酵母雙雜交體系Yeasttwo-hybridsystem酵母雙雜交課件

酵母雙雜交體系Yeasttwo-hybridsystem酵母雙雜交體系Yeasttwo-hybridsystem1酵母雙雜交(yeasttwohybrid)技術(shù)是利用酵母遺傳學(xué)方法分析蛋白質(zhì)之間的相互作用的技術(shù).酵母雙雜交(yeasttwohybrid)技術(shù)是利用2背景知識(shí)真核生物轉(zhuǎn)錄起始前區(qū)域結(jié)構(gòu): -25bp區(qū)有：TATA序列稱為Hogness盒或TATAbox，為啟動(dòng)子核心序列。

上游更遠(yuǎn)處增強(qiáng)子統(tǒng)稱順式作用元件背景知識(shí)真核生物轉(zhuǎn)錄起始前區(qū)域結(jié)構(gòu):3轉(zhuǎn)錄因子能直接或間接辨認(rèn)和結(jié)合上游區(qū)段DNA的蛋白質(zhì)----反式作用因子.其中能直接或間接與RNA聚合酶結(jié)合的稱為轉(zhuǎn)錄因子(TF).相應(yīng)于RNA聚合酶ⅠⅡⅢ的轉(zhuǎn)錄因子為TFⅠ,Ⅱ,Ⅲ真核生物的TFⅡ又分為TFⅡA與TFⅡB轉(zhuǎn)錄因子能直接或間接辨認(rèn)和結(jié)合上游區(qū)段DNA的蛋白質(zhì)----4真核生物轉(zhuǎn)錄起始前復(fù)合物TFⅡD識(shí)別TATATFⅡD-ⅡA-ⅡB-DNA復(fù)合體TFⅡB為橋梁并提供結(jié)合表面,促使TFⅡF-RNApol復(fù)合結(jié)構(gòu)進(jìn)入啟動(dòng)子核心區(qū)TATA.TFⅡE的ATPase分解ATP,解開DNA雙螺旋.TFⅡH進(jìn)入完成轉(zhuǎn)錄起始前復(fù)合物(PIC)啟動(dòng)合成RNA第一個(gè)堿基.真核生物轉(zhuǎn)錄起始前復(fù)合物TFⅡD識(shí)別TATA5真核轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)域兩個(gè)結(jié)構(gòu)域DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA-bindingdomain，BD)一個(gè)或多個(gè)與其他調(diào)控蛋白相互作用的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(activationdomain，AD)真核轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)域兩個(gè)結(jié)構(gòu)域6酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

GAL4包括兩個(gè)彼此分離的但功能必需的結(jié)構(gòu)域.

兩結(jié)構(gòu)域：DNA結(jié)合域轉(zhuǎn)錄激活域特點(diǎn)：結(jié)構(gòu)上可分開、功能上相互獨(dú)立酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4結(jié)構(gòu)特點(diǎn)GAL4包括兩個(gè)彼此分離的但功7基本原理DNA結(jié)合域（DNA-BD）：N端1-147氨基酸轉(zhuǎn)錄激活域（AD）：C端786-881氨基酸基本原理8DNA-BD：識(shí)別GAL4效應(yīng)基因上游的激活序列（UAS），并與之結(jié)合AD：通過同轉(zhuǎn)錄機(jī)制(transcriptionmachinery)的其它成分之間的結(jié)合以啟動(dòng)上游激活序列（UAS）下游的基因轉(zhuǎn)錄。DNA-BD：識(shí)別GAL4效應(yīng)基因上游的激活序列（UAS）9用DNA重組技術(shù)，將DNA-BD和AD分開，并放在同一宿主細(xì)胞中表達(dá)。用DNA重組技術(shù)，將DNA-BD和AD分開，并放在同一宿主細(xì)10將編碼DNA-BD的基因與已知蛋白質(zhì)Baitprotein的基因構(gòu)建在同一個(gè)表達(dá)載體上，在酵母中表達(dá)兩者的融合蛋白BD-Baitprotein。將編碼DNA-BD的基因與已知蛋白質(zhì)Baitprotein11將編碼AD的基因和cDNA文庫的基因構(gòu)建在AD-LIBRARY表達(dá)載體上。產(chǎn)生的GAL4DNA-BD和AD多肽不直接發(fā)生相互作用，不能激活相關(guān)的效應(yīng)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄將編碼AD的基因和cDNA文庫的基因構(gòu)建在AD-LIBRAR12同時(shí)用上述兩種載體轉(zhuǎn)化改造后的酵母，這種改造后的酵母細(xì)胞的基因組中不能產(chǎn)生GAL4。同時(shí)用上述兩種載體轉(zhuǎn)化改造后的酵母，這種改造后的酵母細(xì)胞的基13GAL4的DNA-BD和蛋白質(zhì)X結(jié)合形成雜種蛋白，與GAL1的UAS序列結(jié)合，但由于無AD的參與，報(bào)告基因不轉(zhuǎn)錄。GAL1UAS（上游激活序列）啟動(dòng)子LacZ(報(bào)告基因)DNA-BD蛋白質(zhì)XGAL4的DNA-BD和蛋白質(zhì)X結(jié)合形成雜種蛋白，與GAL114GAL4的AD同蛋白質(zhì)Y結(jié)合，形成的雜種蛋白，未與UAS序列結(jié)合，不能啟動(dòng)報(bào)導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄。GAL1UAS（上游激活序列）啟動(dòng)子LacZ(報(bào)告基因)AD蛋白質(zhì)YGAL4的AD同蛋白質(zhì)Y結(jié)合，形成的雜種蛋白，未與UAS序列15通過此兩個(gè)雜種蛋白中的X與Y的相互作用，在細(xì)胞內(nèi)重建了GAL4的功能，啟動(dòng)報(bào)導(dǎo)基因表達(dá)。GAL1UAS（上游激活序列）啟動(dòng)子LacZ(報(bào)告基因)通過此兩個(gè)雜種蛋白中的X與Y的相互作用，在細(xì)胞內(nèi)重建了GAL16缺陷型宿主菌株常見的有SF562和HF7c.特點(diǎn)：無表達(dá)GAL4轉(zhuǎn)錄激活因子的能力缺陷型宿主菌株常見的有SF562和HF7c.17載體------穿梭質(zhì)粒pGBT9,又稱DNA-BD質(zhì)粒載體。靶基因插入可與GAL4-BD形成融合蛋白Ⅰ。pGAD424，又稱AD質(zhì)粒載體。靶基因插入可與GAL4-AD形成融合蛋白Ⅱ。二者均可在大腸桿菌和釀酒酵母中自主復(fù)制。兩種融合蛋白可在酵母中高表達(dá)。在核定位序列作用下，進(jìn)入酵母細(xì)胞核內(nèi)。載體------穿梭質(zhì)粒pGBT9,又稱DNA-BD質(zhì)粒載18（ADH1:醇脫氫酶1）（ADH1:醇脫氫酶1）19酵母雙雜交體系Yeasttwo-hybridsystem酵母雙雜交課件20實(shí)驗(yàn)程序1分別重組兩種穿梭質(zhì)粒載體。2分別導(dǎo)入E.coli培養(yǎng)。3分別提取兩種質(zhì)粒。4轉(zhuǎn)化酵母菌5篩選陽性克隆實(shí)驗(yàn)程序1分別重組兩種穿梭質(zhì)粒載體。21酵母雙雜交體系Yeasttwo-hybridsystem酵母雙雜交課件22應(yīng)用---蛋白質(zhì)相互作用篩選單抗蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用篩選酶抑制劑…應(yīng)用---蛋白質(zhì)相互作用篩選單抗23酵母雙雜交體系Yeasttwo-hybridsystem酵母雙雜交體系Yeasttwo-hybridsystem24酵母雙雜交(yeasttwohybrid)技術(shù)是利用酵母遺傳學(xué)方法分析蛋白質(zhì)之間的相互作用的技術(shù).酵母雙雜交(yeasttwohybrid)技術(shù)是利用25背景知識(shí)真核生物轉(zhuǎn)錄起始前區(qū)域結(jié)構(gòu): -25bp區(qū)有：TATA序列稱為Hogness盒或TATAbox，為啟動(dòng)子核心序列。

上游更遠(yuǎn)處增強(qiáng)子統(tǒng)稱順式作用元件背景知識(shí)真核生物轉(zhuǎn)錄起始前區(qū)域結(jié)構(gòu):26轉(zhuǎn)錄因子能直接或間接辨認(rèn)和結(jié)合上游區(qū)段DNA的蛋白質(zhì)----反式作用因子.其中能直接或間接與RNA聚合酶結(jié)合的稱為轉(zhuǎn)錄因子(TF).相應(yīng)于RNA聚合酶ⅠⅡⅢ的轉(zhuǎn)錄因子為TFⅠ,Ⅱ,Ⅲ真核生物的TFⅡ又分為TFⅡA與TFⅡB轉(zhuǎn)錄因子能直接或間接辨認(rèn)和結(jié)合上游區(qū)段DNA的蛋白質(zhì)----27真核生物轉(zhuǎn)錄起始前復(fù)合物TFⅡD識(shí)別TATATFⅡD-ⅡA-ⅡB-DNA復(fù)合體TFⅡB為橋梁并提供結(jié)合表面,促使TFⅡF-RNApol復(fù)合結(jié)構(gòu)進(jìn)入啟動(dòng)子核心區(qū)TATA.TFⅡE的ATPase分解ATP,解開DNA雙螺旋.TFⅡH進(jìn)入完成轉(zhuǎn)錄起始前復(fù)合物(PIC)啟動(dòng)合成RNA第一個(gè)堿基.真核生物轉(zhuǎn)錄起始前復(fù)合物TFⅡD識(shí)別TATA28真核轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)域兩個(gè)結(jié)構(gòu)域DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA-bindingdomain，BD)一個(gè)或多個(gè)與其他調(diào)控蛋白相互作用的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(activationdomain，AD)真核轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)域兩個(gè)結(jié)構(gòu)域29酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

GAL4包括兩個(gè)彼此分離的但功能必需的結(jié)構(gòu)域.

兩結(jié)構(gòu)域：DNA結(jié)合域轉(zhuǎn)錄激活域特點(diǎn)：結(jié)構(gòu)上可分開、功能上相互獨(dú)立酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4結(jié)構(gòu)特點(diǎn)GAL4包括兩個(gè)彼此分離的但功30基本原理DNA結(jié)合域（DNA-BD）：N端1-147氨基酸轉(zhuǎn)錄激活域（AD）：C端786-881氨基酸基本原理31DNA-BD：識(shí)別GAL4效應(yīng)基因上游的激活序列（UAS），并與之結(jié)合AD：通過同轉(zhuǎn)錄機(jī)制(transcriptionmachinery)的其它成分之間的結(jié)合以啟動(dòng)上游激活序列（UAS）下游的基因轉(zhuǎn)錄。DNA-BD：識(shí)別GAL4效應(yīng)基因上游的激活序列（UAS）32用DNA重組技術(shù)，將DNA-BD和AD分開，并放在同一宿主細(xì)胞中表達(dá)。用DNA重組技術(shù)，將DNA-BD和AD分開，并放在同一宿主細(xì)33將編碼DNA-BD的基因與已知蛋白質(zhì)Baitprotein的基因構(gòu)建在同一個(gè)表達(dá)載體上，在酵母中表達(dá)兩者的融合蛋白BD-Baitprotein。將編碼DNA-BD的基因與已知蛋白質(zhì)Baitprotein34將編碼AD的基因和cDNA文庫的基因構(gòu)建在AD-LIBRARY表達(dá)載體上。產(chǎn)生的GAL4DNA-BD和AD多肽不直接發(fā)生相互作用，不能激活相關(guān)的效應(yīng)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄將編碼AD的基因和cDNA文庫的基因構(gòu)建在AD-LIBRAR35同時(shí)用上述兩種載體轉(zhuǎn)化改造后的酵母，這種改造后的酵母細(xì)胞的基因組中不能產(chǎn)生GAL4。同時(shí)用上述兩種載體轉(zhuǎn)化改造后的酵母，這種改造后的酵母細(xì)胞的基36GAL4的DNA-BD和蛋白質(zhì)X結(jié)合形成雜種蛋白，與GAL1的UAS序列結(jié)合，但由于無AD的參與，報(bào)告基因不轉(zhuǎn)錄。GAL1UAS（上游激活序列）啟動(dòng)子LacZ(報(bào)告基因)DNA-BD蛋白質(zhì)XGAL4的DNA-BD和蛋白質(zhì)X結(jié)合形成雜種蛋白，與GAL137GAL4的AD同蛋白質(zhì)Y結(jié)合，形成的雜種蛋白，未與UAS序列結(jié)合，不能啟動(dòng)報(bào)導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄。GAL1UAS（上游激活序列）啟動(dòng)子LacZ(報(bào)告基因)AD蛋白質(zhì)YGAL4的AD同蛋白質(zhì)Y結(jié)合，形成的雜種蛋白，未與UAS序列38通過此兩個(gè)雜種蛋白中的X與Y的相互作用，在細(xì)胞內(nèi)重建了GAL4的功能，啟動(dòng)報(bào)導(dǎo)基因表達(dá)。GAL1UAS（上游激活序列）啟動(dòng)子LacZ(報(bào)告基因)通過此兩個(gè)雜種蛋白中的X與Y的相互作用，在細(xì)胞內(nèi)重建了GAL39缺陷型宿主菌株常見的有SF562和HF7c.特點(diǎn)：無表達(dá)GAL4轉(zhuǎn)錄激活因子的能力缺陷型宿主菌株常見的有SF562和HF7c.40載體------穿梭質(zhì)粒pGBT9,又稱DNA-BD質(zhì)粒載體。靶基因插入可與GAL4-BD形成融合蛋白Ⅰ。pGAD424，又稱AD質(zhì)粒載體。靶基因插入可與GAL4-AD形成融合蛋白Ⅱ。二者均可在大腸桿菌和釀酒酵母中自主復(fù)制。兩種融合蛋白可在酵母中高表達(dá)。在核定位序列作用下，進(jìn)入酵母細(xì)胞核內(nèi)。載體------穿梭質(zhì)粒pGBT9,又稱DNA-BD質(zhì)粒載41（ADH1:醇脫氫酶1）（ADH1:醇脫氫酶1