瘧原蟲的鏡檢技術課件

瘧原蟲的RDT檢測

及鏡檢技術豐城市疾病預防控制中心

檢驗科：黃曾

2014-7-15瘧疾的實驗室診斷1.病原學診斷：顯微鏡血涂片檢查結果陽性；這種鏡檢確診最可靠。2.免疫學診斷：（1）循環(huán)抗原的檢測（2）循環(huán)抗體的檢測3.分子生物學技術：PCR和DNA探針已應用與瘧疾的診斷。

分子生物學、血清學技術發(fā)展迅猛，但是確診瘧疾的“金標準”

仍然是病原學診斷顯微鏡檢查瘧原蟲?！?/p>

快速診斷試紙條可與鏡檢瘧原蟲相互補充。

瘧原蟲抗原檢測（一）原理快速檢測試劑是通過在硝酸纖維素膜（NC）試紙條上產生可見的條帶來檢測抗原的一種“免疫-層析”試劑。染色標記抗體與瘧原蟲抗原結合，復合物由試劑條檢測線上的抗體捕獲后，形成一條可見的條帶（檢測線）。檢測的第一步是將溶血劑與血液混合，破壞血紅細胞釋放瘧原蟲蛋白，便于與標記抗體靶蛋白結合；然后將血液與標記抗體的混合液置于硝酸纖維試紙條上，并通過毛細管作用和緩沖液/清洗劑推力，使混合液在試紙條上移動并通過檢測線與對照線。4.將吸血后的毛細管豎立于凹槽2中，捏出全部血液并與凹槽中稀釋液混勻約1分鐘。血膜的制作（取血時間）采血時間現癥病人和流調普查時可不考慮取血時機。但在診斷或需要某期瘧原蟲作標本時，則應掌握適宜的取血時機。瘧疾典型的臨床表現分前驅期、發(fā)冷（寒戰(zhàn)）期、發(fā)熱期、出汗期和間歇期五期。

間日瘧在前驅期相當于肝內期瘧原蟲發(fā)育，因原蟲密度太低，鏡檢多為陰性。發(fā)冷（寒戰(zhàn)）期相當于紅內期成熟裂殖體漲破紅細胞期，鏡檢多為裂殖體和環(huán)狀體。發(fā)熱期，外周血中以環(huán)狀體（小滋養(yǎng)體）為主，也可見到裂殖體；出汗期因原蟲密度太低，鏡檢多為陰性。發(fā)作后數小時（h），間歇期外周血中以大滋養(yǎng)體為主，形態(tài)較易辯認，為診斷的有利時機；發(fā)作36-48h，可檢出裂殖體；發(fā)作1-2次后，配子體出現較多。惡性瘧較理想的取血時間是在發(fā)作后至20h內取血，初發(fā)患者退熱后常查不到原蟲。末梢血血檢到惡性瘧原蟲配子體，是在末梢血出現環(huán)狀體之后的10天左右。取血部位和血量采血部位和取血方法：耳垂或無名指（嬰幼兒母趾或足跟），通常在耳垂取血，先用75%酒精棉球消毒取血部位，待酒精干后，用左手拇指和食指緊捏耳垂上方或無名指指尖，右手持消毒針迅速刺入皮膚，不宜過深或過淺。然后用右手中指輕輕擠壓出血。厚血膜血量約一粒大米（即火柴頭）大小。

血膜的制作（涂片操作）涂制厚、薄血膜的位置通常將厚、薄血膜涂在一張載玻片上。方法是將載片分為6等分，第1、2格備貼標簽及編號用；厚血膜涂在第3格中央，薄血膜涂在第4格前緣至第6格中部。作為標本的血片每張玻片涂厚、薄血膜各1個；門診和發(fā)熱病人血片每片1人，涂2個厚血膜1個薄血膜，以防血膜脫落而影響檢查；

標本片發(fā)熱病人血片標簽熟練工作者的推片姿勢厚血膜的制作厚血膜

用推片的左下角，從取血部位刮?、偌s4～5微升血量（相當于火柴頭大?。?，使血滴與平置的載玻片接觸，再由里向外一個方向旋轉，轉2～4圈，涂成②直徑0.8～1cm大小圓形厚血膜(厚血膜的厚度以一個油鏡視野內可見到5～10個自細胞為宜)，③厚血膜的位置，位于玻片右1/3處[中央偏右（或6等份中的與貼標簽的1、2份相鄰的第3份中部）]

。④厚血膜外觀：圓形厚薄均勻，無劃痕。過厚易于脫落，過薄達不到檢出率的要求，以油鏡視野5-10個WBC為宜。標準的瘧疾厚薄血膜位置各種不同的瘧疾血片涂制法：標準血片（1人）門診發(fā)熱病人血片（1人）居民普查血片（2人）血膜的制作血膜編號

血膜制成后，立即在玻片面上寫上受檢者的號碼，以防差錯；待薄血膜干后再用鉛筆于薄血膜中寫上血片種類的代號和受檢者的個人編號，依次順序插入標本盒內。染液的種類及染色原理注意：蛋白質和氨基酸都是兩性電解質，要求染液的pH值7.0-7.2較好。

染液偏酸時，所帶的正電荷增加，易于伊紅結合，使紅細胞和瘧原蟲的核染成鮮紅色，而淋巴細胞和原蟲的胞漿著色較差；反之，當染液偏堿時，紅細胞和嗜伊紅白細胞的顆粒等被染成紫藍色，不易觀察。姬氏染液母液配置方法

取姬氏粉0.5克置于研缽中，加25ml甘油充分研磨，倒入60或100ml帶有玻塞的有色玻瓶中。在研缽中加少量甲醇，洗去甘油濃液混入瓶內，至25ml甲醇洗凈缽中甘油染液為止，塞緊瓶塞，充分搖勻，置于55—60℃水浴中或溫箱內24h或室溫內3—5天，多加搖動，即成原液。姬氏染液是目前較優(yōu)良的血膜染劑，即使在炎熱天氣中，亦可經久不變。材料：1、姬氏粉0.5克2、甘油25ml3、甲醇25ml

注意事項：1.高純度試劑。2.所用器皿絕對無水（伊紅在水溶液內遇到美藍或天青即可互相化合而產生沉淀，從而失去染色力）。3.邊加邊磨，充分研磨；整個染色液配制時間不能少于5個小時。

操作1（快染）

配制5%染液，（每張血片約需染液2ml）：量筒內量2ml緩沖液或新鮮涼開水，直接滴加吉氏原液7滴，混勻，滴入待染標本的厚薄血膜上，染色10min，清水細緩沖洗，晾干鏡檢。（一般配制5%-10%，染色時間短，一定掌握好時間。）操作2(慢染)配制3%染液：在染色量筒內量2ml蒸餾水或新鮮涼開水，再滴加吉氏原液4滴，混勻，滴入待染標本上，染色30~40min。清水細緩沖洗，晾干鏡檢。（一般配制2.5%-3%染液，染色效果穩(wěn)定。）吉氏染液濃度門診染色血片制作與染色注意事項

●使用前載玻片一定要清潔，否則會影響血片制作和鏡檢結果。●厚血膜干燥時勿加熱，加熱會使原蟲變形，影響鏡檢結果?！衽渲媚敢簳r過濾可除去雜質顆粒，有助于提高鏡檢質量?！窆潭ū⊙r勿將甲醇觸碰到厚血膜。●沖洗染液時，水流輕緩，勿沖走厚血膜。薄血膜中常見的血液成分中性粒細胞嗜酸性粒細胞血小板單核細胞淋巴細胞紅細胞薄血膜瘧原蟲形態(tài)間日瘧環(huán)狀體感染的紅細胞：脹大不明顯，基本正常。蟲體大小：較大，約為紅細胞直徑1/3。胞漿：環(huán)狀，淺藍色。核：紅色，一個，偶有二個。瘧色素：無。

約占寄生紅細胞的1/3，很少見到一個紅細胞寄生2個環(huán)狀體和一個環(huán)狀體有2個核。薄血膜瘧原蟲形態(tài)

惡性瘧環(huán)狀體感染的紅細胞：大小正常,顏色較深。蟲體大?。狠^小，約為紅細胞直徑1/5-1/6。胞漿：藍色，環(huán)狀纖細,有時位于紅細胞的邊緣。常見多個原蟲同寄生于一紅細胞的現象。核：紅色一個,常有二個。瘧色素：無。惡性瘧原蟲--環(huán)狀體環(huán)纖細,約為RBC直徑的1/6，RBC不脹大核1個，但2個常見，紅細胞常含2個以上原蟲薄血膜間日瘧大滋養(yǎng)體形態(tài)感染的紅細胞：脹大褪色，出現形狀大小相等、分布均勻、數目較多、鮮紅色的薛氏小點。蟲體大小：較大。胞漿：不規(guī)則，淺藍色，出現阿米巴偽足，有空泡。核：紅色，一個。瘧色素：有，細小桿狀，黃褐色，分布不均勻。間日瘧大滋養(yǎng)體

蟲體不規(guī)則，較大；阿米巴樣空泡明顯；瘧色素細小，黃褐色。

間日瘧大滋養(yǎng)體惡性瘧大滋養(yǎng)體受感染紅細胞：大小正常，顏色較深，可出現較粗、大小不一、分布不勻、數目較少紅色茂氏小點。蟲體大?。狠^小。胞漿：藍色，圓形，堅實，體積小。核：一個，紅色。瘧色素：較細的黑褐色顆粒，常集成塊。

惡性瘧大滋養(yǎng)體紅細胞：脹大，褪色，可有薛氏小點。胞漿：較不規(guī)則，空泡小或消失，淺藍色。核：紅色，分裂為二個以上。色素：黃褐色，分布不均勻。間日瘧未成熟裂殖體薄血膜瘧原蟲形態(tài)間日瘧未成熟裂殖體

惡性瘧未成熟裂殖體紅細胞：大小正常，顏色較深，可有茂氏小點。大?。狠^小。胞漿：規(guī)則，圓形或卵圓形，藍色。核：分裂為二個以上，紅色。色素：黃褐色顆粒，常集成黑褐色團塊。間日瘧成熟裂殖體紅細胞：脹大，褪色，可見薛氏小點。大小：個體較大。胞漿和核：裂殖子12~24個，通常為16~18個，排列不規(guī)則，核紅色，胞漿淺藍色。瘧色素：黃褐色，常集于瘧原蟲的一邊。間日瘧裂殖體惡性瘧成熟裂殖體紅細胞：大小正常，顏色較深，可見茂氏小點。大?。合x體較小。胞漿和核：裂殖子8~32個，通常為8~18個，排列不規(guī)則，核紅色，胞漿藍色。色素：黑褐色，集中于中央或一側。惡性瘧成熟裂殖體

裂殖子8～32個，通常8～18個，排列不規(guī)則瘧色素集中成團塊狀蟲體占紅細胞體積的2/3至3/4薄血膜間日瘧雌（大）配子體形態(tài)形狀大?。簣A形或橢圓形，較大。胞漿：深藍色。核：一個，較小，深紅色，常偏于一邊，核周可見明顯不染色帶。瘧色素：黃褐色，均勻散在，數目較多。間日瘧原蟲雌配子體

間日瘧雄（?。┡渥芋w形態(tài)形狀大?。簣A形，蟲體較大。胞漿：淺藍色。核：一個，較大，疏松，位于中央，淺紅色，周圍有明顯不著色帶。瘧色素：黃褐色，散在分布。間日瘧原蟲雄配子體惡性瘧雌（大）配子體形態(tài)形狀：新月形，兩端稍尖。胞漿：深藍色。核：一個，較小，致密，深紅色，位于中央，核周可見透明不染色帶。瘧色素：黑褐色，密布于核的周圍。薄血膜惡性瘧雄（?。┡渥芋w形態(tài)形狀：臘腸形，兩端鈍圓。胞漿：淺藍色或淡紫紅色。核：一個，較大，疏松，位于中央，淺紅色，核周可見不染色帶。瘧色素：黑褐色，松散分布于核周圍。將（未）成熟雌配子體與成熟大滋養(yǎng)體

(核分裂前，剛要進入裂殖體前期)的形態(tài)鑒別蟲體大小:幾乎充滿被寄生的紅細胞核:一個，較大且致密，周圍有一圈空白的不染色帶胞漿:邊緣清楚，不含空泡瘧色素:顆粒較多較粗，均勻散在蟲體大小:不超過被寄生紅細胞的3/4核:一個，延長呈帶狀，周圍無明顯的不染色帶胞漿:邊緣不整齊，多有空泡瘧色素:顆粒較少較細，分布不均勻看完血片后，若為陽性，應立即按血片編號登記原蟲的種、期，以防差錯。為檢查后記錄結果方便起見，對瘧原蟲的種、期可使用英文字母縮寫作為代號：間日瘧：P．v(Plasmodiumvivax)惡性瘧：P．f(P．falciparum)三日瘧：P．m(P．malarae)