固相膜免疫測定課件

第十二第一節(jié)概述一、免疫測定分類二、免疫測定原理三、固相免疫測定四、固相膜的特點五、常用的固相膜六、固相膜的技術(shù)要求第十二章固相膜免疫測定第十二第一節(jié)概述第十二章固相膜免疫測定1第二節(jié)免疫金標記技術(shù)一、膠體金的制備第三節(jié)膜載體免疫測定的種類與原理一、膜固相免疫測定的特點二、固相微孔膜測定種類三、免疫滲濾試驗和免疫層析試驗四、酶聯(lián)免疫斑點試驗五、免疫印跡六、放射免疫沉淀試驗思考題小結(jié)第二節(jié)免疫金標記技術(shù)思考題2隨著免疫學技術(shù)和相關(guān)生物化學技術(shù)的發(fā)展，檢測方法上派生出了多種類型的固相膜免疫快速檢測試驗。該類試驗的最大特點是不需要大型設(shè)備，對檢測人員稍加培訓即能掌握操作要求和判定標準。隨著免疫學技術(shù)和相關(guān)生物化學技術(shù)的發(fā)展，檢測方法上3

第一節(jié)概述標記免疫測定放射免疫測定1960’酶免疫測定1970’熒光免疫測定1980’－1990’化學發(fā)光免疫測定1990’－膜固相免疫測定1990’－第一節(jié)概述4一、免疫測定分類免疫濁度測定Ag+AbAgAb+Ab標記免疫測定Ag+Ab*AgAb*+Ab*（B）（F）一、免疫測定分類免疫濁度測定5二、免疫測定原理利用抗原抗體反應(yīng)檢測標本中微量物質(zhì)抗原+抗體抗原抗體復合物Ag+AbAg*Ab二、免疫測定原理利用抗原抗體反應(yīng)檢測標本中微量物質(zhì)6三、固相免疫測定B與F分離

Ab*Ab*Ag+Ag+Ab*AbAb三、固相免疫測定B與F分離Ab*7四、固相膜的特點多孔性

毛細管作用非共價鍵高度吸附抗體或抗原

高度敏感性易于漂洗

操作簡便四、固相膜的特點8五、常用的固相膜玻璃纖維素(fiberglass)膜尼龍(nylon)膜聚偏氟乙稀(polyvinylidenefluoride，PVDF)膜硝酸纖維素（nitrocellulose，NC）膜五、常用的固相膜玻璃纖維素(fiberglass)膜9六、固相膜的技術(shù)要求孔徑：0.2~0.6μm流速：以ml/cm2/min表示蛋白質(zhì)結(jié)合力：吸附力很強，以μg/cm2表示均一性六、固相膜的技術(shù)要求孔徑：0.2~0.6μm10固相NC膜固相NC膜11第二節(jié)免疫金標記技術(shù)(Immunogoldlabellingtechique)

是以膠體金作為標記物的免疫標記技術(shù)?；驹碛媒鹑苣z標記蛋白質(zhì)，膠體金顆粒具有高電子密度的特性，故在金標蛋白的抗原抗體結(jié)合處，顯微鏡下可見黑褐色顆粒；當這些標記物在相應(yīng)的標記處大量聚集時，可在載體膜上呈現(xiàn)肉眼可見紅色或粉紅色斑點，從而用于抗原或抗體物質(zhì)的定位或定性。第二節(jié)免疫金標記技術(shù)(Immunogoldlabelli12膠體金（colloidalgold）指金微小粒子（1－100nm）分散在溶液中所形成的金溶液。是由金鹽被還原成原金后形成的金顆粒懸液。也稱金溶膠（goldsolution）。技術(shù)類型：1.金免疫測定技術(shù)2.金免疫組化技術(shù)膠體金（colloidalgold）指金微小粒子（1－1013一、膠體金制備

膠體金（colloidalgold）的制備一般采用還原法，常用的還原劑有檸檬酸鈉、鞣酸、抗壞血酸、白磷、硼氫化鈉等。向一定濃度的金溶液內(nèi)加入一定量的還原劑使金離子還原成金原子，形成金顆粒懸液。一、膠體金制備膠體金（colloidalgold）的制備14

膠體金的制備方法

原理：向一定濃度的氯金酸溶液內(nèi)加入一定量的還原劑使金離子變成金原子，形成金顆粒懸液。

配HAuC14水溶液加熱沸檸檬酸三鈉攪動加熱沸（約2～3min*）冷卻加蒸餾水至原體積。見淡黃色的氯金酸水溶液在檸檬酸鈉加入后很快變灰色，續(xù)而轉(zhuǎn)成黑色，隨后逐漸穩(wěn)定成紅色。通過改變檸檬酸鈉的用量可制得不同大小的膠體金顆粒膠體金的制備方法原理：向一定濃度的氯金酸溶液內(nèi)加入一定量15膠體金的制備及特性膠體金粒徑1%檸檬酸鈉加入量膠體金特性（nm)（ml)*呈色lmax(nm)162.00橙色51824.51.50橙紅色522411.00紅色52571.50.70紫色535*還原100ml0.01%HAuCl4所需量膠體金的制備及特性膠體金粒徑1%檸檬酸鈉加入量膠體金特性（16

制備膠體金的注意事項（1）氯金酸易潮解，應(yīng)干燥、避光保存。（2）氯金酸對金屬有強烈的腐蝕性，不應(yīng)使用金屬藥匙稱量氯金酸。（3）制備膠體金應(yīng)用雙蒸/三蒸餾水，或者是高質(zhì)量的去離子水。（4）玻璃容器必須是絕對清潔的，最好是經(jīng)硅化處理的。制備膠體金的注意事項（1）氯金酸易潮解，應(yīng)干燥、避光保存。17

膠體金的保存潔凈的玻璃器皿中可較長時間保存；少許防腐劑（如0.02％NaN3）可有利于保存。膠體金的鑒定：肉眼、分光光度計、電鏡等方法觀察應(yīng)為清亮透明的液體若膠體金混濁或液體表面有漂浮物，則制備的膠體金有較多的凝集顆粒膠體金的保存膠體金的鑒定：18膠體金（ColloidalGold）

15~60nm優(yōu)質(zhì)劣質(zhì)膠體金（ColloidalGold）

15~60n19免疫金的制備免疫金（immunogold）：是指膠體金與抗原或抗體等的結(jié)合物,在免疫組織化學技術(shù)中，習慣上要稱之為金探針。制備方法：1.膠體金溶液的pH值調(diào)整2．蛋白質(zhì)最適標記量的確定3．標記過程4．離心去除未結(jié)合的蛋白質(zhì)，反復洗滌2～4次5.免疫金最終用稀釋液配成工作濃度保存

免疫金的制備免疫金（immunogold）：是指膠體金與抗原20膠體金結(jié)合物（Conjugate）膠體金結(jié)合物（Conjugate）21膜固相免疫測定的特點第三節(jié)膜載體免疫測定的種類與原理優(yōu)點不足之處簡便，快速敏感度略低，價格略高（與ELISA比）單份測定精密度較差，質(zhì)控困難保存期長（優(yōu)質(zhì)試劑）穩(wěn)定性較差（普通試劑）可測定物范圍廣（主要為定性試驗）不易制備定量、半定量試劑感染性疾病的診斷妊娠、排卵的診斷腫瘤標志；心肌標志；濫用藥物膜固相免疫測定的特點第三節(jié)膜載體免疫測定的種類與原理優(yōu)點不22固相微孔膜測定種類斑點金免疫滲濾試驗(dotimmunogoldfiltrationassay,DIGFA)免疫層析試驗（immunochromatographyassay,ICA）斑點ELISA

(dotenzymelinkedimmunosorbentassay,Dot-ELISA)酶聯(lián)免疫斑點試驗(enzymelinkedimmunospot,ELISPOT)

免疫印跡法(immunoblottingtest,IBT)

放射免疫沉淀試驗(radioimmunoprecipitationassay,RIPA)

固相微孔膜測定種類斑點金免疫滲濾試驗(dotimmunog23一、斑點金免疫滲濾試驗

（dotimmunogodlfitrationassay,DIGFA

原理：將抗原或抗體點加在固相載體NC膜上，制成的包被微孔濾膜貼置于吸水材料上，依次滴加在膜上的標本、免疫金、及洗滌液等液體很快滲入吸水材料中，最后陽性反應(yīng)在膜上呈現(xiàn)紅色斑點。

特點：快速、簡便、經(jīng)濟、無需特殊設(shè)備、已成為床邊檢測的主要方法之一。一、斑點金免疫滲濾試驗

（dotimmunogodl24技術(shù)要點：技術(shù)類型：①雙抗體夾心法Ab＋Ag（標本）＋金標抗體洗滌膜中央形成紅色斑點②間接法Ag＋Ab（標本）洗滌＋金標抗抗體洗滌膜中央形成紅色斑點技術(shù)要點：技術(shù)類型：25一、免疫滲濾測定(IFA)操作示意圖裝置分解圖蓋微孔膜吸水墊料底

DIGFA原理圖一、免疫滲濾測定(IFA)操作示意圖裝置分解圖蓋微孔膜吸水墊26（三）技術(shù)要點1.試劑盒組成滴金反應(yīng)板、塑料小盒、吸水墊料、包被了抗原或抗體的硝酸纖維素膜、膠體金標記物、洗滌液2.操作要點孔內(nèi)滴加標本，待完全滲入?？變?nèi)滴加膠體金標記抗體，待完全滲入?？變?nèi)滴加洗滌液，待完全滲入。膜中央呈現(xiàn)紅色或粉紅色斑點為陽性。斑點深淺相應(yīng)提示陽性強度。（三）技術(shù)要點27IFA——雙抗體夾心法測抗原ABIFA——雙抗體夾心法測抗原AB28加尿樣AC

陰性

陽性加膠體金標記抗體C

斑點金免疫滲濾試驗(IFA)除去濾器BD加洗滌液加尿樣A加尿樣A加尿樣AC陰性陽性C斑點金免疫滲濾試驗(I29GIFA技術(shù)的發(fā)展（間接法測抗體）陽性陰性固相膜固相抗原待測抗體金標記抗人IgG抗體人IgG固相抗人IgG抗體快速檢測（滲濾法）原理圖GIFA技術(shù)的發(fā)展（間接法測抗體）陽性陰性固相膜固相抗原待測30IFA——結(jié)果判斷IFA——結(jié)果判斷31特點

NC膜對蛋白類物質(zhì)有很強的吸附作用，容易使Ag或Ab包被，封閉后，加待檢標本、酶標Ab、酶不溶性底物，陽性標本呈斑點顯色。原理是用膠體金標記技術(shù)和蛋白質(zhì)層析技術(shù)結(jié)合，以微孔濾膜為載體的快速固相膜免疫分析技術(shù)。滴加在膜一端的標本液受載體膜的毛細管作用向另一端移動，猶如層析一般，在移動過程中被分析物與固定于載體膜上某一區(qū)域的抗體或抗原結(jié)合而被固相化，無關(guān)物則越過該區(qū)域而被分離，然后通過膠體金的呈色條帶來判定實驗結(jié)果。二、免疫層析測定immunochromatographyassay,ICA

特點NC膜對蛋白類物質(zhì)有很強的吸附作用，容易使Ag或Ab32ICA技術(shù)類型①雙抗體夾心法

②競爭法③間接法技術(shù)要點臨床應(yīng)用及評價①靈敏度不及酶標法和發(fā)光免疫測定法

②只能定性，不能作定量測定③有“床邊檢驗”之稱④用于正常體液中不存在或含量少物質(zhì)的測定ICA技術(shù)類型①雙抗體夾心法技術(shù)要點臨床應(yīng)用及評價33ICA試劑條樣品墊結(jié)合物墊NC膜吸水墊ICA試劑條樣結(jié)NC吸34DICA雙抗體夾心法原理圖金標抗體包被抗體抗金標抗體吸水紙標本？？DICA雙抗體夾心法原理圖金標抗體包被抗體抗金標35（三）技術(shù)要點1.試劑盒組成：膠體金層析條2.原理：斑點金免疫層析雙抗體夾心法3.操作要點：斑點金免疫層析試驗（一）包被兔抗鼠IgG包被鼠抗HCG單抗金標鼠抗HCG單抗尿液浸濕標志線

手持端包被兔抗鼠IgG包被鼠抗HCG單抗金標鼠抗HCG單抗尿液浸濕標志線

手持端（三）技術(shù)要點1.試劑盒組成：膠體金層析條斑點金免疫層析試驗36尿樣陽性弱陽性陰性無效斑點金免疫層析試驗（二）尿樣陽性弱陽性陰性無效斑點金免疫層析試驗（二）37DICA競爭法原理圖金標抗體包被抗原抗金標抗體吸水紙陽性結(jié)果標本？？？？DICA競爭法原理圖金標抗體包被抗原抗金標抗體38ICA——間接法測抗體ICA——間接法測抗體39ICA結(jié)果觀察

陽性陰性無效ICA結(jié)果觀察陽性陰性無效40DICA間接法原理圖窗吸水材料金標抗人IgG吸水材料吸水材料標本加樣區(qū)包被抗原為了消除待測標本中非特異性IgG與特異性IgG競爭結(jié)合金標抗人IgG，故測抗體常用“反流免疫層析法”①②標記線③④⑤合上檢測盒⑥⑥液體流動方向DICA間接法原理圖窗吸水材料金標抗人IgG吸水材料吸水材料41IFA與ICA的比較IFAICA試劑形式滲濾裝置及附加試劑試劑條試劑保存4~8℃6個月室溫一年操作步驟3~51觀察時間3min3~20min陽性反應(yīng)顏色濃度操作結(jié)束顏色不變顏色逐漸加深I(lǐng)FA與ICA的比較IFAICA試劑形式滲濾裝置及附加試劑試42IFA穿流（FLOWTHROUGH）ICA橫流（LATERALFLOW）IFA43GIFA技術(shù)的發(fā)展第一代1988HIVCHEK（DuPont）單點，5~10分鐘，血清，金標試劑瓶裝凍干品改進抗原HIV1+2，提高敏感度和特異性，縮短反應(yīng)時間，減少步驟，樣品多樣化。第八代INSTANTCHEKHIV1+22點（測試+控制）金標試劑：單人份、液體樣品：血清、血漿、全血、尿液第九~十二代研制中單一試劑GIFA技術(shù)的發(fā)展第一代HIVCHEK（DuPont44ICA技術(shù)的發(fā)展1990年ABBOTT公司膠體硒標記ICAUnipath公司CLEARVIEW立明衣原體彩色膠乳標記ICAROCHECardiacReaderTnT定量0.1~3ng/ml合成TnT質(zhì)控點ICA技術(shù)的發(fā)展1990年ABBOTT公司膠體硒45IFA肌紅蛋白雙孔法

S：測定孔C：定量質(zhì)控100μg/LIFA微量白蛋白單孔法

T：測定孔C1：定量質(zhì)控30mg/LC2：定量質(zhì)控200mg/L結(jié)果判定：（-）<30（+）30~100、（++）100～200（+++）>200mg/LICA甲胎蛋白（AFP）參考值：30μg/L肝癌診斷值：>400μg/L結(jié)果判定：（-）<30（+）30~200（++）200~400（+++）>400μg/LSCTC2C1測定線對照線半定量測定IFAIFAICASCT測對半定量測定46臨床應(yīng)用及評價方法評價：1.操作簡便、快捷、操作人員無需技術(shù)培訓、不需特殊設(shè)備、試劑穩(wěn)定、便于保存，特別符合“床邊檢驗”。2.靈敏度不及酶標法和酶發(fā)光免疫測定法3.不能準確定量，只能定性或半定量。4.目前主要用于正常體液中不存在的物質(zhì)（傳染病抗原或抗體、毒品等）和正常含量極低而在特殊情況下異常升高的物質(zhì)的檢測。如：HCG、AFP臨床應(yīng)用及評價方法評價：47三、斑點酶免疫吸附試驗

——Dot-ELISA三、斑點酶免疫吸附試驗

——Dot-ELISA48三、斑點—酶聯(lián)免疫吸附試驗斑點—酶聯(lián)免疫吸附試驗（dot-ELISA）屬于ELISA類型，與前述的ELISA有所不同的是用吸附蛋白質(zhì)能力很強的硝酸纖維素（NC膜）作為固相載體。技術(shù)類型和方法要點1、間接法——測抗體NC膜+已知抗原干燥封閉加待測血清+酶標抗抗體洗滌加底物2、夾心法——測抗體NC膜+待測血清干燥封閉加特異性抗原+酶標抗體洗滌加底物3、雙抗體夾心法——測抗原NC膜+特異性抗體干燥封閉加待測血清+酶標抗體洗滌加底物4、直接法——測抗原NC膜+待測血清干燥封閉加酶標抗體洗滌加底物有染色斑點（+）無染色斑點（—）有染色斑點（+）無染色斑點（—）有染色斑點（+）無染色斑點（—）1~2ul2~5ul1~2ul2ul有染色斑點（+）無染色斑點（—）三、斑點—酶聯(lián)免疫吸附試驗斑點—酶聯(lián)免疫吸附試驗（dot-E49方法評價①操作簡便快速，結(jié)果判定不需特殊設(shè)備，適合基層使用。②特異性強，敏感性較ELISA高6~8倍③試劑用量少，較ELISA節(jié)約5~10倍④檢測結(jié)果可長期保存，利于復查；⑤本法只能做定性分析，不能做定量測定。方法評價①操作簡便快速，結(jié)果判定不需特殊設(shè)備，適合基層使用。50四、酶聯(lián)免疫斑點試驗

——ELISPOT20世紀80年代，國外的科研工作者根據(jù)ELISA技術(shù)的基本原理，建立了體外檢測特異性抗體分泌B細胞和細胞因子分泌T細胞的酶聯(lián)免疫斑點試驗(enzymelinkedimmunospot,ELISPOT)。四、酶聯(lián)免疫斑點試驗

——ELISPOT20世紀80年代，51ELISPOT檢測原理

細胞受到刺激后局部產(chǎn)生細胞因子，此細胞因子被特異單克隆抗體捕獲。細胞分解后，被捕獲的細胞因子與生物素標記的二抗結(jié)合，其后再與堿性磷酸酶標記的親和素結(jié)合。BCIP/NBT底物孵育后，PVDF孔板出現(xiàn)“紫色”的斑點表明細胞產(chǎn)生了細胞因子，通過CTL公司生產(chǎn)的ELISPOT酶聯(lián)斑點分析系統(tǒng)對斑點的分析后得出結(jié)果。ELISPOT檢測原理細胞受到刺激后局部產(chǎn)生細胞52第12章固相膜免疫測定課件53ELISPOT分析儀解決以下問題哪些斑點是抗原特異性T細胞產(chǎn)生的（此斑點具有進一步分析價值），哪些是無關(guān)細胞產(chǎn)生的（此斑點沒有T細胞研究價值）斑點大小的意義在對不同細胞因子計數(shù)和分析時，如何定義斑點最大和最小尺寸如何從單個細胞基礎(chǔ)上分析實驗精確度有多高？如果一個細胞產(chǎn)生相似的細胞因子，在多大程度上會干擾分析結(jié)果？幾次重復實驗才能使結(jié)果更有意義？ELISPOT分析儀解決以下問題哪些斑點是抗原特異性T54ELISAPOTELISAPOT55ELISPOT結(jié)果判斷ELISPOT結(jié)果判斷56五、免疫印跡法——Westernblot法原理Westernblot——抗原表位可能被破壞而漏檢五、免疫印跡法——Westernblot法原理Western57六、放射免疫沉淀試驗原理放射免疫沉淀試驗——抗原表位不會破壞六、放射免疫沉淀試驗原理放射免疫沉淀試驗——抗原表位不會破壞58思考題1.敘述固相膜免疫測定概念。2．膜的種類與特性是什么？3．膜載體免疫測定的種類有哪些？4．斑點金免疫滲濾試驗(dotimmunogoldfiltrationassay,DIGFA)的原理是什么？5．免疫層析試驗（immunochromatographyassay,ICA）的原理是什么？思考題1.敘述固相膜免疫測定概念。596．斑點ELISA(dotenzymelinkedimmunosorbentassay,Dot-ELISA)原理是什么？7．酶聯(lián)免疫斑點試驗(enzymelinkedimmunospot,ELISPOT)原理是什么？8．免疫印跡法(immunoblottingtest,IBT)原理是什么？9．免疫印跡法(immunoblottingtest,IBT)注意事項是什么？10．放射免疫沉淀試驗(radioimmunoprecipitationassay,RIPA)原理是什么？6．斑點ELISA(dotenzymelinkedi60小結(jié)

固相膜免疫測定與ELISA相類似，其特點是以微孔膜作為固相。固相膜的特點在于其多孔性，像濾紙一樣，固相膜可被液體穿過流出，液體也可以通過毛細管作用在膜上向前移行，利用這種性能建立了多種類型的快速檢驗方法。固相膜免疫測定包括了斑點金免疫滲濾試驗、免疫層析試驗、斑點ELISA、酶聯(lián)免疫斑點試驗、免疫印跡法、放射免疫沉淀試驗。小結(jié)固相膜免疫測定與ELISA相61第十二第一節(jié)概述一、免疫測定分類二、免疫測定原理三、固相免疫測定四、固相膜的特點五、常用的固相膜六、固相膜的技術(shù)要求第十二章固相膜免疫測定第十二第一節(jié)概述第十二章固相膜免疫測定62第二節(jié)免疫金標記技術(shù)一、膠體金的制備第三節(jié)膜載體免疫測定的種類與原理一、膜固相免疫測定的特點二、固相微孔膜測定種類三、免疫滲濾試驗和免疫層析試驗四、酶聯(lián)免疫斑點試驗五、免疫印跡六、放射免疫沉淀試驗思考題小結(jié)第二節(jié)免疫金標記技術(shù)思考題63隨著免疫學技術(shù)和相關(guān)生物化學技術(shù)的發(fā)展，檢測方法上派生出了多種類型的固相膜免疫快速檢測試驗。該類試驗的最大特點是不需要大型設(shè)備，對檢測人員稍加培訓即能掌握操作要求和判定標準。隨著免疫學技術(shù)和相關(guān)生物化學技術(shù)的發(fā)展，檢測方法上64

第一節(jié)概述標記免疫測定放射免疫測定1960’酶免疫測定1970’熒光免疫測定1980’－1990’化學發(fā)光免疫測定1990’－膜固相免疫測定1990’－第一節(jié)概述65一、免疫測定分類免疫濁度測定Ag+AbAgAb+Ab標記免疫測定Ag+Ab*AgAb*+Ab*（B）（F）一、免疫測定分類免疫濁度測定66二、免疫測定原理利用抗原抗體反應(yīng)檢測標本中微量物質(zhì)抗原+抗體抗原抗體復合物Ag+AbAg*Ab二、免疫測定原理利用抗原抗體反應(yīng)檢測標本中微量物質(zhì)67三、固相免疫測定B與F分離

Ab*Ab*Ag+Ag+Ab*AbAb三、固相免疫測定B與F分離Ab*68四、固相膜的特點多孔性

毛細管作用非共價鍵高度吸附抗體或抗原

高度敏感性易于漂洗

操作簡便四、固相膜的特點69五、常用的固相膜玻璃纖維素(fiberglass)膜尼龍(nylon)膜聚偏氟乙稀(polyvinylidenefluoride，PVDF)膜硝酸纖維素（nitrocellulose，NC）膜五、常用的固相膜玻璃纖維素(fiberglass)膜70六、固相膜的技術(shù)要求孔徑：0.2~0.6μm流速：以ml/cm2/min表示蛋白質(zhì)結(jié)合力：吸附力很強，以μg/cm2表示均一性六、固相膜的技術(shù)要求孔徑：0.2~0.6μm71固相NC膜固相NC膜72第二節(jié)免疫金標記技術(shù)(Immunogoldlabellingtechique)

是以膠體金作為標記物的免疫標記技術(shù)?；驹碛媒鹑苣z標記蛋白質(zhì)，膠體金顆粒具有高電子密度的特性，故在金標蛋白的抗原抗體結(jié)合處，顯微鏡下可見黑褐色顆粒；當這些標記物在相應(yīng)的標記處大量聚集時，可在載體膜上呈現(xiàn)肉眼可見紅色或粉紅色斑點，從而用于抗原或抗體物質(zhì)的定位或定性。第二節(jié)免疫金標記技術(shù)(Immunogoldlabelli73膠體金（colloidalgold）指金微小粒子（1－100nm）分散在溶液中所形成的金溶液。是由金鹽被還原成原金后形成的金顆粒懸液。也稱金溶膠（goldsolution）。技術(shù)類型：1.金免疫測定技術(shù)2.金免疫組化技術(shù)膠體金（colloidalgold）指金微小粒子（1－1074一、膠體金制備

膠體金（colloidalgold）的制備一般采用還原法，常用的還原劑有檸檬酸鈉、鞣酸、抗壞血酸、白磷、硼氫化鈉等。向一定濃度的金溶液內(nèi)加入一定量的還原劑使金離子還原成金原子，形成金顆粒懸液。一、膠體金制備膠體金（colloidalgold）的制備75

膠體金的制備方法

原理：向一定濃度的氯金酸溶液內(nèi)加入一定量的還原劑使金離子變成金原子，形成金顆粒懸液。

配HAuC14水溶液加熱沸檸檬酸三鈉攪動加熱沸（約2～3min*）冷卻加蒸餾水至原體積。見淡黃色的氯金酸水溶液在檸檬酸鈉加入后很快變灰色，續(xù)而轉(zhuǎn)成黑色，隨后逐漸穩(wěn)定成紅色。通過改變檸檬酸鈉的用量可制得不同大小的膠體金顆粒膠體金的制備方法原理：向一定濃度的氯金酸溶液內(nèi)加入一定量76膠體金的制備及特性膠體金粒徑1%檸檬酸鈉加入量膠體金特性（nm)（ml)*呈色lmax(nm)162.00橙色51824.51.50橙紅色522411.00紅色52571.50.70紫色535*還原100ml0.01%HAuCl4所需量膠體金的制備及特性膠體金粒徑1%檸檬酸鈉加入量膠體金特性（77

制備膠體金的注意事項（1）氯金酸易潮解，應(yīng)干燥、避光保存。（2）氯金酸對金屬有強烈的腐蝕性，不應(yīng)使用金屬藥匙稱量氯金酸。（3）制備膠體金應(yīng)用雙蒸/三蒸餾水，或者是高質(zhì)量的去離子水。（4）玻璃容器必須是絕對清潔的，最好是經(jīng)硅化處理的。制備膠體金的注意事項（1）氯金酸易潮解，應(yīng)干燥、避光保存。78

膠體金的保存潔凈的玻璃器皿中可較長時間保存；少許防腐劑（如0.02％NaN3）可有利于保存。膠體金的鑒定：肉眼、分光光度計、電鏡等方法觀察應(yīng)為清亮透明的液體若膠體金混濁或液體表面有漂浮物，則制備的膠體金有較多的凝集顆粒膠體金的保存膠體金的鑒定：79膠體金（ColloidalGold）

15~60nm優(yōu)質(zhì)劣質(zhì)膠體金（ColloidalGold）

15~60n80免疫金的制備免疫金（immunogold）：是指膠體金與抗原或抗體等的結(jié)合物,在免疫組織化學技術(shù)中，習慣上要稱之為金探針。制備方法：1.膠體金溶液的pH值調(diào)整2．蛋白質(zhì)最適標記量的確定3．標記過程4．離心去除未結(jié)合的蛋白質(zhì)，反復洗滌2～4次5.免疫金最終用稀釋液配成工作濃度保存

免疫金的制備免疫金（immunogold）：是指膠體金與抗原81膠體金結(jié)合物（Conjugate）膠體金結(jié)合物（Conjugate）82膜固相免疫測定的特點第三節(jié)膜載體免疫測定的種類與原理優(yōu)點不足之處簡便，快速敏感度略低，價格略高（與ELISA比）單份測定精密度較差，質(zhì)控困難保存期長（優(yōu)質(zhì)試劑）穩(wěn)定性較差（普通試劑）可測定物范圍廣（主要為定性試驗）不易制備定量、半定量試劑感染性疾病的診斷妊娠、排卵的診斷腫瘤標志；心肌標志；濫用藥物膜固相免疫測定的特點第三節(jié)膜載體免疫測定的種類與原理優(yōu)點不83固相微孔膜測定種類斑點金免疫滲濾試驗(dotimmunogoldfiltrationassay,DIGFA)免疫層析試驗（immunochromatographyassay,ICA）斑點ELISA

(dotenzymelinkedimmunosorbentassay,Dot-ELISA)酶聯(lián)免疫斑點試驗(enzymelinkedimmunospot,ELISPOT)

免疫印跡法(immunoblottingtest,IBT)

放射免疫沉淀試驗(radioimmunoprecipitationassay,RIPA)

固相微孔膜測定種類斑點金免疫滲濾試驗(dotimmunog84一、斑點金免疫滲濾試驗

（dotimmunogodlfitrationassay,DIGFA

原理：將抗原或抗體點加在固相載體NC膜上，制成的包被微孔濾膜貼置于吸水材料上，依次滴加在膜上的標本、免疫金、及洗滌液等液體很快滲入吸水材料中，最后陽性反應(yīng)在膜上呈現(xiàn)紅色斑點。

特點：快速、簡便、經(jīng)濟、無需特殊設(shè)備、已成為床邊檢測的主要方法之一。一、斑點金免疫滲濾試驗

（dotimmunogodl85技術(shù)要點：技術(shù)類型：①雙抗體夾心法Ab＋Ag（標本）＋金標抗體洗滌膜中央形成紅色斑點②間接法Ag＋Ab（標本）洗滌＋金標抗抗體洗滌膜中央形成紅色斑點技術(shù)要點：技術(shù)類型：86一、免疫滲濾測定(IFA)操作示意圖裝置分解圖蓋微孔膜吸水墊料底

DIGFA原理圖一、免疫滲濾測定(IFA)操作示意圖裝置分解圖蓋微孔膜吸水墊87（三）技術(shù)要點1.試劑盒組成滴金反應(yīng)板、塑料小盒、吸水墊料、包被了抗原或抗體的硝酸纖維素膜、膠體金標記物、洗滌液2.操作要點孔內(nèi)滴加標本，待完全滲入。孔內(nèi)滴加膠體金標記抗體，待完全滲入?？變?nèi)滴加洗滌液，待完全滲入。膜中央呈現(xiàn)紅色或粉紅色斑點為陽性。斑點深淺相應(yīng)提示陽性強度。（三）技術(shù)要點88IFA——雙抗體夾心法測抗原ABIFA——雙抗體夾心法測抗原AB89加尿樣AC

陰性

陽性加膠體金標記抗體C

斑點金免疫滲濾試驗(IFA)除去濾器BD加洗滌液加尿樣A加尿樣A加尿樣AC陰性陽性C斑點金免疫滲濾試驗(I90GIFA技術(shù)的發(fā)展（間接法測抗體）陽性陰性固相膜固相抗原待測抗體金標記抗人IgG抗體人IgG固相抗人IgG抗體快速檢測（滲濾法）原理圖GIFA技術(shù)的發(fā)展（間接法測抗體）陽性陰性固相膜固相抗原待測91IFA——結(jié)果判斷IFA——結(jié)果判斷92特點

NC膜對蛋白類物質(zhì)有很強的吸附作用，容易使Ag或Ab包被，封閉后，加待檢標本、酶標Ab、酶不溶性底物，陽性標本呈斑點顯色。原理是用膠體金標記技術(shù)和蛋白質(zhì)層析技術(shù)結(jié)合，以微孔濾膜為載體的快速固相膜免疫分析技術(shù)。滴加在膜一端的標本液受載體膜的毛細管作用向另一端移動，猶如層析一般，在移動過程中被分析物與固定于載體膜上某一區(qū)域的抗體或抗原結(jié)合而被固相化，無關(guān)物則越過該區(qū)域而被分離，然后通過膠體金的呈色條帶來判定實驗結(jié)果。二、免疫層析測定immunochromatographyassay,ICA

特點NC膜對蛋白類物質(zhì)有很強的吸附作用，容易使Ag或Ab93ICA技術(shù)類型①雙抗體夾心法

②競爭法③間接法技術(shù)要點臨床應(yīng)用及評價①靈敏度不及酶標法和發(fā)光免疫測定法

②只能定性，不能作定量測定③有“床邊檢驗”之稱④用于正常體液中不存在或含量少物質(zhì)的測定ICA技術(shù)類型①雙抗體夾心法技術(shù)要點臨床應(yīng)用及評價94ICA試劑條樣品墊結(jié)合物墊NC膜吸水墊ICA試劑條樣結(jié)NC吸95DICA雙抗體夾心法原理圖金標抗體包被抗體抗金標抗體吸水紙標本？？DICA雙抗體夾心法原理圖金標抗體包被抗體抗金標96（三）技術(shù)要點1.試劑盒組成：膠體金層析條2.原理：斑點金免疫層析雙抗體夾心法3.操作要點：斑點金免疫層析試驗（一）包被兔抗鼠IgG包被鼠抗HCG單抗金標鼠抗HCG單抗尿液浸濕標志線

手持端包被兔抗鼠IgG包被鼠抗HCG單抗金標鼠抗HCG單抗尿液浸濕標志線

手持端（三）技術(shù)要點1.試劑盒組成：膠體金層析條斑點金免疫層析試驗97尿樣陽性弱陽性陰性無效斑點金免疫層析試驗（二）尿樣陽性弱陽性陰性無效斑點金免疫層析試驗（二）98DICA競爭法原理圖金標抗體包被抗原抗金標抗體吸水紙陽性結(jié)果標本？？？？DICA競爭法原理圖金標抗體包被抗原抗金標抗體99ICA——間接法測抗體ICA——間接法測抗體100ICA結(jié)果觀察

陽性陰性無效ICA結(jié)果觀察陽性陰性無效101DICA間接法原理圖窗吸水材料金標抗人IgG吸水材料吸水材料標本加樣區(qū)包被抗原為了消除待測標本中非特異性IgG與特異性IgG競爭結(jié)合金標抗人IgG，故測抗體常用“反流免疫層析法”①②標記線③④⑤合上檢測盒⑥⑥液體流動方向DICA間接法原理圖窗吸水材料金標抗人IgG吸水材料吸水材料102IFA與ICA的比較IFAICA試劑形式滲濾裝置及附加試劑試劑條試劑保存4~8℃6個月室溫一年操作步驟3~51觀察時間3min3~20min陽性反應(yīng)顏色濃度操作結(jié)束顏色不變顏色逐漸加深I(lǐng)FA與ICA的比較IFAICA試劑形式滲濾裝置及附加試劑試103IFA穿流（FLOWTHROUGH）ICA橫流（LATERALFLOW）IFA104GIFA技術(shù)的發(fā)展第一代1988HIVCHEK（DuPont）單點，5~10分鐘，血清，金標試劑瓶裝凍干品改進抗原HIV1+2，提高敏感度和特異性，縮短反應(yīng)時間，減少步驟，樣品多樣化。第八代INSTANTCHEKHIV1+22點（測試+控制）金標試劑：單人份、液體樣品：血清、血漿、全血、尿液第九~十二代研制中單一試劑GIFA技術(shù)的發(fā)展第一代HIVCHEK（DuPont105ICA技術(shù)的發(fā)展1990年ABBOTT公司膠體硒標記ICAUnipath公司CLEARVIEW立明衣原體彩色膠乳標記ICAROCHECardiacReaderTnT定量0.1~3ng/ml合成TnT質(zhì)控點ICA技術(shù)的發(fā)展1990年ABBOTT公司膠體硒106IFA肌紅蛋白雙孔法

S：測定孔C：定量質(zhì)控100μg/LIFA微量白蛋白單孔法

T：測定孔C1：定量質(zhì)控30mg/LC2：定量質(zhì)控200mg/L結(jié)果判定：（-）<30（+）30~100、（++）100～200（+++）>200mg/LICA甲胎蛋白（AFP）參考值：30μg/L肝癌診斷值：>400μg/L結(jié)果判定：（-）<30（+）30~200（++）200~400（+++）>400μg/LSCTC2C1測定線對照線半定量測定IFAIFAICASCT測對半定量測定107臨床應(yīng)用及評價方法評價：1.操作簡便、快捷、操作人員無需技術(shù)培訓、不需特殊設(shè)備、試劑穩(wěn)定、便于保存，特別符合“床邊檢驗”。2.靈敏度不及酶標法和酶發(fā)光免疫測定法3.不能準確定量，只能定性或半定量。4.目前主要用于正常體液中不存在的物質(zhì)（傳染病抗原或抗體、毒品等）和正常含量極低而在特殊情況下異常升高的物質(zhì)的檢測。如：HCG、AFP臨床應(yīng)用及評價方法評價：108三、斑點酶免疫吸附試驗

——Dot-ELISA三、斑點酶免疫吸附試驗

——Dot-ELISA109三、斑點—酶聯(lián)免疫吸附試驗斑點—酶聯(lián)免疫吸附試驗（dot-ELISA）屬于ELISA類型，與前述的ELISA有所不同的是用吸附蛋白質(zhì)能力很強的硝酸纖維素（NC膜）作為固相載體。技術(shù)類型和方法要點1、間接法——測抗體NC膜+已知抗原干燥封閉加待測血清+酶標抗抗體洗滌加底物2、夾心法——測抗體NC膜+待測血清干燥封閉加特異性抗原+酶標抗體洗滌加底物3、雙抗體夾心法——測抗原NC膜+特異性抗體干燥封閉加待測血清+酶標抗體洗滌加底物4、直接法——測抗原NC膜+待測血清干燥封閉加酶標抗體洗滌加底物有染色斑點（+）無染色斑點（—）有染色斑點（+）無染色斑點（—）有染色斑點（+）