實驗五-抗體效價的Elisa測定課件

實驗五

酶聯(lián)免疫吸附測定BSA抗體效價

1.目的要求(1)學習酶聯(lián)免疫吸附測定的基本原理。(2)掌握酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)，抗體的效價測定及酶聯(lián)免疫測定儀的使用。

2.基本原理免疫酶技術(shù):酶標Ab/Ag,酶結(jié)合物的酶在免疫反應后，作用于厎物后顯色，根據(jù)顏色的有無和深淺，定量測定Ab/Ag。免疫反應：一次或數(shù)次具Ag,Ab特異的免疫學反應酶促反應：只進行一次

顯示出生物放大作用，靈敏度ng,pg60年代初期，Averameas&Ram等建立了免疫酶技術(shù)(immunoenzymatictechniques)

利用特殊的交聯(lián)劑研制出辣根過氧化物酶---人血清白蛋白及酸性磷酸酯酶---抗體，統(tǒng)稱為酶標記物或酶結(jié)合物，用于抗原或抗體的示蹤、定位或定量測定1974年Voller等用聚苯乙烯微量反應板作為免疫吸附劑吸附抗體(抗原)，再與相應的酶標記物結(jié)合操作更方便，易重復靈敏度可高達ng（10-9g）至pg(10-12g)，(Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay)免疫標記技術(shù)應用各種液相和固相免疫分析方法，對體液中的半抗原、抗原或抗體進行定性和定量測定標記抗體或抗原熒光素、放射性同位素、酶、鐵蛋白、膠體金及化學(或生物)發(fā)光劑鏡檢觀察或進行自動化測定熒光顯微鏡，射線測量儀，酶標檢測儀，電子顯微鏡和發(fā)光免疫測定儀等直接在細胞、亞細胞、超微結(jié)構(gòu)及分子水平上,對抗原抗體反應進行定性和定位研究戊二醛法，過碘酸氧化法將酶與Ab交聯(lián)在一起Ag-Ab-抗Ab-HRPTMB+H2O2產(chǎn)物（黃色，OD450)+H2O圖二間接型Elisa圖四固相抗體競爭型ELISA未知抗原量=A（1）-A（2）每次反應后都要反復洗滌？保證反應的定量反應防止重疊反應，引起非特異現(xiàn)象。Partiallypurified,inactivatedHIVantigensantigenspre-coatedontoanELISAplatePatientserumwhichcontainsantibodies.IfthepatientisHIV+,thenthisserumwillcontainantibodiestoHIV,andthoseantibodieswillbindtotheHIVantigensontheplate.

Anti-humanimmunoglobulincoupledtoanenzyme.Thisisthesecondantibody,anditbindstohumanantibodies.

substratewhichchangescolorwhencleavedbytheenzymeattachedtothesecondantibody.HIV(humanimmunodeficiencyvirus)detectionpositivenegativeProteinproteininteraction---ELISA1.DirectelisadifferentepitopeCoatwithpreyproteinIncubatewithbaitproteinPimaryAbantibaitprotein-----2.CompetitiveelisasameepitopeCoatwithbaitprIncubatewithprimaryantibodyantibaitprandvariousconcentrationpreyprotein4.操作方法4.1包被特異性抗原:固體抗原(如蛋白質(zhì))用包被液稀釋至10Oμg/ml，每凹孔加100μL，加蓋置4℃過夜(37℃2h)，次日傾去凹孔內(nèi)液體，用滴管取洗滌液在每孔中加3～4滴，靜置3min后傾去，重復3次，將反應板扣放在濾紙上，以除凈液體。4.2封閉:每孔中加入200－400μL封閉液，加蓋或用封口膜封板，置37℃恒溫箱60min，傾去孔內(nèi)液體，按上法洗滌3次。4.3加待測血清(內(nèi)含抗體)、陰性血清(無抗體)及稀釋液(PBS/Tween):待測血清按倍比法用稀釋液稀釋(1:100、1:200等)，陰性血清也稀釋成1:100，取不同稀釋度的待測血清，陰性血清及稀釋液(PBS/Tween)各1OOμL加至相應的凹孔中，加蓋或封板，置37℃恒溫箱1h，使抗體與固相抗原進行特異性結(jié)合，反復洗滌3次。4.4加酶標抗體:按說明書要求用稀釋液稀釋HRP-抗體(抗抗體)，每孔加l00μL，封板后置37℃溫育lh，按上法至少洗滌5次，最后用蒸餾水洗滌2次，扣在濾紙上吸干水分。4.5顯色:每孔加入OPD應用液1OOuL、反應板置室溫暗處5～30min。當顯示橙色時應及時終止反應。4.6終止反應:每孔加入5OμL2mol/LH2SO4。穩(wěn)定3～5min即可比色測定。4.7檢測:用酶聯(lián)免疫測定儀，以PBS/Tween孔為對照、測波長為49Onm時各孔光吸收（A）。計算陽性血清與陰性血清A值之比(Positive/negative，P/N)，當P/N≥2.1時為陽性，P/N<2.1而≥1.5為可疑，P/N<1.5為陰性。用目測法則以較陰性對照深色的最高稀釋度作為抗體效價。用“＋”“－”表示，超過規(guī)定吸收值（0.2－0.4）的標本均屬陽性。

注意事項

(1)聚苯乙烯微量反應板應選擇高質(zhì)量、非特異性吸附小的產(chǎn)品。包被物應具有較高的純度，其濃度一般在1～100μg之間，在偏堿條件下易吸附于反應板的凹孔中，4℃放置過夜較理想，若暫時不用，可加入終濃度為0.02%NaN3，4℃貯存，也可傾去包被液，干燥后置硅膠干燥器中，室溫存放3個月以上不影響測定效果。(2)反應各步均應充分洗滌，以除去殘留物，減少非特異性吸附。為使結(jié)果重復應固定洗滌次數(shù)及放置時間，切忌相互污染。(3)為使顯色反應便于比較，顯色后置室溫暗處的時間應一致，終止反應3～5min后應立即比色。必要時可設陽性對照，以固定顯色及終止時間。(4)待測抗體或抗原與酶標抗體應具有相同的免疫特異性，否則無法結(jié)合。3按“READ”鍵，酶標板推進入儀器，開始讀數(shù)并計數(shù)，打印機輸出數(shù)據(jù)。4按“MAINMENU”鍵回到主菜單，關(guān)閉電源。

酶標板的清洗：采用ELx50TM型微孔板洗板機，注射泵驅(qū)動的液體輸送，條狀單排清洗或全板清洗

了解轉(zhuǎn)膜電泳原理的應用及操作WesternBlottingorimmunoblottingaspecificprimaryantibody1979,Towbin1975,Southern,Southernblotting1977,Alwine,Northernblotting1979,Towbin,WesternBlotting1982,Reihart,Easternblotting,雙向蛋白質(zhì)印記Westernblotting:AntibodiescanbeusedtodetectspecificproteinsAlternatedetectionmethod–SecondaryantibodiesMemebrane:吸附生命大分子的固體材料NC,nitrocellulose硝酸纖維素膜0.45um

結(jié)合率：80ugPr/cm2

便宜，可簡單快速封閉非特異性抗體的結(jié)合NDM,nylon-densedmembrane尼龍膜結(jié)合率：480ugPr/cm2DBM,diazobenzyloxymethyl重氮芐氧甲基膜濕法轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)：將gel和membrane夾在blotterpaper中，浸在轉(zhuǎn)移裝置的buffer中，通電45min或overnight可完成。TransferBuffer(500ml,pH8.3)

glycine1.450g(39mM)Trisbase2.900g(48mM)SDS0.185g(0.037%)UsingtheSemi-DryTransferUnit

Removethestackinggelfromthegel.2.Cutpiecesofblotterpapertothesizeofthegel.

note:theblotterpaper(andthemembrane)notbelargerthanthegel.Largerpiecesmaymakecontactaroundthegel,andallowthecurrentanalternateroute,therebymakingtransferinefficient.3.Wearingglovesrinsedofpowder,cutapieceofmembranetothesizeofthegel.Markthelowerright-handcornertoallowfororientation.Pre-wetthemembraneintransferbufferfor2to5minutes.4.sandwichblotterpaper–membrane-gel-blotterpaper

makesurenoairbubblesaretrappedThemembranemustthereforebepositionedcorrectlythefirsttime.Donottrytoadjust.5.Holdthecoverlevelandslideitgentlydownontothestack.6.weighdownthelidinordertoensureevencontactwiththestack.7.Connecttheunittoasuitablepowersupply.Turnthepowersupplytozerobeforeturningon.Turnonthepowersupplyandsettoapproximately0.8mA/cm2ofgel.Largergelsmustbelimitedto0.8mA/cm2toavoidexcessiveheatbuildup.8mmx7mmmini-gelsat100mA.MolecularWeightTransferPeriod<20,00015minutes20,000-80,000030minutes>80,00045minutesProblem：蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移效率低？（轉(zhuǎn)移后對凝膠或膜染色進行觀察）transferbuffer中加入20％甲醇或加入終濃度為0.1%SDS,可增加膜結(jié)合蛋白質(zhì)的能力；使用小孔徑的硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)移后的膜在含0.2%戊二醛的TBS中浸泡45min。麗春紅S，