鄰位連接技術

ProximityLigationAssayproximityligationassay(鄰位連接技術,PLA)：一種高靈敏度的蛋白質檢測技術。鄰位連接技術(proximityligationassay,PLA)被建立。該技術采用核酸適體(aptamer)或單/多克隆抗體-核酸復合物作為鄰位連接探針(proximityprobes)。當一對鄰位探針同時識別同一個目標蛋白分子時，它們將在空間位置上相互臨近，通過連接反應形成一段可擴增的DNA標簽序列，該標簽序列能夠反映待測蛋白的種類及濃度。該技術將對蛋白質的檢測轉變?yōu)閷NA核酸序列的檢測，實現了特殊蛋白質的檢測,定量及定位。美國俄亥俄州立大學的研究人員近日開發(fā)出一種新技術，能同時觀察細胞中的基因數量和蛋白表達。此技術能夠詳細分析基因狀態(tài)以及相應蛋白表達之間的關聯，并更透徹地了解癌癥及其他復雜疾病。該成果發(fā)表在《神經腫瘤》（Neuro-Oncology）上。這種新技術稱為熒光原位基因蛋白分析（fluorescentinsitugeneproteinassay）。它將傳統的熒光原位雜交（FISH）與原位鄰位連接分析（insituproximityligationassay，簡稱PLA）相結合。PLA分析采用核酸適體（aptamer）或單/多克隆抗體-核酸復合物作為鄰位連接探針。當一對鄰位探針同時識別同一個目標蛋白分子時，它們將在空間位置上相互臨近，通過連接反應形成一段可擴增的DNA標簽序列，該標簽序列能夠反映待測蛋白的種類及濃度。文章的作者之一，俄亥俄州立大學的ArnabChakravarti博士表示：“據我所知，這是目前第一個技術，能讓我們了解同一細胞中的基因活性和相應蛋白表達。了解腫瘤中的基因和蛋白表達變化，有助于我們了解是什么驅動了腫瘤行為?！蔽恼碌耐ㄓ嵶髡?，亞拉巴馬大學副教授MarkusBredel及其同事首先分析了固定的人膠質母細胞瘤細胞，然后分析了石蠟包埋的人膠質母細胞瘤組織。在這兩個分析中，他們都發(fā)現了一種表皮生長因子受體基因的突變形式（EGFRvIII）的過表達，并在膠質母細胞瘤中發(fā)現了截短蛋白。他們認為，這種方法有潛力詳細分析細胞和組織中癌基因狀態(tài)及相應蛋白表達之間的關聯。他們表明，熒光原位基因蛋白分析能夠在細胞水平分辨癌基因和蛋白，這對于異質性疾?。ㄈ绨┌Y）特別重要。因表觀遺傳學和轉錄后調控的作用，這種方法對癌癥研究很有用。它將基因和蛋白信息相關聯，能提高生物標志物篩選的可靠性。它還能輔助治療決策，因為有時只篩選基因或蛋白產生了不確定的結果。更多閱讀《神經腫瘤》發(fā)表論文摘要（英文）Gene–proteincorrelationinsinglecellsJaclynJ.Renfrow,AdrienneC.Scheck,NeilS.Dhawan,PaulJ.Lukac,HannesVogel,JamesP.Chandler,JeffreyJ.Raizer,GriffithR.Harsh,ArnabChakravartiandMarkusBredel?AbstractWepresentanovelmethodologycombiningtraditionalfluorescentinsituhybridizationwithaninsituproteindetectiontechnologycalledproximityligationassay.Thismethodhaspotentialtoperformadetailedanalysisoftherelationshipbetweengenestatusandcorrespondingproteinexpressionincellsandtissues.Wedemonstratethatthefluorescentinsitugeneproteinassaymethodologyiscapableofresolvinggeneandproteinpatternssimultaneouslyonacell-by-cellbasis.抗體滴度抗體滴度定義用來衡量某種抗體（antibody)識別特定抗原決定部位(epitope)所需要的最低濃度（也即最大稀釋度)。一般表示為：仍能產生陽性結果的最大稀釋度。通常通過ELISA方法來檢測抗原滴度。打個比方，通過間接庫姆伯斯試驗（indirectCoombstest）檢測一個孕婦血清中anti-Rh抗體。一個患者可能報告通過此試驗檢出的抗體滴度為16，這表示只要血清的稀釋度不超過1/16（1份比例的血清和15份比例的稀釋液），此試驗都能得到陽性結果，即可識別出抗原。如果稀釋度超過1/16，則檢出的結果皆為陰性，即抗體無法識別抗原。還有可能發(fā)生的情況是，幾周過后，同樣一位患者可能檢測出抗體滴度達到32（1份比例的血清和31份比例的稀釋液）。這可能是因為孕婦體內產生了更多的anti-Rh抗體，以至于即使更高的稀釋度也能得到陽性結果。抗核抗體抗核抗體（antinuclearantibody，ANA）又稱抗核酸抗原抗體，是一組將自身真核細胞的各種成分脫氧核糖核蛋白（DNP）、DNA、可提取的核抗原（ENA）和RNA等作為靶抗原的自身抗體的總稱，能與所有動物的細胞核發(fā)生反應，主要存在于血清中，也可存在于胸水、關節(jié)滑膜液和尿液中?？购丝贵w在多種自身免疫病中均呈不同程度的陽性率，如系統性紅斑狼瘡（SLE，95%~100%）、類風濕性關節(jié)炎（RA，10%~20%）、混合性結締組織?。∕CTD，80%~100%）、干燥綜合癥（SS,10%~40%）、全身性硬皮?。?5%~90%）、狼瘡性肝炎（95%~100%）、原發(fā)性膽汁性肝硬化（95%~100%）等，但經皮質激素治療后，陽性率可降低。抗核抗體在類風濕病人中約有20%～50%IgG型ANA呈陽性，小兒類風濕ANA的陽性率約19%～35%，伴發(fā)虹膜睫狀體炎者陽性率高（50%~90%），故ANA陽性預示類風濕有發(fā)生慢性睫狀體炎的可能。已發(fā)現75%類風濕病人有多形核白細胞的特異性ANA或抗中性粒細胞胞漿抗體（ANCA）可使白細胞核受到破壞解釋抗核抗體是一組對細胞核內的DNA，RNA，蛋白或這些物質的分子復合物的自身抗體。按其核內各個分子的性能不同可將各ANA區(qū)分開來，如(一)抗DNA抗體，（二）抗組蛋白抗體，（三）抗非組蛋白抗體，（四）抗核仁抗體等。每一大類又因不同抗原特性而再分為許多種類。因此ANA在廣義上是一組各有不同臨床意義的自身抗體，更確切的名稱應為抗核抗體譜。ANA主要存在于IgG，也見于IgM、IgA，甚至LgD及LgE中。常見的核免疫熒光杭核抗體試驗有以下幾種圖形：（1）均質型：核質染色均勻一致，這種染色型常與抗組蛋白和抗DNA抗體有關；（2）斑點型：核質染色呈斑點狀，抗可提取性核抗原（ENA）抗體常呈這種染色型；（3）周邊型：熒光染色圍繞在核膜周圍，它與抗DNA抗體有關；（4）核仁型：僅有核仁染色，具有抗4-6sRNA抗體呈現這種染色型；（5）著絲點型：在體外培養(yǎng)的細胞株（喉癌細胞）在核分裂相期時，可見到熒光染色的著絲點排列成特殊圖型，而在鼠肝做底物中看不到此類圖型，而被遺漏。抗體分類抗核抗體的分類，由于核抗原不同，有多種不同的ANA?？笵NA抗體抗DNA抗體有抗雙鏈DNA（dsDNA）和抗單鏈(ssDNA)抗體之分。抗dsDNA抗體與SLE的關系密切，且隨疾病的活動度而升降，病情好轉者其滴度多下降甚或轉陰。抗ssDNA抗體則與抗dsDNA不同，可在多種疾病出現，包括一些非自身免疫性疾病，如細菌和病毒感染。故在臨床上無實用價值。而抗dsDNA抗體被認為是紅斑狼瘡（SLE）所特有?？笵NA的自身抗體在SLE發(fā)病中起一定作用。在一些SLE患者，DNA大分子存在于循環(huán)中或粘附于多種器官的微血管結構，這些循環(huán)或器官原位抗原型DNA均可與循環(huán)自身抗體發(fā)生反應，形成免疫復合物，激活炎癥系統，在一些器官如腎臟，肺和腦組織引起免疫復合物介導的疾病，導致組織損傷?？箍商崛〉暮丝乖╡xtractablenuclearantigen.ENA）抗體此抗體原經鹽水或磷酸緩沖液處理，易從胞核中提取出來，且不含DNA。應用免疫熒光技術，抗ENA抗體型染色多呈斑點型。此類抗原分為九種，故產生九種相應抗體。（1）抗核糖核蛋白抗體(antiribonucleoprotein；抗RNP抗體)：抗原來源與SM相同。它對去氧核糖核酸酶不敏感，但對核糖核酸酶，胰酶敏感。1972年把它作為診斷混合性結締組織?。∕CTD）的重要血清學依據。但以后發(fā)現本抗體可在多種風濕性疾病出現，不具備對某個病的特異性，但有助于鑒別結締組織病和非結締組織病?？购薘NP抗體見于近32%的SLE患者，幾乎見于所有MCTD患者。（2）抗SM抗體：SM系一患者Smith的簡稱。1966年Tan&Kunkel首先在患者Smith體中發(fā)現?？乖瓉碓从谛∨＃眯叵?，人脾等組織的一種酸性糖蛋白?？筍M抗體可見于1/3或以上的SLE患者，不出現于其他疾病中，對SLE診斷有特異性，成為很有價值的SLE診斷標志，但無此抗體不能排除診斷。（3）抗SS-A抗體：系在發(fā)現Sjogren氏綜合征（SS）的"A"抗原后而命名，主要見于SS。本抗原可以從人、牛、豬脾中提取。它除存在核內外，也存在于細胞漿內。對胰酶敏感，對核糖核酸酶抵抗，能耐熱（56度）。（4）抗Ha抗體：抗Ha抗體可與小牛胸腺可溶性核提取物(以及小牛和鼠的肝提取物)起反應。見于SS患者,亦稱之為SS-B抗體.應用沉淀素反應，補體結合以及熒光技術檢測。多數人認為13%SLE及33%SS患者有抗Ha沉淀性抗體。（5）抗PM-1抗體：系多發(fā)性肌炎的特異性抗體。抗原系小牛胸腺核提取物，有人暫稱之為PM-1。最初有人應用補體結合抑制試驗，確定該抗體特性，在皮肌類患者中發(fā)現PM-1抗體。有人測定在多發(fā)性肌類患者陽性率13.6%，皮肌類（DM）20%，系統性硬化并肌炎25%，SLE并肌炎偶有陽性，在其他疾病和正常人均陰性。說明本抗體對肌炎診斷有一定特異性。（6）抗MA1抗體：為發(fā)現抗核酸蛋白抗原的抗體，稱之為抗MA1抗體。該抗體只出現于某些嚴重的SLE患者中。（7）抗Scl-70抗體：因出現在硬皮病且其分子量為70000，故名?？乖瓰閴A性非組蛋白，北京協和醫(yī)院對系統性硬化用免疫雙擴散法測定得抗Scl-70抗體陽性率為60%。在其他結締組織和非結締組織病偶有陽性，而正常人均陰性，說明本抗體有較高的特異性，是系統性硬化的標記抗體。（8）抗Jo-1抗體：因患者而命名。國外報道在多發(fā)性肌炎（PM）患者陽性率為30-50%，合并有肺間質纖維化的肌炎則達60%，而在皮肌炎（DM）患者則低于10%，在其他疾病均陰性。（9）抗Ku抗體：因患者命名，國外報道本抗體多見于合并有肌炎的系統性硬化患者，陽性率達55%。總之，抗PM-1，抗Jo-1，抗Ku都與肌炎有關?？菇M蛋白抗體組蛋白是一組堿性蛋白質，含有稍高量的賴氨酸及精氨酸。是與DNA形成的復合物，結合成DNA一組蛋白。組蛋白抗體見于藥物誘發(fā)的SLE。國外報道，用免疫熒光三步法測23例藥物致狼瘡陽性率為96%，12例SLE中42%陽性。北京協和醫(yī)院以同樣方法檢測488例服用異煙肼，68例服用苯妥英鈉，40例服用復降片（內含肼苯噠嗪），都在服用6個月以上者和另133例服他巴唑3個月以上者，無一例查到本抗體。這種差異可能與我國服用肼苯噠嗪和普魯卡因酰胺的患者較少之故，也不能除外人種不同而造成的差異?？怪z點抗體其抗原為緊附于染色體著絲點的DNA蛋白質。因此需要選擇分裂相活躍的細胞作為底物，這種細胞的著絲點較易被暴露。多選用人喉癌上皮細胞（HEP-2），其優(yōu)點是核大，分裂相多。國外報道本抗體多見于CREST綜合征（即表現為軟組織鈣化，雷諾現象，食管功能低下，指端硬化，毛細血管擴張）。陽性率達90%以上，稱之為CREST的標記抗體。根據協和醫(yī)院觀察測定結果，我國系統性硬化絕大部分是彌散型，CREST型極少見；抗著絲點抗體的陽性率在系統性硬化為20%，CREST型38%，彌散型10%，說明它不一定是CREST型的標記抗體?？购巳士贵w抗核仁抗體是一組對核仁不同RNA成分的抗體。由于成分（4-6sRNA）不同，因此構成斑塊，斑點，均質等不同圖型。本核體在以HEP-2細胞為底物間接免疫熒光檢查為明顯。協和醫(yī)院免疫組的陽性率是PSS38.5%，SLE6.1%，RA15.3%，（陽性者都合并有指端硬化），SS8.6%，PM/DM10.0%，雷諾現象25%，其他結締組織病和正常人均陰性?？购巳士贵w不僅在PSS最多見，且滴度亦高，故它對PSS診斷有一定的幫助。抗核抗體的檢測在自身免疫病的臨床診斷、鑒別診斷、評價療效和預后估計中具有較大的意義，因此常將抗核抗體的檢測作為自身免疫病的重要初篩試驗?？贵w意義臨床意義SLE：約99%（86%～100%）的活動期SLE病人ANA陽性，其滴度也常為1:80，但它的特異性差。對于未經治療的疑似患者，多次檢查抗核抗體，若結果陰性，應考慮其他疾病的可能。ANA陽性本身不能確診任何疾病，但ANA陽性且伴有特征性狼瘡癥狀則支持狼瘡診斷。ANA陰性幾乎可除外SLE的診斷。但應注意有5%的SLE病人ANA可為陰性，這其中大部分為抗SSA抗體、抗SSB抗體陽性，因為測定ANA通常用鼠肝或鼠腎做底物，而這些組織核內含SSA、SSB、Jo-1、rRNP抗原相對較少，所以不易測出其相應抗體?？杉幼鋈撕戆┥掀ぜ毎麨榈孜锏姆椒ㄟM行檢測。陽性意義抗核抗體譜包括抗核抗體（ANA）、抗DNA抗體、抗核內可溶性抗原抗體（ENA）。ENA又包括抗史密斯抗體（Sm）、抗核糖核蛋白體（RNP）抗體、抗干燥綜合征A（SSA/Ro）抗體、抗干燥綜合征B（SSB/La）抗體、抗硬皮病-70（Scl-70）抗體。臨床意義為：[1]ANA：ANA為一系列抗細胞核抗原的自身抗體的總稱。一般應用免疫熒光的方法檢測。根據核熒光的類型分為以下幾種類型：①周邊型（M型）：核周邊的熒光增強呈環(huán)狀。M型的ANA主要有抗雙鏈DNA抗體組成，故高滴度的M型ANA幾乎僅見于SLE，因此有助于SLE的診斷。②均質型（H型）：整個細胞核呈一片模糊而均勻的熒光。H型的ANA主要有抗脫氧核蛋白抗體組成。高滴度的H型ANA主要見于SLE，而低滴度H型ANA偶可見于藥物性狼瘡，JRA等其他自身免疫性疾病。③斑點型（S型）：核內熒光呈顆粒狀。是有抗Sm抗體，抗SSB/La抗體、抗Scl-70抗體等多種抗體組成。因此S型ANA可見于SLE，混合性結締組織?。∕CTD），硬皮?。≒SS），干燥綜合征（SS），多法性肌炎及皮肌炎（PM或DM）等自身免疫病。[2]抗DNA抗體：抗DNA抗體主要為抗雙鏈DNA（ds-DNA）抗體?？筪s-DNA抗體主要見于SLE患兒，其他疾病及正常人很少出現，是SLE的診斷標準之一。高滴度的抗ds-DNA抗體不僅表示疾病的活動性，而且提示疾病累及腎臟的可能性。[3]ENA：①抗Sm抗體：其抗原主要為U簇小分子細胞核糖核蛋白微粒?？筍m抗體是SLE的特異性抗體，為SLE的診斷指標之一。Sm抗體與狼瘡的腎臟和中樞神經病變有關。②抗RNP抗體：其抗原主要為U1小分子細胞核糖核蛋白粒子，主要見于混合結締組織病，患者SLE、PSS或DM的臨床表現，高滴度的RNP抗體為混合結締組織病的標志。③抗SSA/Ro抗體：抗SSA抗體主要參與皮膚的病理損害，引起重度過敏為特征的急性皮膚型狼瘡的皮損，當母體血清中含有IgG類的抗SSA抗體，可引起新生兒狼瘡綜合征，出現典型的SLE皮損，該抗體還可以與胎兒的心臟的傳導系統結合，導致新生兒先天性心臟完全型傳導組滯。④抗SSB/La抗體：該抗體是公認的干燥綜合征的標志抗體，其他免疫性疾病如果發(fā)現抗SSB抗體陽性，患者一般有繼發(fā)性干燥綜合征。⑤抗Scl-70抗體：其僅見于硬皮病，是硬皮病的特異性抗體。因此你還要進一步檢查查明引抗核抗體陽性的病因。檢測方法由于ANA的復雜性及多樣性，故測定方法繁多。ANA常用的方法有免疫熒光法、放射免疫法、ELISA、免疫雙擴散、對流免疫電泳及免疫印跡技術等。1．免疫熒光法檢測血清總ANA最常用的方法是熒光免疫組化法。多用小鼠肝切片或印片作為細胞核基質，結果比較穩(wěn)定可靠，在熒光顯微鏡下見到的細胞核有熒光著色為陽性反應。如將患者血清先進行不同比例的稀釋，可以做大致的定量試驗，在1:80稀釋仍然雖陽性時，對SLE的診斷有較大的參考價值。在油鏡下觀察結果，可以將ANA陽性的熒光現象分成4種主要的熒光核型，核型的確定對臨床診斷有進一步的參考價值。①周邊型表示抗DNA抗體存在；②均質型表示有抗DNP抗體；③斑點（顆粒）型多為抗ENA抗體；④核仁型多為抗核小體抗體。SLE患者常出現周邊型、勻質型或混合型，斑點型多見于混合結締組織病，而硬皮病多為核仁型；周邊型對SLE有較高的特異性。有人用錐蟲或血鞭毛蟲（例如綠蠅短膜蟲試驗）作基質測定抗dsDNA抗體，因為這些血寄生蟲的動基體內含大量的純dsNDA，無其他抗原干擾；在陽性結果時，可見鞭毛一端的動基體顯示清晰的熒光。因此該試驗用于測定抗dsDNA抗體具有特異性強和敏感性高的優(yōu)點。另外，短膜蟲對人畜無害，可以人工養(yǎng)殖，來源方便，值得推廣。2．放射免疫法常用檢測抗DNA抗體，有Farr法及過濾法。①Farr法的原理為用同位素標記DNA，被標記的DNA和被檢血清的抗DNA抗體結合，經50%硫酸銨飽和液沉淀，然后比較沉淀物和上清液中的放射活性，從而得出DNA結合活性，一般結合率大于20%為陽性。②過濾法是在分離結合物時用纖維素酯薄膜濾器（孔徑為0.45μm）進行過濾，游離的DNA被濾去而與抗體結合的復合物被阻留在濾膜上。3．ELISA臨床上主要是應用間接ELISA檢測抗dsDNA抗體，其重復性及敏感性均較對流免疫電泳及雙擴散為高。已有試劑盒供應。4．免疫印跡（immunoblotting）先將混合抗原作凝膠電泳，分離開不同的區(qū)帶，然將這些帶轉印到硝酸纖維素膜上，最后用酸標抗體或放射性同位素標記抗體進行檢測和分析。由于該試驗不需純化的單個抗原，可在同一固相上作多項分析檢測，靈敏度高，特異性強。故已廣泛用于自身免疫病患者血清中多種自身抗體的檢測，如檢測抗Sm抗體、抗RNP抗體、抗SS-A抗體及SS-B抗體等。另外，還可用傳統的瓊脂雙向擴散法、對流免疫電泳法、間接血凝法和補體結合試驗等。PAS染色法概況PAS染色法（PeriodicAcid-Schiffstain）在組織學上，主要用來檢測組織中的糖類。過碘酸把糖類相鄰兩個碳上的羥基氧化成醛基，再用Schiff試劑和醛基反應使呈現紫紅色。原理PAS染色又稱過碘酸雪夫染色，糖原染色。一般用來顯示糖元和其它多糖物質。原理：過碘酸能使細胞內的多糖乙二醇基氧化成二醛，再與Schiff氏液的無色品紅結合，紅色，定位于胞漿上。應用隨著醫(yī)學實驗技術的發(fā)展，糖原染色應用的范圍更加廣泛，如用以證明與鑒別細胞內空泡狀的性質，心肌病變及其他心血管疾病的診斷，糖原累積病診斷和研究，糖尿病的診斷和研究，用于某些腫瘤的診斷等。除用于糖原的鑒定和黏液的顯示外，還可以觀察腎小球基底膜、結腸杯狀細胞中性黏液物質、阿米巴滋養(yǎng)體和霉菌的著色。臨床診斷、分類和治療提供了重要的依據方法固定液Carnoy固定液：純酒精60ml冰醋酸10ml氯仿30ml,也可以選用75%酒精.液配制1)過碘酸酒清夜配法:過碘酸(HIO.2HO)0.4g95%酒精35mlM/5醋酸鈉(2.72g+蒸餾水100ml)5ml蒸餾水10ml保存于冰箱內,用棕色瓶,可用兩周.2)Schiff氏液:0.5克堿性品紅加入100毫升蒸餾水中,時時搖動三角瓶5分鐘,使之充分溶解.冷卻至50℃后過濾加入10毫升1N鹽酸.冷卻至25℃,加入0.5-1克偏重硫酸鈉,在室溫中至少靜置24小時,然后密封冰箱保存.3)Schiff氏酒精液配置Schiff氏液11.5ml1NHCI0.5ml純酒精23ml4)亞硫酸水1%偏重亞硫酸鈉10ml1NHCI10ml蒸餾水180ml的樹膠溶解。5）哈瑞或邁耶蘇木精略染色步驟1.石蠟切片脫蠟至水（細胞涂片，冰凍切片直接水洗）2.蒸餾水洗3.過