止并起固定的作用）。⑸蓋上蓋玻片，加上蓋板，靜止2小時(shí)，使細(xì)胞集于凹底，便于觀察（制成的板，在1一2周內(nèi)觀察，結(jié)果不變）。（6）結(jié)果判定：將反應(yīng)板放在顯微鏡的載物臺(tái)上，對(duì)好凹孔，每凹孔底部的全部細(xì)胞能在一低倍（10X10）視野內(nèi)觀察到。觀察次序與加樣順序相同，記錄結(jié)果（見(jiàn)附表）。根據(jù)凹內(nèi)死亡與活的細(xì)胞比例，判定陽(yáng)性或陰性。①死活細(xì)胞的區(qū)別：電光源顯微鏡觀察。死細(xì)胞呈淺紅色，體積大。不折光，平坦，邊界模糊。活細(xì)胞呈小球狀，有強(qiáng)折光，發(fā)亮，體積正常，不染色。觀察時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)調(diào)旋鈕，死活細(xì)胞易于區(qū)分。倒置相差顯微鏡觀察：死細(xì)胞呈煤球狀，灰黑色，體積略大而扁平。活細(xì)胞呈環(huán)狀一圈或呈指環(huán)狀，紅亮。②根據(jù)細(xì)胞死亡的百分?jǐn)?shù)，要用記分法來(lái)判定結(jié)果：死亡細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)記分結(jié)果判定0-101陰性11-202陰性可疑21-404弱陰性41-806陽(yáng)性81-100注意事項(xiàng)8強(qiáng)陽(yáng)性⑴抗血清：選擇效價(jià)高的，交叉反應(yīng)少，無(wú)脂肪及雜質(zhì)的抗血清，否則會(huì)干擾結(jié)果。⑵補(bǔ)體：要選擇無(wú)天然細(xì)胞毒性作用，補(bǔ)體活性好的,一般要將多只兔血清混勻后使用。⑶試驗(yàn)的反應(yīng)時(shí)間：可視抗體及補(bǔ)體的情況而增減，加有許多抗血清的反應(yīng)與反應(yīng)時(shí)間有很大關(guān)系，如反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，則會(huì)出現(xiàn)交叉反映，時(shí)間恰好，則顯示其特異性有特點(diǎn)或交叉反應(yīng)減至最低程度，不會(huì)出現(xiàn)干擾。如反應(yīng)時(shí)間過(guò)短，弱抗體的作用顯示不出來(lái)，陽(yáng)性變?yōu)殛幮?。?）反應(yīng)的溫度：整個(gè)操作過(guò)程均應(yīng)于20—25℃下進(jìn)行。高于25℃,則淋巴細(xì)胞易死亡,低于15C時(shí)因抗血清中的冷抗體干擾結(jié)果，出現(xiàn)陽(yáng)性。⑸淋巴細(xì)胞的純度及數(shù)量：?jiǎn)魏思?xì)胞的污染率高時(shí)易致假陽(yáng)性。血小板數(shù)過(guò)大時(shí)，會(huì)大量吸附抗體出現(xiàn)假陰性。紅細(xì)胞污染時(shí)會(huì)增加活細(xì)胞數(shù)量（低倍鏡下無(wú)法區(qū)分）。同時(shí)會(huì)吸附補(bǔ)體使其活性下降。細(xì)胞數(shù)量的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)為1000—2000個(gè)/微升。細(xì)胞懸液中死細(xì)胞不能超過(guò)

10%。(6)中性甲醛的PH要準(zhǔn)確，量也要夠，否則會(huì)增加死細(xì)胞的數(shù)量。⑺加樣時(shí)盡量不要把前一凹的材料帶至后凹去，更不應(yīng)漏加，否則結(jié)果不準(zhǔn)確。附表：表中提到的抗血清是根據(jù)現(xiàn)有的數(shù)量而設(shè)計(jì)安排的，在不同凹孔中的相同的抗血清是來(lái)自不同的人或不同批量的血清。檢測(cè)結(jié)果，被檢測(cè)人是Al、AU、B8、B170管號(hào)抗血清種類結(jié)果管號(hào)抗血清種類結(jié)果管號(hào)抗血清種類結(jié)果1A陽(yáng)性對(duì)照85AA28+AW3319AB5+18+BW351B陰性對(duì)照1BAW331BB5+18+BW351CA18CAW331CBW351DA18DB71DB88EA18EB71EB88FA21FB7+401FB1212FA216FB7+40110FB121EA21EB7+401EB121DA2+A281DB7+401DB151CA2+A281CB13+401CB151BA2+A281BB13+401BB151AAll8AB13+401AB513AAll87AB13+40111ABW161BAll8BB131BBW161CA11+A38CB131CBW161DA11+A38DBW601DB178EA31EBW601EB178FA31FBW601FB17+B584FA918FB5112FB51EA91EB51EB271DA91DB51DBW221CA101CB7+271CBW221BA101BB7+BW351BBW221AAW30+311AB7+BW351ABW221四、血清型(Serotype)的電泳檢測(cè)㈠結(jié)合珠蛋白(Hp)表現(xiàn)型的測(cè)定——園盤電泳法實(shí)驗(yàn)?zāi)康蘑耪莆针娪?Electrophoresis)的概念、基本原理以及分類。⑵掌握HP表現(xiàn)型測(cè)定的原理，基本操作步驟，結(jié)果測(cè)定。(3)學(xué)會(huì)使用園盤電泳槽(Electrophoresischamber)=⑷了解配制凝膠(jelly)的方法。電泳的理論基礎(chǔ)：概念：生物大分子(蛋白質(zhì)、核酸、多糖等)在一定的離子強(qiáng)度和電場(chǎng)的強(qiáng)度下，沿著與其所帶電荷相反的方向泳動(dòng)的過(guò)程。其遷移率與分子量大小、所帶電荷多少、PH值等等有關(guān)。分類：(1)按照電泳槽形式：分水平電泳和垂直電泳(2)按照電泳原理分：移動(dòng)界面電泳、區(qū)帶電泳和穩(wěn)態(tài)電泳(3)按照電泳系統(tǒng)均?性：連續(xù)電泳和不連續(xù)電泳(4)按照電泳凝膠中是否加入變性劑：變性電泳和非變性電泳電泳操作流程：樣品的制備、*電泳 ?染色 *電泳 ?染色 ?結(jié)果的判斷利用聚丙烯胺凝膠作電泳支持物，帶有電荷和分子大小不一的蛋白通過(guò)濃縮效應(yīng)、電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)而被精細(xì)分離，可將血清分為12—25個(gè)組分，結(jié)合珠旦白具有特殊的分帶。HP—Hb復(fù)合物各電泳區(qū)帶可用顯色劑——聯(lián)苯胺(或鄰聯(lián)茴香胺)顯示，讀出其表現(xiàn)型。實(shí)驗(yàn)儀器電泳儀、園盤電泳槽、凝膠管、凝膠管架、腰穿針、微量進(jìn)樣器(20ul)、滴管燒杯(25ml、50ml)、刻度吸管(2ml、10ml)、洗耳球。實(shí)驗(yàn)試劑(1) 23.3%丙烯酰胺溶液(23.3%單體母液)丙烯酰胺22.8g -?加蒸儲(chǔ)水至100ml(或Cyanogm23.3g加蒸儲(chǔ)水至100ml)亞甲基雙丙烯酰胺0.5g」(2)凝膠緩沖液PH=8.8三羥甲基氨基甲烷(Tris)0.057g。乙二胺四乙酸(EDTA)1.17g。⑶10%過(guò)硫酸胺(APS)50mgAPS加蒸儲(chǔ)水至5ml。(4)5%蔗糖液⑸電極緩沖液：硼酸緩沖母液PH=9硼酸2.45g、硼砂15.25g、加儲(chǔ)水至500mL臨用時(shí)，取母液90ml,加蒸儲(chǔ)水至1440ml或取母液18ml,加蒸儲(chǔ)水至288ml。(6)配聯(lián)苯胺用醋酸緩沖液PH=4.5無(wú)水醋酸鈉16.48]?加蒸儲(chǔ)水至1000ml冰醋酸11.6ml -⑺聯(lián)苯胺染色液聯(lián)苯胺0.2g ]甲醇15ml 4存于棕色瓶中4℃冰箱保存，臨用時(shí)取50ml,加30%“過(guò)氧化氫”醋酸緩沖液200m#0.1ml約四滴(8)加速劑：四甲基乙二胺(TEMED)用原液Hb溶液配制①取新鮮抗凝血數(shù)毫升，加入4倍體積的生理鹽水，以3000rpm的速度離心10分鐘，洗滌四次。②于洗好的壓積血球中加入等體積蒸偏水和1/2體積的甲苯搖勻后，放入冰箱過(guò)夜，使之完全溶血。然后以3000rpm的速度離心15分鐘，用棉花吸去上層甲苯，用滴管插至管底吸取Hb液，用濾紙過(guò)濾后，放入4℃冰箱備用(此液可保存1個(gè)月)。操作方法.凝膠柱制備按凝膠管根數(shù)來(lái)計(jì)算試劑需要量試劑需要量凝膠管根數(shù)16812蒸儲(chǔ)水(ml)1.06.08.012.0Tris-EDTA(ml)0.171.01.362.0423.3單位母液(ml)0.53.04.06.010%APS(pl)20.83125.0166.64249.96TEMED(gl)0.834.986.849.96混勻后，立即用滴管沿管壁緩慢加入凝膠管直至凝膠管高度7cm處，然后立即加入雙蒸水于膠面上約0.5cm高，使兩間有一清晰界面。室溫放置30—60分鐘，使凝膠聚合。.樣品準(zhǔn)備

（1）被檢血清樣品取血清一滴，力口2滴5%的蔗糖水溶液，用牙簽蘸取50%的Hb液體加于血清中，混合使成櫻紅色為止，置室溫10分鐘使形成Hp—Hb復(fù)合物。（2）血痕的處理血痕檢材0.25—1cm（不少于0.25cm2）剪細(xì)放入試管中，力口5%蔗糖溶液lOOul。?周內(nèi)的血痕4'C冰箱中浸泡3小時(shí)。超過(guò)一周的血痕4℃冰箱過(guò)夜或浸泡2天，然后充分?jǐn)嚢?，盡力將檢材中的液體擠出，除去檢材殘?jiān)?，力?503氯仿振搖2分鐘后以3000rpm的速度離心15分鐘，可見(jiàn)試管中內(nèi)容物分為三層:下層為氯仿層，上層為血痕液層，兩層之間為薄薄一層的紅棕色Hb,這是多余的或變性Hb,收集上層即含彳了HP-Hb復(fù)合物的液體備用，如上層液體還混濁，須作第二次離心。3加樣⑴倒去凝膠柱上端的蒸儲(chǔ)水，用濾紙吸去管墊周圍的蒸播水，觀察凝膠柱內(nèi)有無(wú)氣泡,凝膠面是否平整，有氣泡或表面不平者都不能使用。⑵將合格的凝膠管插入電泳槽各孔，下槽先裝電極緩沖液至槽高的3/4處，」二槽放在下槽上，先用滴管把電極緩沖液加滿凝膠管（不能有氣泡產(chǎn)生），再把電極緩沖液加入上槽，使液面高于凝膠管1-2cm。⑶用微量進(jìn)樣器將樣品（血清樣品加20ul,血痕液全部）小心地加到凝膠柱表面，蓋好上槽的蓋子，上槽接負(fù)極，下槽接正極。.電泳電泳需在2mA/每管及4c或室溫條件下進(jìn)行的，按所加樣的凝膠管數(shù)調(diào)整電流強(qiáng)度，恒電流，當(dāng)游離的Hb帶距凝膠管下端1cm時(shí)，停止電泳。電泳時(shí)間約2—3小時(shí)。.染色（1）顯色原理因?yàn)镠P為結(jié)合珠旦白，可結(jié)合Hb,利用Hb有過(guò)氧化物酶作用，可使過(guò)氧化氫釋放出新生態(tài)氧，后者使聯(lián)苯胺（無(wú)色）氧化成聯(lián)苯胺蘭（蘭色）如圖所示：HbH2O2?[O]聯(lián)苯胺 ?聯(lián)苯胺蘭⑵操作電泳后取出凝膠管，用腰穿針沿管壁周圍注射自來(lái)水，同時(shí)慢慢旋轉(zhuǎn)凝膠管，推針前進(jìn),使凝膠與管壁分開(kāi)，抽出針頭即可將凝膠一并帶出。將凝膠柱放入聯(lián)苯胺染色液中染色，約10分鐘左右，即顯示出明顯的帶。顏色初為蘭色,約2—3小時(shí)后，變?yōu)樽厣?，顯色后的凝膠柱可放入蒸儲(chǔ)水保存或透射光直接照相。結(jié)果判定，，b A1—1 2—1 2—2圖三Hpl-l型：只有一?條寬譜帶，遷移速度最快，緊靠清蛋白。Hp2—2型：由數(shù)條譜帶組成，遷移速度最慢。Hp2—1型：是Hpl—1型與Hp2—2型的混合型，具有1—1和2—2兩型譜帶，只是譜帶的位置和強(qiáng)度有所不同。注意事項(xiàng)（1）丙烯酰胺不能配制時(shí)間過(guò)久，應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用，時(shí)久失效，不能分出譜帶。⑵過(guò)梳酸胺應(yīng)保持干燥，不能受潮。⑶凝膠柱不能有氣泡。表面應(yīng)十分平整，因?yàn)橹鶅?nèi)有氣泡會(huì)影響電流通過(guò)，而表面不平整，則譜帶不直。（4）加樣時(shí)，針尖不能觸及膠面，并且應(yīng)緩慢將樣品平鋪于凝膠表面，不要振動(dòng)，否則會(huì)影響電泳譜帶的清晰度。⑸電泳開(kāi)始時(shí)，電流有下降的趨勢(shì)，約半小時(shí)后，又有所上升，需不斷調(diào)整，保持恒定的電流強(qiáng)度。㈡Gc表現(xiàn)型的測(cè)定——園盤電脈法實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆誈c表現(xiàn)型的測(cè)定原理，操作步驟及結(jié)果判定。實(shí)驗(yàn)原理利用聚丙烯酰胺凝膠作電泳支持物，具有一定電荷和分子大小不一的血清旦白通過(guò)濃縮效應(yīng)，電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)而被精細(xì)地分離，能將血清旦白分出12—25個(gè)組分，Gc型具有特殊的分帶，用染色劑染色，可顯示出Gc型各帶。實(shí)驗(yàn)儀器同HP表現(xiàn)型測(cè)定實(shí)驗(yàn)試劑（1）電極緩沖液：pH=8.29三羥甲基氨基甲烷(Tris)10.75g乙二胺四乙酸：鈉(EDTA?Na2)0.937g\加蒸儲(chǔ)水至1000ml硼酸5.04g J(2)5.5%凝膠液丙烯酰胺5.36g ]?加入電極緩沖液至100ml雙丙烯酰胺0.14g」⑶催化劑2%過(guò)硫酸鉉。(4)蔗糖溟酚藍(lán)混合液蔗糖60g、0.01%澳酚藍(lán)100ml、溶解蔗糖。⑸染色劑①0.1%氨基黑染液氨基黑0.1g,加在10%冰醋酸溶液中溶解。②0.25%考馬斯亮蘭G250染色液考馬斯亮蘭G2500.5g,溶丁90ml乙醇中，再加冰醋酸10ml,臨用時(shí)用蒸儲(chǔ)水稀釋二倍。(6)固定液12.5%三氯醋酸操作方法.凝膠柱的制備取下列試劑混合之：(此為16管量)。.5%凝膠液50mL過(guò)硫酸錢20ml。TEMED5011L然后用滴管加入凝膠管內(nèi)，方法同Hp型測(cè)定。.加樣(1)樣品準(zhǔn)備取被檢血清2滴于凹玻板內(nèi)，用細(xì)玻棒或竹簽沾取1%溟酚蘭少許，與血清混勻，使之成天蘭色即可使用(澳酚蘭主要是在電泳時(shí)起示蹤的作用，便于觀察血清樣品在電泳時(shí)遷移的位置)。⑵加樣用微量進(jìn)樣器分別吸取各份準(zhǔn)備好的樣品20U1-30U1,小心地加到凝膠柱上面之界面處。.電泳在3mA/每管及4℃冰箱的條件下進(jìn)行電泳，穩(wěn)定電流強(qiáng)度，電泳120分鐘(或待溟藍(lán)指示帶移至距管端約0.5—1cm處時(shí))停止電泳。.固定染色、脫色

取出凝膠管，用腰穿針剝離凝膠柱，方法同HP測(cè)定。將膠柱放入裝有10%三氯醋酸液的容器中固定30分鐘，棄去固定液，用蒸福水沖洗兩次凝膠柱。將凝膠柱放入裝有0.1%氨基黑染液的容器內(nèi)，置60—80℃的熱水浴中染色30分鐘。或用0.25%考馬斯亮壬G250浸泡凝膠柱12—24小時(shí)。然后棄去染液，用10%冰醋酸脫色至譜帶清晰為止（在此期間一般需要更換脫色液2—3次）。結(jié)果判定+Gc2-1圖四轉(zhuǎn)鐵蛋白帶白蛋白帶結(jié)果判定+Gc2-1圖四轉(zhuǎn)鐵蛋白帶白蛋白帶如圖所示：在白蛋白帶與轉(zhuǎn)鐵蛋白帶之間的幾條帶為Gc帶。Gel-1型：靠近白蛋白帶的一條快帶。GC2-2型：靠近轉(zhuǎn)鐵蛋白帶的一條慢帶。Gc2—1型：為Gel-1和Gc2-2的混合型，具有和2—2兩型譜帶。注意事項(xiàng)同HP型。㈢Ge表現(xiàn)型的測(cè)定——垂直平板電泳實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆掌錅y(cè)定原理，了解操作步驟和結(jié)果判定。實(shí)驗(yàn)原理同Ge型園盤電泳。實(shí)驗(yàn)儀器電泳儀、垂直板狀電泳槽、滴管、刻度吸量管(10ml、1ml、5ml)微量進(jìn)樣器(20U1)、燒杯、洗耳球。實(shí)驗(yàn)試劑⑴丙烯酰胺凝膠貯備液丙烯酰胺28g ]700ml雙蒸水，過(guò)濾后存放在棕色瓶中(不超過(guò)一個(gè)月)甲叉雙丙烯酰胺0.75g?⑵凝膠緩沖液a.分離膠緩沖液Tris：18.17；濃HCL：2.2ml溶于100ml雙蒸水中，調(diào)至PH=8。b.濃縮膠緩沖液Tris：6.06g；濃HCL：3.0ml,溶于100ml雙蒸水中,調(diào)至PH=6.3。⑶電極緩沖液(貯備液)Tris：3.0g；甘氨酸：14.4g,溶于1000ml雙蒸水，調(diào)至PH=8.3,臨用前1:10稀釋一工作液。⑷10%過(guò)硫酸胺液過(guò)硫酸胺(PAS)lg,溶于10ml雙蒸水中(現(xiàn)配現(xiàn)用)。(5)1%瓊脂糖液瓊脂糖1g，溶于10ml電板緩沖液(工作液f1:10稀釋)現(xiàn)配現(xiàn)用。(6)含0.01%溟酚蘭的60%蔗糖混合液(7)四甲基乙二胺(TEMED)(8)10%三氯乙酸(9)5%考馬斯亮蘭10%冰醋酸操作方法.凝膠板的制備(1)將干凈的兩塊玻板嵌入槽內(nèi)，并架于電泳槽內(nèi)，用夾子夾緊兩邊。⑵將1%瓊脂糖在電爐上溶化，用滴管乘熱立刻封底部和上端的小槽，按下表配制分離膠灌入。表膠濃度及試劑用量(ml)分離膠T=7.1%C=2.6%濃縮膠T=5.2%C=2.6%雙蒸水186.9凝膠貯備液91.7凝膠緩沖液9(a液)1.25（液）10%APS0.30.03TEMED0.020.01⑶待聚合后，用濾紙吸去膠表面的水分再加入濃縮膠，然后馬上插入樣品梳，25C下聚合。取出樣品梳。.加樣(1)將1:10稀釋的電板緩沖液倒入上下槽，直至蓋過(guò)上下槽凹形玻板的低凹處。⑵用20U1微量進(jìn)樣器吸取被檢血清和蔗糖澳酚蘭混合液20U1,混勻后，按順序加入樣品梳所制的凹槽內(nèi)。.電泳加樣完畢，即可電泳。上槽接負(fù)極，下槽接正極，以3mA/凹槽的電流強(qiáng)度。在4c或室溫下進(jìn)行電泳，直至澳酚蘭指示帶距膠底端0.5cm處即可停止電泳，電泳整個(gè)過(guò)程中應(yīng)穩(wěn)流，大約需要2—4小時(shí)。.固定染色脫色(1)電泳結(jié)束后，先關(guān)機(jī)，拔去電源，回收下槽內(nèi)的緩沖液。⑵將兩塊垂直玻板取出，緩慢輕巧分開(kāi)，將膠板輕輕移至另一塊玻板上，棄去下端的瓊脂糖凝塊，用玻棒輕輕將凝膠板移入裝有10%三氯醋酸的培養(yǎng)皿內(nèi)，固定15—30分鐘。然后加入5%考馬斯亮蘭染液2—4ml。⑶染色24小時(shí)，若譜帶顯現(xiàn)不清晰，可用10%冰乙酸脫色至清晰為止。結(jié)果判定同見(jiàn)圖四。Gcl-kGc2-1、Gc2-2如圖所示：在白蛋白帶與轉(zhuǎn)鐵蛋白帶之間的帶為Gc帶。Gel-1型：靠近白蛋白帶之間的帶為Ge帶。Gc2-2型：靠近轉(zhuǎn)鐵蛋白帶的兩條快帶。GC2-1型：在1—1型和2—2型區(qū)帶范圍內(nèi)的三條譜帶為2—1型。注意事項(xiàng)⑴用瓊脂糖液封槽時(shí)，上槽的瓊脂糖液應(yīng)加滿整個(gè)槽，不能有氣泡。⑵拔取樣品梳時(shí)，動(dòng)作要輕巧，否則凹槽不予出現(xiàn)。⑶同HP園盤電泳。五、紅細(xì)胞酶型(Redbloodcellenzyme-type)檢驗(yàn)㈠醐型檢驗(yàn)的理論基礎(chǔ)紅細(xì)胞酶型是指紅細(xì)胞內(nèi)同工前的遺傳多態(tài)性(Redcellissoenzymepolymorphisms),同工醐即是指由遺傳基因(Genes)決定的，分子的?級(jí)結(jié)構(gòu)不同(即受控于不同的結(jié)構(gòu)基因),但催化(Structuregene)活性相同，能催化同一種化學(xué)反應(yīng)的多種形式的一組能。在人的血細(xì)胞及其它體液、分泌液等中，含有豐富的同工酶(Isoenzyme),其多態(tài)性是由同一位點(diǎn)的復(fù)等位基因(Multiplealleles)所決定的。按照孟德?tīng)柖ɡ磉z傳，是一類重要的遺傳標(biāo)記(Geneticmarker)0對(duì)紅細(xì)胞酶的檢測(cè)和分析，能夠?yàn)榉ㄡt(yī)學(xué)個(gè)人識(shí)別(Personalidentification)和親權(quán)鑒定(Parentagetesting)提供很有價(jià)值的證據(jù)。目前已發(fā)現(xiàn)的主要紅細(xì)胞酶型有：紅細(xì)胞酸性磷酸酶(EPA)、酯酸D(ESD)。葡萄糖磷酸變位酶I(PGMI)、乙二醛酶I(GLOI)、酸葡萄糖酸脫氫酶(PGD)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、腺首脫氨酚(ADA)、腺甘酸激酶(AK)、肽酶(PEPA)。檢測(cè)同工醐的多態(tài)性采用的是同工酶譜技術(shù)，這是近30年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一門新的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。利用酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)，具有兩性離子的性質(zhì)以及酶具有特殊的催化活性，且對(duì)其催化反應(yīng)中的作用物(即底物)具有高度特異性的特點(diǎn)，將電泳技術(shù)和組織化學(xué)染色方法結(jié)合起來(lái)用于同工酶遺傳多態(tài)性的檢測(cè)。酶譜技術(shù)(Zymogramtechnique)方法主要包括以下兩個(gè)步驟：⑴電泳分離：酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)，在一定PH條件的溶液中，由于前蛋白分子上的氨基，竣基以及其它一些側(cè)鏈團(tuán)的電離而使酶蛋白分子成為帶電顆粒。不同分子結(jié)構(gòu)的酶蛋白，加其所帶電荷的不同，其電泳遷移率亦不一樣，因此，運(yùn)用電泳的方法，可將不同分子的前蛋白在一定的支持介質(zhì)(如醋酸纖維素膜、淀粉凝膠、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等)上分離成為不同的區(qū)帶。⑵酶譜顯示：電泳分離后的酶譜顯示，是利用酶具有催化活性且對(duì)底物具有高度特異性的特點(diǎn)，將相應(yīng)的底物加于分離酶蛋白的電泳介質(zhì)表面，在有酶活性存在的地方，底物即在醐的催化作用上，通過(guò)一定的化學(xué)反應(yīng)，生成具有一定顏色的或能發(fā)熒光的產(chǎn)物，從而將酶的譜帶于電泳介質(zhì)上顯示出來(lái)，根據(jù)各種酶電泳譜帶的不同，即可進(jìn)行酶型分析。在法醫(yī)血清學(xué)實(shí)際工作中，除新鮮血液外，血痕、精液及精斑，帶毛根的新鮮毛發(fā)等物證檢材，也越來(lái)越多地對(duì)其進(jìn)行酶型的檢測(cè)，以增加個(gè)人識(shí)別及親權(quán)鑒定機(jī)會(huì)，下面即介紹常用的醐型技術(shù)方法。㈡檢材樣品的處理⑴新鮮血細(xì)胞解離液的制備取靜脈血或耳血于生理鹽水中，一般以5倍體積量的生理鹽水離心洗滌三次，取1體積的壓積紅細(xì)胞加1份體積的冷蒸饋水振搖使其混勻，置4c冰箱內(nèi)放置45—60分鐘，室溫下溫融(或置冰盒中冰凍過(guò)夜，檢測(cè)前取出溫融)，所得之溶血物即可用于電泳分析。⑵精液樣品的處理收集精液樣品，室溫置30分鐘使之液化，4℃下高速離心(1500rpm)10分鐘，使精漿與精子分離，精子可用等滲的生理鹽水離心洗滌二次(3000rpm)10分鐘，上清液即可用于分析。⑶血斑及精斑檢材的處理血斑(痕)檢材，可用0.05M的二硫蘇糖醇(DTT)溶液少許浸泡10—20分鐘后(檢材較陳舊時(shí)可浸泡過(guò)夜)用于分析。精斑檢材一般采用電泳的電極緩沖液或DTT直接浸泡后用于分析。作斑痕的分型實(shí)驗(yàn)時(shí)，一定要用新鮮血已知標(biāo)準(zhǔn)型作平行對(duì)照。(4)毛發(fā)檢材的處理離體24小時(shí)之內(nèi)有毛根的毛發(fā)，剪取帶毛根的毛發(fā)1cm左右，置于-196C液氮中冷凍5分鐘，然后取出在室溫下溫融30—40分鐘即可直接插入凝膠內(nèi)進(jìn)行電泳。可將帶毛根的毛發(fā)砸扁后，用少許的凝膠緩沖(內(nèi)含l%Tritonx-100)浸泡洗脫使其能蛋白充分釋放出來(lái)，然后用濾紙片吸取浸出液插在凝膠板中進(jìn)行電泳分析(或先在凝膠板上打上樣品槽，將浸出液直接加入槽中進(jìn)行電泳)。新拔下的毛發(fā)，可連同其根剪取1cm左右直接插入膠內(nèi)。㈢電泳支持介質(zhì)的制備及處理見(jiàn)能型檢測(cè)的具體方法。㈣法醫(yī)學(xué)中常用紅細(xì)胞酶型檢測(cè)方法1.葡萄糖磷酸變位酶1(PGM1)(1)電極緩沖液：0.1MTris-馬來(lái)酸緩沖液(PH7.4)三羥甲基氨基甲烷(Tris)12.11g馬來(lái)酸11.62g乙二胺四乙酸2.92gMgCk?6H2O2.03gNaOH 6g加蒸儲(chǔ)水500ml,攪拌使其溶解后，用INNaOH調(diào)PH至7.4,加水至1000ml。(2)凝膠緩沖液(PH7.4)將緩沖液1:15倍稀釋作為凝膠緩沖液。⑶底物緩沖液：0.4MTris鹽酸緩沖液(PH8.0)Tris 1.2gMgC12-6H2O0.4g加蒸儲(chǔ)水50ml溶解后，用2NHC1(或1:1HCL)調(diào)PH至8.0,然后加水至100ml。⑷凝膠板的制備采用單純的瓊脂糖凝膠或瓊脂糖和水解淀粉混合膠，濃渡均為1%,凝膠板厚度為1mm,凝膠板大小為15X20cm2?凝膠的制備：瓊脂糖凝膠：瓊脂糖0.4gTOC\o"1-5"\h\z凝膠緩沖液 40ml混合膠：瓊脂糖 0.4g水解淀粉 0.4g凝膠緩沖液40ml在三角燒瓶?jī)?nèi)，沸水浴中加熱溶解后，倒入預(yù)先放置的水平之凝膠玻板上的模框內(nèi)，鋪滿整個(gè)?？?，注意不要有氣泡，室溫放置20分鐘或4c冰箱內(nèi)放5分鐘，即可使用。亦可頭天制備好膠板于保濕盒內(nèi)放入4℃冰箱中，次日使用。(5)樣品的準(zhǔn)備①新鮮血液：用生理鹽水離心洗滌三次，取壓積紅細(xì)胞加少許蒸儲(chǔ)水振搖后放冰槽過(guò)夜，次日離心取上面的溶血產(chǎn)物作為電泳樣品。②血斑：可剪取兩根0.8cm長(zhǎng)的血痕纖維，加少許0.05M的二硫蘇糖醇(DTT)浸透后直接插入膠板中電泳。(6)加樣①打孔，將制備好的凝膠板放于水平面臺(tái)上，在距陰極端3cm處，用手術(shù)刀切一橫排0.8cm長(zhǎng)的小切口，每個(gè)切口之間間隔0.4cm。②加樣：取0.8cm長(zhǎng)的紗布纖維2根，沾取制備好的紅細(xì)胞解離液埋入小切口內(nèi)(血痕纖維則用DTT浸濕后直接埋入)。(7)電泳將加好樣的凝膠板放在電泳槽冷卻板上，用三層濾紙搭橋，加樣側(cè)接陰極，對(duì)側(cè)接陽(yáng)極,打開(kāi)電源，按電場(chǎng)強(qiáng)度15V/cm調(diào)整電壓，并用萬(wàn)用電表測(cè)試調(diào)整電壓到實(shí)際需要的量。電泳時(shí)間2.5—3.5小時(shí)，循環(huán)溫度2—4℃。(8)酶譜顯示⑴顯色反應(yīng)的生化機(jī)能葡萄糖一1一磷酸鹽IPGMI葡萄糖一6一磷酸 NADP< ?Formazan(蘭色)I PMS6一磷酸葡萄糖內(nèi)酯? ?NADPH MTT⑵顯色步驟取葡萄糖一1一磷酸鹽35mg葡萄糖1,6二磷酸鹽0.2mg輔醐H(NADP) 2.0mg嘎哇蘭(MTT) 2.5mg吩嗪甲酯硫酸鹽(PMS)l.Omg混合裝于一棕色小瓶?jī)?nèi)，加入10ml底物緩沖液使其充分溶解。另取瓊脂糖0.2g裝于50ml三角燒瓶?jī)?nèi)，加15ml蒸儲(chǔ)水混勻，放沸水浴中使其溶解。室溫冷至56—65C時(shí)，迅速將上述配好的顯色液倒入、搖勻，立即加入葡萄糖一6一磷酸脫氫酶(G-6-PD)10ul,混勻后立即將此染色液鋪于電泳凝膠表面(可放于有機(jī)玻璃?？蛴谀z面上，框的一邊與加樣原點(diǎn)平齊)，置保濕盒內(nèi)放37℃恒溫箱內(nèi)(避光)30—40分鐘，待睡的蘭色譜帶清晰顯現(xiàn)，即可判續(xù)PGM1表型。0)結(jié)果分析(見(jiàn)下圖)正極fg 、^■1a負(fù)極原點(diǎn) 1 2—1 2圖五PGM1三種普通表型標(biāo)準(zhǔn)譜.酯酶D(EsD)(1)電極緩沖液①「可用0.1M、Tris—1.65mM、LioH—16.5mM,檸檬酸一18mM、硼酸(PH7.5)配制方法：Trrs7.51g檸檬酸3.47g硼酸1.11g氫氫化鋰69mg加水至1000ml,使其充分溶解，用2moiTris調(diào)PH至7.5。⑵凝膠緩沖液若用1.液，則將電極緩沖液稀釋15倍作為凝膠緩沖液。若用2.液，則將電極緩沖液5倍稀釋作為凝膠緩沖液。⑶底物緩沖液無(wú)水醋酸 0.41gH2O 50ml用1%醋酸調(diào)PH至6.5,然后加水至100。(4)凝膠板的制備：同PGM1表型測(cè)定(5)樣品的準(zhǔn)備：同PGM1(6)加樣：同PGM⑺電泳電場(chǎng)強(qiáng)度12伏/厘米或15伏/厘米，電泳時(shí)間45-60分鐘，電泳溫度4—6℃。(8)航譜顯示①顯色反應(yīng)的生化機(jī)理

4—甲基傘形酮醋酸鹽ESD瘦酸陰離子< >4一甲基傘形酮(在長(zhǎng)波紫外燈下發(fā)亮蘭色熒光)②顯色步驟取1.5mg—甲基傘形酮醋酸鹽，力110.5亳升丙酮助溶，然后加底物緩沖3ml混勻，將該液體倒在15X8cm大小的新華濾紙上，使其充分浸透后覆蓋在凝膠板表面，室溫放10分鐘后，直接(也可除去濾紙)在2500—3600A的紫外燈下觀察熒光區(qū)帶，判讀EsD之表型。0)結(jié)果分析正極負(fù)極原點(diǎn)負(fù)極原點(diǎn)EsD1—1 2—1 2—3 3—1 4—1 4—2 5—1 6—1圖六人紅細(xì)胞EsD表型電泳譜.乙二醛酶I(GLOI)⑴電極緩沖液：0.1\11'1^一馬來(lái)酸緩沖液出117.4),配制同前⑵凝膠緩沖液：1:15倍稀釋之電極緩沖液⑶底物緩沖液：磷酸緩沖液(PH6.2)NaH2PO42.4gNa2HPO41.31g加水50ml溶解后，用1NHC1或NaOH調(diào)PH至6.2,然后加水至100ml。(4)顯色用碘液1.65gKI(碘化鉀)溫水溶，攪拌5分鐘，過(guò)濾，裝棕色瓶中4c保存。TOC\o"1-5"\h\z1.5g 1（碘）30mlH2O⑸凝膠板的制備采用1%瓊脂糖和1%水解淀粉混合凝膠，制備方法如下：瓊脂膠 0.4g水解淀粉 0.4g凝膠緩沖液 40ml沸水溶解后倒入凝膠框內(nèi)，室溫放20—30分鐘固化。（6）檢材樣品的準(zhǔn)備：同PGM1,亦可直接用全血。⑺加樣：用6X1.5mm大小的濾紙片沾取全血或溶血產(chǎn)物直接插入凝膠板距陰極端3—5cm處。（8）電泳電場(chǎng)強(qiáng)度15v/cm,時(shí)間45—60分鐘，溫度4℃。0）酶譜顯示：（碘染色法）①反應(yīng)機(jī)制甲基乙二醛GLOI]還原型谷胱甘肽 一乳酰谷胱甘肽（無(wú)色）GSSG」凝膠中含有起反應(yīng)的谷胱甘肽可以使碘還原成碘化物，而有酶活性的地方，由于還原型谷胱甘肽變成了乳酰谷胱甘肽，而不能使碘還原，因而碘液即使凝膠中的淀粉顯蘭色，因此,顯現(xiàn)蘭色的地方就標(biāo)志有GLOI的存在。②顯色步驟.底物反應(yīng)劑還原型谷胱廿肽12m研40%甲基乙二醛50ul?底物緩沖液6ml J取1.5X12cm大小的濾紙，將上液倒于濾紙上使其浸透后，覆蓋在正極端凝膠面，室溫放45分鐘（或37c放30分鐘），除去濾紙，吸干凝膠表面的水分，放一模框于凝膠表面。.碘凝膠制備取瓊脂糖1.5g,加蒸儲(chǔ)30ml,沸水浴熱浴，涼至55℃時(shí)加碘液0.2ml搖勻，倒在凝膠表面的?？騼?nèi)，覆蓋與底物反應(yīng)劑作用的區(qū)域，立即判斷結(jié)果。（9）結(jié)果分析：（見(jiàn)圖七）負(fù)極原點(diǎn)1—12—12—21—12—12—2圖七人工細(xì)胞GLOI表型電泳譜4.紅細(xì)胞酸性磷酸酶(EAP)0.018M檸檬酸鈉、0.029m磷酸二氫鈉、0.0012M乙二胺四乙酸鈉(PH6.0)Na3Citrato2H2ONaH2Po42H2ONa2EDTA加水溶解后，用INNaH2PO,調(diào)PH到6.0,加水至1000mL(2)凝膠緩沖液：0.05M檸檬酸、0.05M氫氧化鈉、PH5.0。檸檬酸10.5gNaOH2g加水溶解，用INNaOH調(diào)PH至5.0,加水至1000mL(或按100ml量配制:檸檬酸1.05g,NaOH0.2g)(4)凝膠制備取15X20X0.1cm大小的?？?，固定于水平板上的玻璃板上面。稱取0.4g瓊脂糖，加140ml凝膠緩沖液(8ml電極緩沖液和32ml蒸馀水)，放沸水中加熱溶解，然后倒于模框內(nèi)，室溫固化15—30分鐘，即為1%瓊脂糖凝膠板。(5)樣品的準(zhǔn)備，同PGM1(6)加樣取0.3X0.7cm大小的濾紙片，吸取待測(cè)的紅細(xì)胞解離液，(約10—15ul),整齊地放置在膠板距陰極端3—5cm處，放室溫?cái)U(kuò)散30分鐘后小心除去樣品紙條。⑺電泳槽內(nèi)加入電極緩沖液，將凝膠板放置于冷卻板上，兩端用3層濾紙搭橋，加樣側(cè)接負(fù)極，對(duì)側(cè)接正極，再檢查一次電極是否正確。然后打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)。電場(chǎng)強(qiáng)度為12V/cm—15V/cm,電泳2—3小時(shí)，循環(huán)水溫度為10—20℃。(8)酶譜顯示①顯色反應(yīng)的生化機(jī)理4一甲基傘形酮磷酸鹽EAP磷酸＜ ?4-甲基傘形酮(在長(zhǎng)波紫外燈下發(fā)亮蘭色熒光)②顯色步驟將1.5mg、4一甲基傘形酮磷酸鹽溶于2.5ml底物緩沖液中，充分液解后倒在8X10cm大小的新華濾上，使其浸透后，覆蓋于加樣點(diǎn)至陽(yáng)極端的凝膠表面，放保濕盒于37C溫箱中放30分鐘，在長(zhǎng)波紫外燈卜.觀察結(jié)果。正極⑼結(jié)果分析正極 起點(diǎn)負(fù)極ABABCACBC

圖八人紅細(xì)胞ACP表型電泳譜第三篇抗血清的制備一、抗人血清沉淀素的制備實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私饪谷搜澹ˋnti-humanserum）制備的原理和方法。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容抗人血清和抗人血紅蛋白沉淀素血清（Anti-humanhemoglobinserumprecipitin）的制備。實(shí)驗(yàn)原理免疫所用的沉淀原（Recipitinogen）是可溶性的人血清旦白，常用的免疫動(dòng)物是家兔。沉淀原可刺激家兔機(jī)體產(chǎn)生特異的沉淀素，所得血清即為抗人血清（旦白）沉淀素血清（ASHP）。簡(jiǎn)稱抗人血清。如欲制得抗某種動(dòng)物血清旦白沉淀素血清，可用該動(dòng)物血清給家兔免疫制得。實(shí)驗(yàn)儀器離心管（5ml』5ml）、注射器（2ml、50ml、30ml）、注射針頭（5號(hào)、7號(hào)）滴管、試管、試管架、沉降管、沉降管架、刻度吸量管（1ml、2ml）、手術(shù)剪、手術(shù)鎰、眼科剪、眼科鑲、止血鉗、動(dòng)脈夾、三角燒杯、水浴鍋、安瓶、酒精噴燈、兔箱、兔解剖臺(tái)、手術(shù)刀、絲線、玻璃紙、酒精燈、漏斗、研體、研槌。實(shí)驗(yàn)試劑生理鹽水、冰醋酸、二甲苯、酒精、碘酒、氯化鈉各型人血清、疊氮鈉、福氏完全佐劑。免疫方法(1)動(dòng)物的選擇最好選用白色短毛大耳年輕健康的雄性家免，體重在2公斤以上，未作過(guò)其他實(shí)驗(yàn)。如為雌兔則還要是未生育或懷孕。如需制備抗兔血清沉淀素血清，則多選用健康的“菜康”和大種的雜交公雞，體重1.5—3公斤者為好。⑵沉淀原(抗原)的制備①凝固血清旦白制備取多個(gè)健康人新鮮血清，用蒸儲(chǔ)水稀釋10倍，再加1/5容枳的飽和鹽水，按100ml加冰醋酸1一2滴，置沸水溶中加熱15分鐘，待蛋白凝固冷卻后用濾紙過(guò)濾，當(dāng)殘?jiān)鼪鲋涟敫桑貌２ＡЪ埌汕驙?，每?.5g放入二甲苯液中，在4℃冰箱保存?zhèn)溆?。臨用前取0.5g凝固血清旦白，置于濾紙上使二甲苯充分揮發(fā)，再將其置于研缽中加2ml生理鹽水研磨，使成乳白色均勻的混濁液，供一只兔子免疫一次。②新鮮。型血清，以生理鹽水稀釋2倍。③福氏完全佐劑與人血清的2—3倍稀釋等量混合，強(qiáng)度振蕩使?jié)u成包水狀態(tài)。(3)免疫注射其方法很多，注射的劑量、途徑、次數(shù)因免疫方法不同而異。常用的免疫注射途徑有：耳靜脈注射、皮下注射。皮內(nèi)注射。腹腔內(nèi)注射、肌肉注射、眼結(jié)膜下注射等。①皮下注射(以注射凝固旦白為例)用注射器吸取已稀釋好的凝固血清旦白2m1(一只兔子的用量)，于兔子的背部、臀部、或腹股溝部、各選二個(gè)注射點(diǎn)，每點(diǎn)皮下注射0.5ml每隔七天注射一次，共注射三次，末次注射后的第7—10天采血測(cè)抗體效價(jià)。如果效價(jià)不理想可再注射一次或二次，隔七天后再采血測(cè)效價(jià)。如果效價(jià)仍不理想，說(shuō)明動(dòng)物的免疫反應(yīng)不好，不必再注射。②耳靜脈注射——以注射新鮮O型血清為例取數(shù)人O型血清混合，用生理鹽水稀釋2倍，以2ml/次/每只兔的量，隔日注入兔耳靜脈一次，共2—4次。末次注射后的第七天采耳血測(cè)抗體效價(jià)。③肌肉注射——以加佐劑血清為例取巳配好的福氏完全佐劑血清給家兔多個(gè)部位肌肉注射，隔七日注射一次，共3次，末次注射后的第七天采耳血測(cè)抗體效價(jià)。上述幾種方法并非固定不變，可根據(jù)需要加以調(diào)整，以能制取最高抗體效價(jià)為宜。(4)效價(jià)測(cè)定①耳靜脈采血將兔子放入兔箱后由一人固定，找到耳靜脈較粗一段，拔去兔毛，用手摩擦或輕彈耳靜脈，使其充盈，或用二甲苯涂抹耳根部，也可使血管明顯擴(kuò)張，用針頭刺破血管，取血1-2ml于試管中，在室溫下數(shù)小時(shí)后，血清便可析出。②效價(jià)(tilers)測(cè)定 環(huán)狀沉淀反應(yīng)稀釋抗原(antigen)：用生理鹽水將抗原(人血清)作2—5倍數(shù)的稀釋。如下表所表示表一 2—5倍數(shù)稀釋法康氏管編號(hào)12345678生理鹽水(ml)0.50.750.50.50.750.50.50.751/10血清(ml)0.50.50.50.50.50.50.50.5最后容積0.50.750.50.50.750.50.50.75血清稀釋倍數(shù)1/201/501/1001/2001/5001/10001/20001/5000康氏管編號(hào)910111213生理鹽水(ml)0.50.50.750.50.51/10血清(ml)0.50.50.50.5棄最后容積0.50.50.50.50.5血清稀釋倍數(shù)1/1萬(wàn)1/2萬(wàn)1/5萬(wàn)1/10萬(wàn)0方法a.取七支沉降管，按下表每管加入待檢抗人血清0.1ml,加時(shí)將滴管插入沉降管低，加血清至0.5cm的高度，然后吸至高度約0.3—0.4cm。(或加至管高為0.3—0.4cm)。注意勿加出氣泡，有氣泡產(chǎn)生時(shí)可離心除去氣泡。b.用另一干凈毛細(xì)滴管，從13號(hào)康氏試管開(kāi)始，即從13至7的倒序依次每管吸出0.1ml的抗原稀釋液加入沉降管內(nèi)，使之重疊于抗人血清之上，加進(jìn)要沿管壁輕慢加入，使兩溶液之間有一清晰的界面。加入抗原的量要與待檢抗血清的量相同。表二沉降管編號(hào)1234567抗人血清(ml)0.10.10.10.10.10.10.1抗廊解液康氏試管號(hào)78910111213抗原量(ml)0.10.10.10.10.10.10.1抗原稀釋度1/20001/50001/1萬(wàn)1/2萬(wàn)1/5萬(wàn)1/10萬(wàn)0結(jié) 果4--H--H-++————③觀察結(jié)果抗原加完后記時(shí)，每隔15分鐘將沉降管架置于黑背景，用斜射光觀察有無(wú)沉淀環(huán)出現(xiàn)。如果在兩液之間有白色環(huán)出現(xiàn)為陽(yáng)性反應(yīng)，在15分鐘、30分鐘、60分鐘出現(xiàn)白色沉淀者，分別為+++、++、+超過(guò)60分鐘出現(xiàn)白色沉淀環(huán)者為非特異性反應(yīng)。60分鐘后不出現(xiàn)者為陰性反應(yīng)。如果鹽水對(duì)照管不出現(xiàn)白色沉淀環(huán)，則陽(yáng)性反應(yīng)為(+)的最后一管抗原稀釋度的例數(shù)，即該抗人血清沉淀素的效價(jià)，即抗體的效價(jià)。如表2中第4號(hào)沉降管出現(xiàn)(+)的陽(yáng)性反應(yīng)而該管的抗原稀釋度為1/2萬(wàn)，那么抗體效價(jià)就為2萬(wàn)倍。⑸特異性測(cè)定用家常動(dòng)物如兔、狗、羊、雞、豬、牛等的血清按2?5倍數(shù)法稀釋為1/20、1/50、1/100、1/200和1/500倍等五種稀釋液。②用環(huán)狀沉淀反應(yīng)進(jìn)行測(cè)定，將各種動(dòng)物血清按不同稀釋度分別加入裝有待檢抗人血清的沉降管內(nèi)，使兩液之間形成-清晰界面，然后觀察有無(wú)白色沉淀環(huán)出現(xiàn)。如在1/500—1/1000稀釋度范圍內(nèi)均無(wú)白色沉淀環(huán)出現(xiàn)，則說(shuō)明抗人血清的特異性好，可以使用。如1/100以后的管出現(xiàn)白色沉淀環(huán)，則表示特異性差，需用吸收法除去交叉反應(yīng)的抗體。具體做法是用5%猴血清少量混勻后，室溫2小時(shí)、4℃冰箱過(guò)夜，離心沉淀，取上清液再測(cè)其效價(jià)及特異性，如不理想可再做第二次吸收。(6)收集、保存抗人血清①大量采血當(dāng)抗人血清效價(jià)合格時(shí)，可在測(cè)效價(jià)的第二天早上(未喂食前)進(jìn)行大量采血，其方法很多,主要有心臟采血和頸動(dòng)脈采血兩種，現(xiàn)分述如F：a.心臟采血：將兔固定在兔解剖臺(tái)上或由另外二人固定，手術(shù)者用手指尖觸摸兔胸前區(qū)，找到心臟膊動(dòng)最明顯處。剪毛，消毒后用注射器剌入心臟直接抽取血液。b.頸動(dòng)脈采血：將兔子固定在兔解剖臺(tái)上，剪去頸區(qū)兔毛消毒，切開(kāi)分離頸部各層組織,找出并分離兩側(cè)頸動(dòng)脈。結(jié)扎右側(cè)頸動(dòng)脈及左側(cè)頸邊脈遠(yuǎn)心端。用動(dòng)脈夾夾住左側(cè)頸動(dòng)脈近心端，在其上做“V”型切口，并插入一塑料導(dǎo)管，用絲線固定好，取下動(dòng)脈夾，放血。將上述兩種方法所采血液收集在三角燒杯內(nèi)，斜置于室溫下2小時(shí)，4C冰箱過(guò)夜，次日分離血清，離心沉淀，便可得到清晰的抗人血清。將其放入56℃水中30分鐘，再經(jīng)過(guò)用猴血清吸收得到合格的抗人血清。③抗人血清的保存在效價(jià)特異性均合格的抗人血清中，加入適量疊氮鈉，使其在抗人血清中的總濃度為0.01%,然后在無(wú)菌室內(nèi)將其分裝于消毒安瓶中封存，放入冰箱保存。二、抗人血紅蛋白沉淀素血清的制備實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私饪谷搜t蛋白沉淀素血清(Anti-humanhemoglobinserumprecipitin)的制備方法。實(shí)驗(yàn)原理同抗人血清沉淀素的制備。實(shí)驗(yàn)儀器同抗人血清制備。實(shí)驗(yàn)試劑生理鹽水、氯化鈉、蒸鏘水、酒精、碘酒、各型混合紅血球、各種動(dòng)物血球、20%黃柳酸、乙酸。兔疫方法(1)動(dòng)物的選擇同抗人血清制備。(2)沉淀原(precipitinogen)的制備方法I：a.取多個(gè)人的血凝塊混合，用四層以上鹽水濕紗布包裹放入研缽擠壓，將紅血球壓出?；?qū)⒖鼓x心，棄去血清，即得紅細(xì)胞。b.在紅細(xì)胞中加入10倍鹽水，離心，棄去上清液，再加鹽水混勻。離心棄上清液，如此反復(fù)20次左右，直至上清液用20%黃柳酸檢查無(wú)血清成份為止。c.取洗滌好的壓積紅細(xì)胞4ml,力口9倍量(36ml)蒸儲(chǔ)水，混勻后冰箱過(guò)夜，便之完全溶血，再加純氯化鈉結(jié)晶0.32克，使之成為0.85%的氯化鈉溶液。高速離心，除去細(xì)胞質(zhì)膜和其他基質(zhì)，上清液即為10%血紅旦白鹽水溶液，分裝于安瓶中，冰箱保存。方法H：a.取O型人紅細(xì)胞用生理鹽水充分洗滌十五次，至上清液對(duì)20%黃柳酸反應(yīng)陰性為上。分離得到壓積紅細(xì)胞加等量蒸馀水使之溶血。b.加1/5量的乙醛，3000rmp,離心5分鐘，除去上層的紅細(xì)胞基質(zhì)，向溶液中通入空氣，除去殘余乙醛。在上清液中加入等量1.7%氯化鈉液使成為5%血紅旦白液，再用石棉漏斗過(guò)濾一次、離心后?？傻玫酵该魅芤?，分裝保存于-20C。(3)免疫注射眼結(jié)臉下注射：用注射器吸取己制備好的10%Hb鹽水液0.2ml固定兔頭，翻開(kāi)兔上眼瞼。將針頭小心刺入眼穹窿部，球結(jié)膜內(nèi)深約2mm,注射抗原。隔一天注射一次，左右眼交替，注射六次后休息七天，采耳靜脈測(cè)定其效價(jià)。如放價(jià)淵意了，即可大量采血，如不滿意，可再注射六次后再測(cè)效價(jià)，如再不滿意即可放棄。其他的注射途徑可根據(jù)實(shí)際情況而定。(4)效價(jià)測(cè)定同抗人血清制備，只不過(guò)抗原(沉淀原)是人血紅旦白液。⑸特異性測(cè)定用家常動(dòng)物的紅細(xì)胞制成10%血旦白液、方法同抗人血清制備。(6)收集保存抗人血紅旦白血清同抗人血清制備。注意事項(xiàng)(1)在制備抗血清的整個(gè)過(guò)程中，要保證無(wú)菌操作，所用器皿、器械、生理鹽水都要進(jìn)行消毒處理。⑵往沉降管內(nèi)加抗血清時(shí)。不能有氣泡產(chǎn)生。在抗血清上加入抗原時(shí)。動(dòng)作一定輕慢,要沿著管壁緩慢加入。切勿沖壞液面。⑶采血后，嚴(yán)防發(fā)生溶血。⑶ 使用制備好的抗血清時(shí)。注意不要反復(fù)凍融，以防抗體效價(jià)跌得太快。第四篇 血痕(Bloodstains)檢驗(yàn)一、血痕預(yù)備試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容?聯(lián)苯胺試驗(yàn)(Benzidinltest)。.無(wú)色孔雀綠試驗(yàn)(Leucoma/achitegleentest)?.過(guò)氧化試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆昭垲A(yù)試驗(yàn)的幾個(gè)常用方法。實(shí)驗(yàn)儀器滴瓶、滴管、凹玻板