免疫學(xué)檢測技術(shù)課件

免疫學(xué)檢測與免疫學(xué)技術(shù)一、抗原抗體的檢測技術(shù)二、免疫細(xì)胞的檢測三、細(xì)胞因子的檢測四、免疫相關(guān)基因分析五、免疫標(biāo)記技術(shù)六、免疫PCR(IM-PCR)技術(shù)

七、雜交瘤技術(shù)與T細(xì)胞克隆技術(shù)八、新型抗體的制備技術(shù)九、抗原的制備技術(shù)

免疫學(xué)檢測與免疫學(xué)技術(shù)一、抗原抗體的檢測技術(shù)1一、概述免疫學(xué)檢測是應(yīng)用免疫學(xué)理論設(shè)計(jì)的一系列測定抗原、抗體、免疫細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子的實(shí)驗(yàn)手段及分子生物學(xué)技術(shù)在免疫學(xué)研究中的應(yīng)用。

免疫學(xué)技術(shù)的應(yīng)用極為廣泛,疾病的診斷、療效評價(jià)及理論研究等。

二、抗原抗體的檢測技術(shù)*根據(jù)反應(yīng)的基本原理與表現(xiàn)主要分為凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)和補(bǔ)體參與的各種反應(yīng)*根據(jù)抗原抗體反應(yīng)設(shè)計(jì)的試驗(yàn)還有標(biāo)記抗原(或抗體)檢測相應(yīng)物質(zhì)的標(biāo)記技術(shù)。一、概述2對機(jī)體參與免疫應(yīng)答的細(xì)胞進(jìn)行鑒定,計(jì)數(shù)及功能測定(一)細(xì)胞計(jì)數(shù)1.熒光抗體染色2.免疫酶染色技術(shù):*ABC法*APAAP法3.免疫金銀染色法(IGSS)4．免疫細(xì)胞化學(xué)法5．四聚體法6．TCR鏈測定三、免疫細(xì)胞的檢測

對機(jī)體參與免疫應(yīng)答的細(xì)胞進(jìn)行鑒定,計(jì)數(shù)3(二)免疫細(xì)胞功能的測定1.T細(xì)胞功能測定：腫瘤，病毒感染，免疫缺陷，自身免疫病等(1)細(xì)胞增殖(轉(zhuǎn)化)試驗(yàn)：可分為非特異性絲裂原和特異性抗原兩類。*絲裂原主要有PHA、ConA和PWM；*抗原刺激物有破傷風(fēng)類毒素、PPD和白色念珠菌等；*同種MHC及抗CD3單抗等*腫瘤細(xì)胞-自體淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)(2)T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗(yàn)：CTL(3)分泌功能檢測(4)T細(xì)胞功能的體內(nèi)檢測法*接觸性超敏反應(yīng)*移植物抗宿主反應(yīng)(GVHR)*遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)

(二)免疫細(xì)胞功能的測定42.B細(xì)胞功能判定(1)B細(xì)胞增殖(轉(zhuǎn)化)試驗(yàn)：*PWM、SAC，LPS（對小鼠B細(xì)胞）；*抗IgM抗體及EB病毒等(2)溶血空斑形成試驗(yàn)(3)反向溶血空斑試驗(yàn)(4)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法(ELISPOT):ELISPOT是一種可檢測抗體分泌細(xì)胞，又可測定抗體分泌量的體外實(shí)驗(yàn)方法。*此法的主要優(yōu)點(diǎn)是:①

穩(wěn)定、特異，且抗原用量少；②可同時(shí)檢測不同抗原誘導(dǎo)的抗體分泌，并可定量測定；③可檢測組織切片中分泌抗體的單個(gè)細(xì)胞。

2.B細(xì)胞功能判定53.NK細(xì)胞活性測定體外檢測NK細(xì)胞活性的方法有形態(tài)學(xué)檢查法，放射性核素釋放法，酶釋放法，化學(xué)發(fā)光法及流式細(xì)胞術(shù)等。測定人NK細(xì)胞活性常以K562細(xì)胞株作為靶細(xì)胞，測定小鼠NK細(xì)胞活性常用YAC－1細(xì)胞為靶細(xì)胞。(1)形態(tài)學(xué)檢查法(2)放射性核素釋放法：用放射性核素(51Cr、125I－UdR)標(biāo)記靶細(xì)胞。(3)酶釋放法：測定靶細(xì)胞膜受損后從胞漿內(nèi)釋放至介質(zhì)中的乳酸脫氫酶(LDH)活性。*NAG酶熒光比色法:NAG酶是細(xì)胞漿中存在的一種溶酶體酶,與其底物作用后,生成熒光產(chǎn)物,應(yīng)用熒光分光光度計(jì)測定，敏感性明顯高于LDH比色法。而且方法簡單，結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性好。3.NK細(xì)胞活性測定6(4)化學(xué)發(fā)光法(5)流式細(xì)胞術(shù)：應(yīng)用FCM檢測NK細(xì)胞活性是根據(jù)PI染料排斥法。PI滲入死亡細(xì)胞內(nèi)與DNA和RNA結(jié)合，在488nm波長激發(fā)下產(chǎn)生綠色熒光。此法既可以測定單個(gè)細(xì)胞毒活性，也可以用于總細(xì)胞毒活性試驗(yàn)。*還可利用熒光染料法,細(xì)胞光掃描法，雙標(biāo)記細(xì)胞毒法測定細(xì)胞毒性細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。

(4)化學(xué)發(fā)光法7

4．吞噬細(xì)胞功能測定(1)中性粒細(xì)胞趨化功能測定：一般采用濾膜滲透法(Boyden小室法)或瓊脂糖平板法。(2)中性粒細(xì)胞吞噬、殺菌功能測定1)顯微鏡檢法2)NBT試驗(yàn)：此項(xiàng)試驗(yàn)是測定中性粒細(xì)胞吞噬、殺菌功能的一種簡易方法。3)化學(xué)發(fā)光測定法：中性粒細(xì)胞在吞噬過程中出現(xiàn)呼吸爆發(fā),產(chǎn)生活性氧代謝產(chǎn)物。此類活性氧化基團(tuán)與細(xì)胞內(nèi)殺菌作用密切相關(guān)，同時(shí)又能激發(fā)細(xì)胞內(nèi)某些物質(zhì)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。4．吞噬細(xì)胞功能測定8(4)巨噬細(xì)胞細(xì)胞毒測定:通常取小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，以-干擾素為激活劑使其活化，作為效應(yīng)細(xì)胞。用125I-UdR標(biāo)記的DBA/2小鼠肥大細(xì)胞瘤P815作為靶細(xì)胞。(3)巨噬細(xì)胞吞噬功能測定：中藥斑蝥酒精浸液敷貼法誘發(fā)無菌性皮炎，從皮膚水泡滲出液中收集巨噬細(xì)胞，在體外進(jìn)行雞紅細(xì)胞吞噬試驗(yàn)，計(jì)算吞噬率和吞噬指數(shù)，作為判斷巨噬細(xì)胞吞噬功能的指標(biāo)。(4)巨噬細(xì)胞細(xì)胞毒測定:通常取小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，以-干擾9四、細(xì)胞因子的檢測（一）免疫學(xué)檢測法免疫學(xué)檢測的基本原理是將細(xì)胞因子作為抗原進(jìn)行定量檢測。如免疫斑點(diǎn)法、ELISA法、RIA法和免疫印跡法等均已用于細(xì)胞因子的檢測。某些細(xì)胞因子含量甚微的樣品(如腦脊液)可用免疫聚合酶鏈反應(yīng)(immuno-PCR)進(jìn)行檢測。四、細(xì)胞因子的檢測（一）免10（二）生物學(xué)測定法根據(jù)細(xì)胞因子對特定的生物學(xué)活性,應(yīng)用相應(yīng)的指示系統(tǒng),同時(shí)與標(biāo)準(zhǔn)品對比測定,從而得知樣品中細(xì)胞因子的活性水平,一般以活性單位(U/ml)表示。靶細(xì)胞可直接從組織中分離,如骨髓細(xì)胞的集落形成試驗(yàn)和胸腺細(xì)胞(脾細(xì)胞)的增殖試驗(yàn),或用體外培養(yǎng)的依賴細(xì)胞因子才能生長的細(xì)胞因子依賴株及對細(xì)胞因子殺傷敏感的細(xì)胞作為靶細(xì)胞。（二）生物學(xué)測定法111.促進(jìn)細(xì)胞增殖和增殖抑制法*多種IL、表皮生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子α、神經(jīng)生長因子、血小板衍生生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子*各種CSF作用于造血系統(tǒng)的不同細(xì)胞,可促進(jìn)其增殖及在半固體瓊脂凝膠系統(tǒng)中克隆培養(yǎng)骨髓細(xì)胞的集落形成,故可采用集落形成試驗(yàn)研究CSF的水平*常用的檢測細(xì)胞增殖的方法有3H-TdR摻入法、比色法、染色法和直接計(jì)數(shù)法等。其中測定細(xì)胞代謝酶反應(yīng)細(xì)胞增殖數(shù)的比色法包括MTT、XTT、MTS和NAG等方法。

1.促進(jìn)細(xì)胞增殖和增殖抑制法122.細(xì)胞毒活性測定法許多細(xì)胞因子(TNF)針對轉(zhuǎn)化的細(xì)胞及病毒感染的細(xì)胞具有溶細(xì)胞或抑制細(xì)胞生長的活性。2.細(xì)胞毒活性測定法133.抗病毒活性測定法常用于檢測抗病毒活性的細(xì)胞株有WISH,Hep2/c,L929,A549和MDBK等。其中WISH和Hep2/c細(xì)胞株用以檢測人干擾素,L929細(xì)胞株用于檢測小鼠干擾素,Ratec細(xì)胞株用于檢測大鼠干擾素,而MDBK細(xì)胞株則可用于檢測多種族的IFN-α和IFN-γ。常用于攻擊細(xì)胞的病毒有濾泡性口炎病毒(VSV)、鼠腦心肌炎病毒(EMCV)以及Sindbisvirus等病毒。檢測抗病毒活性的方法:測定細(xì)胞因子抑制病毒的致細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)、抑制病毒蝕斑形成或抑制病毒的產(chǎn)量等。

3.抗病毒活性測定法144.趨化活性測定法多種細(xì)胞因子具有趨化活性，分別能誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞定向遷移趨化因子誘導(dǎo)細(xì)胞移動的方式包括趨化性和化學(xué)增活現(xiàn)象。趨化性(chemotaxis)是指誘導(dǎo)細(xì)胞向趨化因子化學(xué)濃度高的方向作定向移動,可采用瓊脂糖和微孔小室趨化試驗(yàn)測定細(xì)胞因子的趨化活性；化學(xué)增活現(xiàn)象(chemokinesis)是指增強(qiáng)細(xì)胞的隨機(jī)運(yùn)動,可采用瓊脂糖小滴化學(xué)動力學(xué)試驗(yàn)檢測。

4.趨化活性測定法15(三)分子生物學(xué)測定法RNA印跡法、核酸酶保護(hù)分析、原位雜交、PCR和RealTimePCR等。亦可通過檢測細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的基因組成或mRNA量，推算出細(xì)胞因子的合成量。

(三)分子生物學(xué)測定法16(四)單個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子測定法常用的方法有反向溶血空斑試驗(yàn)(RHPA)和反向ELISA斑點(diǎn)試驗(yàn)(1)反向溶血空斑試驗(yàn)(RHPA):RHPA是一種體外檢測抗體分泌細(xì)胞的試驗(yàn),亦可用于檢測細(xì)胞因子。(2)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(ELISPOT):所用的包被抗體與酶標(biāo)抗體應(yīng)分別針對細(xì)胞因子的不同抗原決定簇(四)單個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子測定法17(五)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的檢測采用FCM免疫熒光技術(shù)可從單細(xì)胞水平檢測不同細(xì)胞亞群中的細(xì)胞因子,用兩種標(biāo)記的熒光抗體可在一種細(xì)胞內(nèi)同時(shí)測定兩種不同的細(xì)胞因子。(五)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的檢測18細(xì)胞因子受體檢測的基本技術(shù)細(xì)胞因子的廣泛生物學(xué)活性是通過與各自相應(yīng)的受體結(jié)合而發(fā)揮的。因此細(xì)胞因子受體的檢測與細(xì)胞因子檢測一樣，已成為基礎(chǔ)理論和臨床免疫學(xué)研究的一個(gè)重要內(nèi)容。

細(xì)胞因子受體檢測的基本技術(shù)19五、粘附分子的檢測某些粘附分子除表達(dá)于細(xì)胞膜表面外，還以可溶性形式存在于體液中。粘附分子的檢測方法目前大多采用免疫學(xué)技術(shù)檢查其在細(xì)胞膜上的分布和測定某些樣品中的含量。五、粘附分子的檢測20六、免疫相關(guān)基因分析

*包括各種類型的雜交技術(shù)，如轉(zhuǎn)印雜交、斑點(diǎn)雜交、原位雜交等以及PCR技術(shù)等。雜交技術(shù)主要工具是核酸探針，它是指一段用放射性核素或其他標(biāo)記物(生物素、熒光素、地高辛等)標(biāo)記，并與目的基因互補(bǔ)的DNA片段或單鏈DNA、RNA。分為cDNA探針、寡核苷酸探針、基因組DNA探針及RNA探針等。*核酸探針技術(shù)的操作主要包括：①質(zhì)粒DNA的提?。虎诎蠨NA片段的分離；③靶DNA片段的標(biāo)記；④待測樣品mRNA的提??；⑤標(biāo)記cDNA探針與待測樣品進(jìn)行雜交；⑥放射自顯影或顯色分析。六、免疫相關(guān)基因分析*包括21(一)細(xì)胞因子基因組DNA或mRNA的檢測1.Northern雜交分析2.斑點(diǎn)雜交法3.原位雜交法4.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物雜交分析是將細(xì)胞因子的mRNA經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用特異性細(xì)胞因子引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過Southernblot后，再用標(biāo)記探針檢測特異細(xì)胞因子DNA的水平。5．Southern印跡雜交6.斑點(diǎn)及狹縫印跡雜交:將DNA變性后直接點(diǎn)樣于硝酸纖維膜上再進(jìn)行雜交7.細(xì)胞因子mRNA表達(dá)的測定還可采用RT-PCR、原位雜交與原位PCR,RNA半壽期的檢測,進(jìn)行中的轉(zhuǎn)錄分析等。(一)細(xì)胞因子基因組DNA或mRNA的檢測22(二)BCR及TCR克隆性基因重排分析1．Southern印跡雜交法：僅適用于科研，而不適用于臨床診斷。2.PCR擴(kuò)增技術(shù):正常多克隆淋巴細(xì)胞群DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物含有不同長度的片段，電泳檢查呈現(xiàn)彌漫涂片狀結(jié)構(gòu)或多條帶。而單克隆性基因重排經(jīng)PCR擴(kuò)增后，產(chǎn)生明顯相同長度的片段，電泳呈現(xiàn)單一緊密折帶狀結(jié)構(gòu)*應(yīng)用PCR擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行基因診斷具有特異、敏感(1/104~1/105克隆性細(xì)胞)、快速(24h可完成)等優(yōu)點(diǎn)。*用于惡性淋巴瘤和白血病等的臨床診斷以及白血病治療后微小殘留病灶的檢測。

(二)BCR及TCR克隆性基因重排分析23(三)HLA基因分型技術(shù)1．序列特異性寡核苷酸探針PCR(PCR-SSOP)或PCR-ASO:PCR-SSOP是目前應(yīng)用最多的一種簡單、快速而又精確的HLA-Ⅱ類抗原分型方法，能鑒定所有已知序列的HLA-DR、DQ、DP等位基因，精確地分析DNA的多態(tài)性。2．限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù)：此項(xiàng)技術(shù)特別適用于個(gè)別標(biāo)本和小樣本的檢測。3．單鏈構(gòu)象多態(tài)性PCR（PCR-SSCP）：藉此可鑒別編碼HLA-Ⅱ類抗原基因的多態(tài)性。應(yīng)用PCR-SSCP可以直接比較供、受體之間HLA-Ⅱ類基因是否完全一致，且可精確到12個(gè)堿基之差，具有相對簡捷而精確的特點(diǎn)。在異基因骨髓移植的配型中已初步應(yīng)用于臨床。(三)HLA基因分型技術(shù)244．序列特異性引物PCR技術(shù)(PCR-SSP)：該法操作簡單、快速、實(shí)驗(yàn)結(jié)果容易判斷，雜合子也很易檢出。不足之處在于，為檢出所有的等位基因必須用多個(gè)引物進(jìn)行擴(kuò)增。5．指紋圖譜(PCR-fingerprinting)技術(shù)|：進(jìn)行HLA-基因分型鑒定時(shí)，將供、受體的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物混合，電泳后得出一指紋圖，再與二者各自的PCR指紋圖譜進(jìn)行比較，從中選擇出指紋圖一致的供、受體進(jìn)行移植。*PCR指紋圖譜在選擇非親緣關(guān)系的供、受體進(jìn)行骨髓和器官移植配型時(shí)，可以節(jié)省大量時(shí)間。6.SNP(單個(gè)核苷酸多態(tài)性)分析(四)補(bǔ)體基因分析(五)抗體基因分析(六)細(xì)胞膜分子基因分析4．序列特異性引物PCR技術(shù)(PCR-SSP)：該法操作簡25七、免疫標(biāo)記技術(shù)

(一)免疫熒光技術(shù)(二)放射免疫分析法(三)酶免疫技術(shù)(四)發(fā)光免疫測定七、免疫標(biāo)記技術(shù)(26八、免疫PCR(IM-PCR)技術(shù)

免疫PCR是將抗原抗體的特異性反應(yīng)與PCR技術(shù)結(jié)合起來,用以檢測微量蛋白質(zhì)的方法。免疫PCR是用DNA分子標(biāo)記特異性抗體，利用PCR可大量擴(kuò)增DNA片段的特點(diǎn)，從而將檢測靈敏度大大提高，最低檢測值可達(dá)10-21mol/L。1.直接免疫PCR是將抗原包被在固相載體上,用特異性單抗結(jié)合此抗原,再用生物素化抗體通過親合素連接生物素化DNA,然后將后者進(jìn)行PCR2.間接免疫PCR系將所測物的單抗包被在固相載體上,然后使所測抗原與之結(jié)合,再將特異性抗體生物素化,并通過親合素連結(jié)生物素化DNA分子而將后者進(jìn)行PCR

八、免疫PCR(IM-PCR)技術(shù)27九、新型抗體的制備技術(shù)

(一)對鼠源性抗體的改造1．人-鼠嵌合抗體(chimericantibody)：鼠源性單抗的V區(qū)，人免疫球蛋白的C區(qū)。

九、新型抗體的制備技術(shù)(一)28

2．人源化抗體將鼠抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)與人IgFR和C連接構(gòu)建“人源化抗體”。(1)模板替換:使用與鼠對應(yīng)部分有較大同源性的人FR替換鼠FR區(qū),例如可通過CDR移植構(gòu)建“改型抗體”(2)表面重塑:對鼠CDR及FR表面殘基進(jìn)行重塑或鑲飾,使之類似于人抗體CDR的輪廓或人FR的型式。(3)補(bǔ)償變換:在人FR選擇與CDR有互補(bǔ)作用、與抗體的親和力有密切關(guān)系或?qū)R空間結(jié)構(gòu)折疊起關(guān)鍵作用的殘基進(jìn)行改變,以補(bǔ)償完全的CDR移植(4)定位保留:通過計(jì)算機(jī)模建從現(xiàn)有的人源抗體保守序列中搜尋與鼠FR區(qū)最類似的序列,根據(jù)最簡位置模板確定鼠可變區(qū)的關(guān)鍵位置殘基,并保留所有這些位置而將其余部分進(jìn)行人源化。2．人源化抗體將鼠抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(293.小分子抗體(1)ScFv：由VH和VL中間連以1415個(gè)小肽,常用的連接肽為(Gly4Ser)3(2)VH與VL適當(dāng)部位各引入一個(gè)半胱氨酸形成以二硫鍵固定的Fv段而構(gòu)成的DsFv(3)將ScFv中兩個(gè)可變區(qū)之間的接頭縮短,使兩分子間VH和VL配對形成雙價(jià)小分子抗體(Diabody)(4)將兩種不同特異性的V基因交叉配對,則可得到雙特異性Diabody(5)在ScFv的一端加上一個(gè)雙聚化結(jié)構(gòu)亦可構(gòu)建不同類型的雙價(jià)或雙特異性小分子抗體,如Minibody等3.小分子抗體30(二)抗體庫技術(shù)(三)產(chǎn)生嵌合抗體的小鼠和產(chǎn)生人抗體的小鼠利用基因打靶和取代的方法以及轉(zhuǎn)基因技術(shù)產(chǎn)生嵌合抗體。通過轉(zhuǎn)基因、基因缺失及雜交和選擇等一系列過程，獲得雙轉(zhuǎn)染基因(人H、鏈基因)的純合小鼠。其脾、淋巴結(jié)、骨髓中的B細(xì)胞可表達(dá)人的鏈。

(二)抗體庫技術(shù)31(四)細(xì)胞內(nèi)抗體*細(xì)胞內(nèi)抗體是指在細(xì)胞內(nèi)合成并作用于細(xì)胞內(nèi)組分的抗體,亦稱為內(nèi)抗體(intrabody)。*若在抗體基因的N端或C端加入引導(dǎo)序列就能使抗體表達(dá)定位亞細(xì)胞部位,如胞漿、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或細(xì)胞核部位。*若在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)特異識別與腫瘤發(fā)生有關(guān)的癌基因編碼的抗體,即可抑制癌基因編碼產(chǎn)物的表達(dá),可用于腫瘤的治療。*細(xì)胞內(nèi)免疫用于病毒性疾病的治療*抗EGFR胞外區(qū)的ScFv-RIR,并在ScFv-RIR的C-末端連接KDEL肽,提供ER滯留

(四)細(xì)胞內(nèi)抗體32(五)基因工程抗體衍生技術(shù)1．雙特異性抗體(BsAb)或稱雙功能抗體(BfA)。2.抗體的抗原化技術(shù)：借助人源化抗體的構(gòu)建方法，以抗體V區(qū)作為分子載體來表達(dá)生物學(xué)相關(guān)的多肽或外源性抗原表位，即抗原化抗體(antigenizedantibody,AbAg)。3．抗體重組免疫毒素4.催化抗體(catalyticantibody)或抗體酶(abzyme)：將催化活性引入抗體的結(jié)合部位,產(chǎn)生一種具有抗體和酶雙功能的蛋白質(zhì),稱為抗體酶或程序性酶(programmableenzyme)。

(五)基因工程抗體衍生技術(shù)33十、雜交瘤技術(shù)與T細(xì)胞克隆技術(shù)

一、雜交瘤技術(shù)1.B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)與單抗的制備2.T細(xì)胞雜交瘤技術(shù)與其功能的研究二、T細(xì)胞克隆技術(shù)*按其特異性分為抗原特異性和非特異性T細(xì)胞克隆。*按其功能則可分為輔助性和細(xì)胞毒性T細(xì)胞克隆。(一)抗原特異性T細(xì)胞克隆(二)抗原非特異性T細(xì)胞克隆的制備(三)同種反應(yīng)性TH和CTL克隆的制備(四)腫瘤抗原特異性CTL克隆

十、雜交瘤技術(shù)與T細(xì)胞克隆技術(shù)一、雜交瘤技術(shù)34細(xì)胞凋亡的檢測一、概述細(xì)胞凋亡(apoptosis,Apo)是生物體內(nèi)無用的、老化的一些損傷細(xì)胞自動死亡的一種形式，是指在一定的生理和病理情況下,機(jī)體為維護(hù)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定,通過基因調(diào)控而使細(xì)胞自動消亡的過程。細(xì)胞凋亡的檢35二、細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死的區(qū)別*細(xì)胞壞死是細(xì)胞膜,線粒體膜結(jié)構(gòu)、流動性、滲透性及受體等均受損,進(jìn)而細(xì)胞溶解、壞死；而細(xì)胞凋亡時(shí)上述結(jié)構(gòu)和功能均保持不變；*細(xì)胞壞死時(shí),ATP和蛋白質(zhì)合成抑制及終止;細(xì)胞凋亡時(shí),ATP、mRNA和蛋白質(zhì)合成依舊,細(xì)胞第二信號系統(tǒng)仍活動;*細(xì)胞壞死時(shí),細(xì)胞DNA隨機(jī)降解,電泳不呈梯狀圖譜;細(xì)胞凋亡時(shí),DNA多降解成180～200bp或其倍數(shù)的梯狀片段,電泳呈梯狀圖譜;*細(xì)胞壞死時(shí),細(xì)胞內(nèi)容物外溢,引起局部炎癥反應(yīng)或組織損傷;細(xì)胞凋亡時(shí),細(xì)胞內(nèi)容物不外溢,所以不引起炎癥反應(yīng)或局部損傷;*細(xì)胞壞死時(shí),往往是成團(tuán)細(xì)胞死亡;細(xì)胞凋亡時(shí),在組織中呈分散狀態(tài)分布。

二、細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死的區(qū)別36三、研究細(xì)胞凋亡的意義1.細(xì)胞凋亡在腫瘤形成和治療中具有重要作用。*凋亡基因與抗凋亡基因突變→→易形成腫瘤；*免疫效應(yīng)細(xì)胞表達(dá)FasL,腫瘤細(xì)胞表達(dá)Fas→→誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡→→抗腫瘤*腫瘤細(xì)胞高表達(dá)FasL→→誘導(dǎo)免疫細(xì)胞凋亡→→抑制免疫功能→→逃避免疫監(jiān)視*腫瘤細(xì)胞低表達(dá)或不表達(dá)Fas→→逃避免疫監(jiān)視

三、研究細(xì)胞凋亡的意義372.細(xì)胞凋亡與免疫學(xué)的關(guān)系*細(xì)胞凋亡與T細(xì)胞在胸腺的發(fā)育*細(xì)胞凋亡與成熟T細(xì)胞：AICD*細(xì)胞凋亡與與B細(xì)胞*細(xì)胞凋亡與胞毒效應(yīng)3.細(xì)胞凋亡參與自身免疫病的發(fā)生4.細(xì)胞凋亡與病毒感染*抗病毒免疫防御*細(xì)胞凋亡與AIDS*細(xì)胞凋亡與病毒性肝炎2.細(xì)胞凋亡與免疫學(xué)的關(guān)系38細(xì)胞凋亡的檢測方法一、形態(tài)學(xué)方法1．普通光學(xué)顯微鏡檢測法2．熒光顯微鏡檢測法材料：①石蠟切片;②冰凍切片;③細(xì)胞學(xué)涂片。方法一：①PI染液：碘化丙啶(propidiumiodide,PI)；②DAPI染液；③AO染液：*熒光顯微鏡下觀察。PI染色選用>600nm的激發(fā)光,DAPI選用460～500nm的激發(fā)光,AO染色選用520nm的激發(fā)光。*HE染色核DNA呈藍(lán)色,而PI染色呈紅色,DAPI染色呈藍(lán)白色,AO染色呈黃綠色。凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)核濃縮,染色加深,或核染色質(zhì)呈新月形聚集于核膜一邊;晚期凋亡細(xì)胞表現(xiàn)為核碎裂成大小不等的圓形小體被細(xì)胞膜包繞,即凋亡小體。細(xì)胞凋亡的檢測方法39方法二：Hoechst33342/PI雙標(biāo)記法*在熒光顯微鏡下觀察，凋亡細(xì)胞的藍(lán)色熒光比活細(xì)胞和非凋亡細(xì)胞都要強(qiáng)，其光散射能力則降低，將二者結(jié)合起來，可以很好地鑒定凋亡細(xì)胞。壞死細(xì)胞則由于PI復(fù)染，呈紅色熒光。是目前細(xì)胞凋亡最滿意的形態(tài)學(xué)分析方法。*樣品來源培養(yǎng)細(xì)胞或離體細(xì)胞制成的單個(gè)細(xì)胞懸液。方法二：Hoechst33342/PI雙標(biāo)記法40方法三：碘化丙啶（PI）和Hoechst33342(HO)雙染法PI和HO均可使用紫外光激發(fā)，其熒光分別為紅光和藍(lán)光。對照活細(xì)胞的HO藍(lán)色熒光最強(qiáng)，而早期凋亡細(xì)胞由于其DNA降解和丟失，其HO藍(lán)色熒光較弱，也有很弱的PI紅色熒光。晚期凋亡細(xì)胞PI紅色熒光增強(qiáng)，壞死細(xì)胞PI紅色熒光最強(qiáng)，而HO藍(lán)色熒光較弱。方法三：碘化丙啶（PI）和Hoechst33342(HO)413．凋亡小體的電鏡觀察小體系由細(xì)胞膜卷曲、脫落形成的小泡,其內(nèi)包含有完整的細(xì)胞器及核片段。3．凋亡小體的電鏡觀察小體系由細(xì)胞膜卷曲、脫落形成的42二、生物化學(xué)方法電泳法DNA梯帶(DNAladder)。二、生物化學(xué)方法43三、免疫學(xué)方法(ELISA法)*細(xì)胞凋亡的發(fā)生,是由于內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的激活,核小體間區(qū)雙鏈DNA解開,產(chǎn)生單/低聚核小體片段,而核小體DNA由于與組蛋白H2A、H2B、H3和H4形成緊密復(fù)合物而不被核酸內(nèi)切酶裂解。采用雙抗體夾心酶免疫法,應(yīng)用小鼠抗DNA和抗組蛋白的單克隆抗體,與核小體片段形成夾心結(jié)構(gòu),可特異性檢測細(xì)胞溶解物中的單/低聚核小體。

三、免疫學(xué)方法(ELISA法)44四、原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(TdT或TUNEL)凋亡細(xì)胞由于內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的激活,核DNA被切割成許多雙鏈DNA片段以及高分子量DNA單鏈斷裂點(diǎn)(缺口),暴露出大量3'羥基末端,如用(TdT)將標(biāo)記的-dUTP進(jìn)行缺口末端標(biāo)記,則可原位特異地顯示出凋亡細(xì)胞。(一)熒光標(biāo)記法*采用美國Oncor公司ApopTagTM試劑盒，或德國BoehringerMannheim公司InSituCellDeathDetection試劑盒(二)酶標(biāo)記法*采用美國Oncor公司ApopTagTM-Peroxidase試劑盒

四、原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(TdT或TUNEL)45免疫學(xué)檢測與免疫學(xué)技術(shù)一、抗原抗體的檢測技術(shù)二、免疫細(xì)胞的檢測三、細(xì)胞因子的檢測四、免疫相關(guān)基因分析五、免疫標(biāo)記技術(shù)六、免疫PCR(IM-PCR)技術(shù)

七、雜交瘤技術(shù)與T細(xì)胞克隆技術(shù)八、新型抗體的制備技術(shù)九、抗原的制備技術(shù)

免疫學(xué)檢測與免疫學(xué)技術(shù)一、抗原抗體的檢測技術(shù)46一、概述免疫學(xué)檢測是應(yīng)用免疫學(xué)理論設(shè)計(jì)的一系列測定抗原、抗體、免疫細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子的實(shí)驗(yàn)手段及分子生物學(xué)技術(shù)在免疫學(xué)研究中的應(yīng)用。

免疫學(xué)技術(shù)的應(yīng)用極為廣泛,疾病的診斷、療效評價(jià)及理論研究等。

二、抗原抗體的檢測技術(shù)*根據(jù)反應(yīng)的基本原理與表現(xiàn)主要分為凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)和補(bǔ)體參與的各種反應(yīng)*根據(jù)抗原抗體反應(yīng)設(shè)計(jì)的試驗(yàn)還有標(biāo)記抗原(或抗體)檢測相應(yīng)物質(zhì)的標(biāo)記技術(shù)。一、概述47對機(jī)體參與免疫應(yīng)答的細(xì)胞進(jìn)行鑒定,計(jì)數(shù)及功能測定(一)細(xì)胞計(jì)數(shù)1.熒光抗體染色2.免疫酶染色技術(shù):*ABC法*APAAP法3.免疫金銀染色法(IGSS)4．免疫細(xì)胞化學(xué)法5．四聚體法6．TCR鏈測定三、免疫細(xì)胞的檢測

對機(jī)體參與免疫應(yīng)答的細(xì)胞進(jìn)行鑒定,計(jì)數(shù)48(二)免疫細(xì)胞功能的測定1.T細(xì)胞功能測定：腫瘤，病毒感染，免疫缺陷，自身免疫病等(1)細(xì)胞增殖(轉(zhuǎn)化)試驗(yàn)：可分為非特異性絲裂原和特異性抗原兩類。*絲裂原主要有PHA、ConA和PWM；*抗原刺激物有破傷風(fēng)類毒素、PPD和白色念珠菌等；*同種MHC及抗CD3單抗等*腫瘤細(xì)胞-自體淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)(2)T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗(yàn)：CTL(3)分泌功能檢測(4)T細(xì)胞功能的體內(nèi)檢測法*接觸性超敏反應(yīng)*移植物抗宿主反應(yīng)(GVHR)*遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)

(二)免疫細(xì)胞功能的測定492.B細(xì)胞功能判定(1)B細(xì)胞增殖(轉(zhuǎn)化)試驗(yàn)：*PWM、SAC，LPS（對小鼠B細(xì)胞）；*抗IgM抗體及EB病毒等(2)溶血空斑形成試驗(yàn)(3)反向溶血空斑試驗(yàn)(4)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法(ELISPOT):ELISPOT是一種可檢測抗體分泌細(xì)胞，又可測定抗體分泌量的體外實(shí)驗(yàn)方法。*此法的主要優(yōu)點(diǎn)是:①

穩(wěn)定、特異，且抗原用量少；②可同時(shí)檢測不同抗原誘導(dǎo)的抗體分泌，并可定量測定；③可檢測組織切片中分泌抗體的單個(gè)細(xì)胞。

2.B細(xì)胞功能判定503.NK細(xì)胞活性測定體外檢測NK細(xì)胞活性的方法有形態(tài)學(xué)檢查法，放射性核素釋放法，酶釋放法，化學(xué)發(fā)光法及流式細(xì)胞術(shù)等。測定人NK細(xì)胞活性常以K562細(xì)胞株作為靶細(xì)胞，測定小鼠NK細(xì)胞活性常用YAC－1細(xì)胞為靶細(xì)胞。(1)形態(tài)學(xué)檢查法(2)放射性核素釋放法：用放射性核素(51Cr、125I－UdR)標(biāo)記靶細(xì)胞。(3)酶釋放法：測定靶細(xì)胞膜受損后從胞漿內(nèi)釋放至介質(zhì)中的乳酸脫氫酶(LDH)活性。*NAG酶熒光比色法:NAG酶是細(xì)胞漿中存在的一種溶酶體酶,與其底物作用后,生成熒光產(chǎn)物,應(yīng)用熒光分光光度計(jì)測定，敏感性明顯高于LDH比色法。而且方法簡單，結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性好。3.NK細(xì)胞活性測定51(4)化學(xué)發(fā)光法(5)流式細(xì)胞術(shù)：應(yīng)用FCM檢測NK細(xì)胞活性是根據(jù)PI染料排斥法。PI滲入死亡細(xì)胞內(nèi)與DNA和RNA結(jié)合，在488nm波長激發(fā)下產(chǎn)生綠色熒光。此法既可以測定單個(gè)細(xì)胞毒活性，也可以用于總細(xì)胞毒活性試驗(yàn)。*還可利用熒光染料法,細(xì)胞光掃描法，雙標(biāo)記細(xì)胞毒法測定細(xì)胞毒性細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。

(4)化學(xué)發(fā)光法52

4．吞噬細(xì)胞功能測定(1)中性粒細(xì)胞趨化功能測定：一般采用濾膜滲透法(Boyden小室法)或瓊脂糖平板法。(2)中性粒細(xì)胞吞噬、殺菌功能測定1)顯微鏡檢法2)NBT試驗(yàn)：此項(xiàng)試驗(yàn)是測定中性粒細(xì)胞吞噬、殺菌功能的一種簡易方法。3)化學(xué)發(fā)光測定法：中性粒細(xì)胞在吞噬過程中出現(xiàn)呼吸爆發(fā),產(chǎn)生活性氧代謝產(chǎn)物。此類活性氧化基團(tuán)與細(xì)胞內(nèi)殺菌作用密切相關(guān)，同時(shí)又能激發(fā)細(xì)胞內(nèi)某些物質(zhì)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。4．吞噬細(xì)胞功能測定53(4)巨噬細(xì)胞細(xì)胞毒測定:通常取小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，以-干擾素為激活劑使其活化，作為效應(yīng)細(xì)胞。用125I-UdR標(biāo)記的DBA/2小鼠肥大細(xì)胞瘤P815作為靶細(xì)胞。(3)巨噬細(xì)胞吞噬功能測定：中藥斑蝥酒精浸液敷貼法誘發(fā)無菌性皮炎，從皮膚水泡滲出液中收集巨噬細(xì)胞，在體外進(jìn)行雞紅細(xì)胞吞噬試驗(yàn)，計(jì)算吞噬率和吞噬指數(shù)，作為判斷巨噬細(xì)胞吞噬功能的指標(biāo)。(4)巨噬細(xì)胞細(xì)胞毒測定:通常取小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，以-干擾54四、細(xì)胞因子的檢測（一）免疫學(xué)檢測法免疫學(xué)檢測的基本原理是將細(xì)胞因子作為抗原進(jìn)行定量檢測。如免疫斑點(diǎn)法、ELISA法、RIA法和免疫印跡法等均已用于細(xì)胞因子的檢測。某些細(xì)胞因子含量甚微的樣品(如腦脊液)可用免疫聚合酶鏈反應(yīng)(immuno-PCR)進(jìn)行檢測。四、細(xì)胞因子的檢測（一）免55（二）生物學(xué)測定法根據(jù)細(xì)胞因子對特定的生物學(xué)活性,應(yīng)用相應(yīng)的指示系統(tǒng),同時(shí)與標(biāo)準(zhǔn)品對比測定,從而得知樣品中細(xì)胞因子的活性水平,一般以活性單位(U/ml)表示。靶細(xì)胞可直接從組織中分離,如骨髓細(xì)胞的集落形成試驗(yàn)和胸腺細(xì)胞(脾細(xì)胞)的增殖試驗(yàn),或用體外培養(yǎng)的依賴細(xì)胞因子才能生長的細(xì)胞因子依賴株及對細(xì)胞因子殺傷敏感的細(xì)胞作為靶細(xì)胞。（二）生物學(xué)測定法561.促進(jìn)細(xì)胞增殖和增殖抑制法*多種IL、表皮生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子α、神經(jīng)生長因子、血小板衍生生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子*各種CSF作用于造血系統(tǒng)的不同細(xì)胞,可促進(jìn)其增殖及在半固體瓊脂凝膠系統(tǒng)中克隆培養(yǎng)骨髓細(xì)胞的集落形成,故可采用集落形成試驗(yàn)研究CSF的水平*常用的檢測細(xì)胞增殖的方法有3H-TdR摻入法、比色法、染色法和直接計(jì)數(shù)法等。其中測定細(xì)胞代謝酶反應(yīng)細(xì)胞增殖數(shù)的比色法包括MTT、XTT、MTS和NAG等方法。

1.促進(jìn)細(xì)胞增殖和增殖抑制法572.細(xì)胞毒活性測定法許多細(xì)胞因子(TNF)針對轉(zhuǎn)化的細(xì)胞及病毒感染的細(xì)胞具有溶細(xì)胞或抑制細(xì)胞生長的活性。2.細(xì)胞毒活性測定法583.抗病毒活性測定法常用于檢測抗病毒活性的細(xì)胞株有WISH,Hep2/c,L929,A549和MDBK等。其中WISH和Hep2/c細(xì)胞株用以檢測人干擾素,L929細(xì)胞株用于檢測小鼠干擾素,Ratec細(xì)胞株用于檢測大鼠干擾素,而MDBK細(xì)胞株則可用于檢測多種族的IFN-α和IFN-γ。常用于攻擊細(xì)胞的病毒有濾泡性口炎病毒(VSV)、鼠腦心肌炎病毒(EMCV)以及Sindbisvirus等病毒。檢測抗病毒活性的方法:測定細(xì)胞因子抑制病毒的致細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)、抑制病毒蝕斑形成或抑制病毒的產(chǎn)量等。

3.抗病毒活性測定法594.趨化活性測定法多種細(xì)胞因子具有趨化活性，分別能誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞定向遷移趨化因子誘導(dǎo)細(xì)胞移動的方式包括趨化性和化學(xué)增活現(xiàn)象。趨化性(chemotaxis)是指誘導(dǎo)細(xì)胞向趨化因子化學(xué)濃度高的方向作定向移動,可采用瓊脂糖和微孔小室趨化試驗(yàn)測定細(xì)胞因子的趨化活性；化學(xué)增活現(xiàn)象(chemokinesis)是指增強(qiáng)細(xì)胞的隨機(jī)運(yùn)動,可采用瓊脂糖小滴化學(xué)動力學(xué)試驗(yàn)檢測。

4.趨化活性測定法60(三)分子生物學(xué)測定法RNA印跡法、核酸酶保護(hù)分析、原位雜交、PCR和RealTimePCR等。亦可通過檢測細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的基因組成或mRNA量，推算出細(xì)胞因子的合成量。

(三)分子生物學(xué)測定法61(四)單個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子測定法常用的方法有反向溶血空斑試驗(yàn)(RHPA)和反向ELISA斑點(diǎn)試驗(yàn)(1)反向溶血空斑試驗(yàn)(RHPA):RHPA是一種體外檢測抗體分泌細(xì)胞的試驗(yàn),亦可用于檢測細(xì)胞因子。(2)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(ELISPOT):所用的包被抗體與酶標(biāo)抗體應(yīng)分別針對細(xì)胞因子的不同抗原決定簇(四)單個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子測定法62(五)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的檢測采用FCM免疫熒光技術(shù)可從單細(xì)胞水平檢測不同細(xì)胞亞群中的細(xì)胞因子,用兩種標(biāo)記的熒光抗體可在一種細(xì)胞內(nèi)同時(shí)測定兩種不同的細(xì)胞因子。(五)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的檢測63細(xì)胞因子受體檢測的基本技術(shù)細(xì)胞因子的廣泛生物學(xué)活性是通過與各自相應(yīng)的受體結(jié)合而發(fā)揮的。因此細(xì)胞因子受體的檢測與細(xì)胞因子檢測一樣，已成為基礎(chǔ)理論和臨床免疫學(xué)研究的一個(gè)重要內(nèi)容。

細(xì)胞因子受體檢測的基本技術(shù)64五、粘附分子的檢測某些粘附分子除表達(dá)于細(xì)胞膜表面外，還以可溶性形式存在于體液中。粘附分子的檢測方法目前大多采用免疫學(xué)技術(shù)檢查其在細(xì)胞膜上的分布和測定某些樣品中的含量。五、粘附分子的檢測65六、免疫相關(guān)基因分析

*包括各種類型的雜交技術(shù)，如轉(zhuǎn)印雜交、斑點(diǎn)雜交、原位雜交等以及PCR技術(shù)等。雜交技術(shù)主要工具是核酸探針，它是指一段用放射性核素或其他標(biāo)記物(生物素、熒光素、地高辛等)標(biāo)記，并與目的基因互補(bǔ)的DNA片段或單鏈DNA、RNA。分為cDNA探針、寡核苷酸探針、基因組DNA探針及RNA探針等。*核酸探針技術(shù)的操作主要包括：①質(zhì)粒DNA的提??；②靶DNA片段的分離；③靶DNA片段的標(biāo)記；④待測樣品mRNA的提取；⑤標(biāo)記cDNA探針與待測樣品進(jìn)行雜交；⑥放射自顯影或顯色分析。六、免疫相關(guān)基因分析*包括66(一)細(xì)胞因子基因組DNA或mRNA的檢測1.Northern雜交分析2.斑點(diǎn)雜交法3.原位雜交法4.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物雜交分析是將細(xì)胞因子的mRNA經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用特異性細(xì)胞因子引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過Southernblot后，再用標(biāo)記探針檢測特異細(xì)胞因子DNA的水平。5．Southern印跡雜交6.斑點(diǎn)及狹縫印跡雜交:將DNA變性后直接點(diǎn)樣于硝酸纖維膜上再進(jìn)行雜交7.細(xì)胞因子mRNA表達(dá)的測定還可采用RT-PCR、原位雜交與原位PCR,RNA半壽期的檢測,進(jìn)行中的轉(zhuǎn)錄分析等。(一)細(xì)胞因子基因組DNA或mRNA的檢測67(二)BCR及TCR克隆性基因重排分析1．Southern印跡雜交法：僅適用于科研，而不適用于臨床診斷。2.PCR擴(kuò)增技術(shù):正常多克隆淋巴細(xì)胞群DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物含有不同長度的片段，電泳檢查呈現(xiàn)彌漫涂片狀結(jié)構(gòu)或多條帶。而單克隆性基因重排經(jīng)PCR擴(kuò)增后，產(chǎn)生明顯相同長度的片段，電泳呈現(xiàn)單一緊密折帶狀結(jié)構(gòu)*應(yīng)用PCR擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行基因診斷具有特異、敏感(1/104~1/105克隆性細(xì)胞)、快速(24h可完成)等優(yōu)點(diǎn)。*用于惡性淋巴瘤和白血病等的臨床診斷以及白血病治療后微小殘留病灶的檢測。

(二)BCR及TCR克隆性基因重排分析68(三)HLA基因分型技術(shù)1．序列特異性寡核苷酸探針PCR(PCR-SSOP)或PCR-ASO:PCR-SSOP是目前應(yīng)用最多的一種簡單、快速而又精確的HLA-Ⅱ類抗原分型方法，能鑒定所有已知序列的HLA-DR、DQ、DP等位基因，精確地分析DNA的多態(tài)性。2．限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù)：此項(xiàng)技術(shù)特別適用于個(gè)別標(biāo)本和小樣本的檢測。3．單鏈構(gòu)象多態(tài)性PCR（PCR-SSCP）：藉此可鑒別編碼HLA-Ⅱ類抗原基因的多態(tài)性。應(yīng)用PCR-SSCP可以直接比較供、受體之間HLA-Ⅱ類基因是否完全一致，且可精確到12個(gè)堿基之差，具有相對簡捷而精確的特點(diǎn)。在異基因骨髓移植的配型中已初步應(yīng)用于臨床。(三)HLA基因分型技術(shù)694．序列特異性引物PCR技術(shù)(PCR-SSP)：該法操作簡單、快速、實(shí)驗(yàn)結(jié)果容易判斷，雜合子也很易檢出。不足之處在于，為檢出所有的等位基因必須用多個(gè)引物進(jìn)行擴(kuò)增。5．指紋圖譜(PCR-fingerprinting)技術(shù)|：進(jìn)行HLA-基因分型鑒定時(shí)，將供、受體的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物混合，電泳后得出一指紋圖，再與二者各自的PCR指紋圖譜進(jìn)行比較，從中選擇出指紋圖一致的供、受體進(jìn)行移植。*PCR指紋圖譜在選擇非親緣關(guān)系的供、受體進(jìn)行骨髓和器官移植配型時(shí)，可以節(jié)省大量時(shí)間。6.SNP(單個(gè)核苷酸多態(tài)性)分析(四)補(bǔ)體基因分析(五)抗體基因分析(六)細(xì)胞膜分子基因分析4．序列特異性引物PCR技術(shù)(PCR-SSP)：該法操作簡70七、免疫標(biāo)記技術(shù)

(一)免疫熒光技術(shù)(二)放射免疫分析法(三)酶免疫技術(shù)(四)發(fā)光免疫測定七、免疫標(biāo)記技術(shù)(71八、免疫PCR(IM-PCR)技術(shù)

免疫PCR是將抗原抗體的特異性反應(yīng)與PCR技術(shù)結(jié)合起來,用以檢測微量蛋白質(zhì)的方法。免疫PCR是用DNA分子標(biāo)記特異性抗體，利用PCR可大量擴(kuò)增DNA片段的特點(diǎn)，從而將檢測靈敏度大大提高，最低檢測值可達(dá)10-21mol/L。1.直接免疫PCR是將抗原包被在固相載體上,用特異性單抗結(jié)合此抗原,再用生物素化抗體通過親合素連接生物素化DNA,然后將后者進(jìn)行PCR2.間接免疫PCR系將所測物的單抗包被在固相載體上,然后使所測抗原與之結(jié)合,再將特異性抗體生物素化,并通過親合素連結(jié)生物素化DNA分子而將后者進(jìn)行PCR

八、免疫PCR(IM-PCR)技術(shù)72九、新型抗體的制備技術(shù)

(一)對鼠源性抗體的改造1．人-鼠嵌合抗體(chimericantibody)：鼠源性單抗的V區(qū)，人免疫球蛋白的C區(qū)。

九、新型抗體的制備技術(shù)(一)73

2．人源化抗體將鼠抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)與人IgFR和C連接構(gòu)建“人源化抗體”。(1)模板替換:使用與鼠對應(yīng)部分有較大同源性的人FR替換鼠FR區(qū),例如可通過CDR移植構(gòu)建“改型抗體”(2)表面重塑:對鼠CDR及FR表面殘基進(jìn)行重塑或鑲飾,使之類似于人抗體CDR的輪廓或人FR的型式。(3)補(bǔ)償變換:在人FR選擇與CDR有互補(bǔ)作用、與抗體的親和力有密切關(guān)系或?qū)R空間結(jié)構(gòu)折疊起關(guān)鍵作用的殘基進(jìn)行改變,以補(bǔ)償完全的CDR移植(4)定位保留:通過計(jì)算機(jī)模建從現(xiàn)有的人源抗體保守序列中搜尋與鼠FR區(qū)最類似的序列,根據(jù)最簡位置模板確定鼠可變區(qū)的關(guān)鍵位置殘基,并保留所有這些位置而將其余部分進(jìn)行人源化。2．人源化抗體將鼠抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(743.小分子抗體(1)ScFv：由VH和VL中間連以1415個(gè)小肽,常用的連接肽為(Gly4Ser)3(2)VH與VL適當(dāng)部位各引入一個(gè)半胱氨酸形成以二硫鍵固定的Fv段而構(gòu)成的DsFv(3)將ScFv中兩個(gè)可變區(qū)之間的接頭縮短,使兩分子間VH和VL配對形成雙價(jià)小分子抗體(Diabody)(4)將兩種不同特異性的V基因交叉配對,則可得到雙特異性Diabody(5)在ScFv的一端加上一個(gè)雙聚化結(jié)構(gòu)亦可構(gòu)建不同類型的雙價(jià)或雙特異性小分子抗體,如Minibody等3.小分子抗體75(二)抗體庫技術(shù)(三)產(chǎn)生嵌合抗體的小鼠和產(chǎn)生人抗體的小鼠利用基因打靶和取代的方法以及轉(zhuǎn)基因技術(shù)產(chǎn)生嵌合抗體。通過轉(zhuǎn)基因、基因缺失及雜交和選擇等一系列過程，獲得雙轉(zhuǎn)染基因(人H、鏈基因)的純合小鼠。其脾、淋巴結(jié)、骨髓中的B細(xì)胞可表達(dá)人的鏈。

(二)抗體庫技術(shù)76(四)細(xì)胞內(nèi)抗體*細(xì)胞內(nèi)抗體是指在細(xì)胞內(nèi)合成并作用于細(xì)胞內(nèi)組分的抗體,亦稱為內(nèi)抗體(intrabody)。*若在抗體基因的N端或C端加入引導(dǎo)序列就能使抗體表達(dá)定位亞細(xì)胞部位,如胞漿、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或細(xì)胞核部位。*若在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)特異識別與腫瘤發(fā)生有關(guān)的癌基因編碼的抗體,即可抑制癌基因編碼產(chǎn)物的表達(dá),可用于腫瘤的治療。*細(xì)胞內(nèi)免疫用于病毒性疾病的治療*抗EGFR胞外區(qū)的ScFv-RIR,并在ScFv-RIR的C-末端連接KDEL肽,提供ER滯留

(四)細(xì)胞內(nèi)抗體77(五)基因工程抗體衍生技術(shù)1．雙特異性抗體(BsAb)或稱雙功能抗體(BfA)。2.抗體的抗原化技術(shù)：借助人源化抗體的構(gòu)建方法，以抗體V區(qū)作為分子載體來表達(dá)生物學(xué)相關(guān)的多肽或外源性抗原表位，即抗原化抗體(antigenizedantibody,AbAg)。3．抗體重組免疫毒素4.催化抗體(catalyticantibody)或抗體酶(abzyme)：將催化活性引入抗體的結(jié)合部位,產(chǎn)生一種具有抗體和酶雙功能的蛋白質(zhì),稱為抗體酶或程序性酶(programmableenzyme)。

(五)基因工程抗體衍生技術(shù)78十、雜交瘤技術(shù)與T細(xì)胞克隆技術(shù)

一、雜交瘤技術(shù)1.B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)與單抗的制備2.T細(xì)胞雜交瘤技術(shù)與其功能的研究二、T細(xì)胞克隆技術(shù)*按其特異性分為抗原特異性和非特異性T細(xì)胞克隆。*按其功能則可分為輔助性和細(xì)胞毒性T細(xì)胞克隆。(一)抗原特異性T細(xì)胞克隆(二)抗原非特異性T細(xì)胞克隆的制備(三)同種反應(yīng)性TH和CTL克隆的制備(四)腫瘤抗原特異性CTL克隆

十、雜交瘤技術(shù)與T細(xì)胞克隆技術(shù)一、雜交瘤技術(shù)79細(xì)胞凋亡的檢測一、概述細(xì)胞凋亡(apoptosis,Apo)是生物體內(nèi)無用的、老化的一些損傷細(xì)胞自動死亡的一種形式，是指在一定的生理和病理情況下,機(jī)體為維護(hù)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定,通過基因調(diào)控而使細(xì)胞自動消亡的過程。細(xì)胞凋亡的檢80二、細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死的區(qū)別*細(xì)胞壞死是細(xì)胞膜,線粒體膜結(jié)構(gòu)、流動性、滲透性及受體等均受損,