現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)技術(shù)概述課件

現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)技術(shù)概述研究思路

整體（動(dòng)物模型、ELISA）

組織、細(xì)胞（組織、細(xì)胞培養(yǎng)）

分子（RNA、DNA、Protein）

基因（基因克隆）整體研究動(dòng)物模型自發(fā)性動(dòng)物模型（SpontaneousAnimalModels）是指實(shí)驗(yàn)動(dòng)物未經(jīng)任何有意識(shí)的人工處置，在自然情況下所發(fā)生的疾病。這類模型在遺傳病、代謝病、免疫缺陷病、內(nèi)分泌疾病和腫瘤等方面的應(yīng)用正日益增多。誘發(fā)性或?qū)嶒?yàn)性動(dòng)物模型（ExperimentalAnimalModels）是指研究者通過(guò)使用物理的、化學(xué)的和生物的致病因素作用于動(dòng)物，造成動(dòng)物組織、器官或全身一定的損害，出現(xiàn)某些類似人類疾病時(shí)的功能、代謝或毒使動(dòng)物患相應(yīng)的傳染病，又如用化學(xué)致癌劑、放射線、致癌病毒誘發(fā)動(dòng)物的腫瘤等。是藥物篩選研究工作所首選。

ELISAELISA可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。三個(gè)必要的試劑：（1）固相的抗菌素原或抗體，即“免疫吸附劑”（immunosorbent）；（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體，稱為“結(jié)合物”（conjugate）（3）酶反應(yīng)的底物。ELISA雙抗體夾心法測(cè)抗原

雙抗原夾心法測(cè)抗體

組織、細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)：將取得的組織、細(xì)胞接入培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中的過(guò)程稱為培養(yǎng)。

理論上講各種動(dòng)物和人體內(nèi)的所有組織都可以用于培養(yǎng)，實(shí)際上幼體組織（尤其是胚胎組織）比成年個(gè)體的組織容易培養(yǎng)，分化程度低的組織比分化高的容易培養(yǎng)，腫瘤組織比正常組織容易培養(yǎng)。組織、細(xì)胞培養(yǎng)組織塊培養(yǎng)：直接將組織塊接入培養(yǎng)器皿底部，幾個(gè)小時(shí)后組織塊可貼牢在底部，再加入培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)：一般應(yīng)在接入培養(yǎng)器皿之前進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，按要求以一定的量（以每毫升細(xì)胞數(shù)表示）接入培養(yǎng)器皿并直接加入培養(yǎng)基。細(xì)胞進(jìn)入培養(yǎng)器皿后，立即放入培養(yǎng)箱中，使細(xì)胞盡早進(jìn)入生長(zhǎng)狀態(tài)。CO2培養(yǎng)箱

分子水平研究

轉(zhuǎn)錄

翻譯

DNA

RNA

Protein

逆轉(zhuǎn)錄

中心法則核酸制備步驟破碎細(xì)胞提取純化總RNA的提取

RNA的提取目前階段主要可采用兩種途徑：1)提取總核酸，再用氯化鋰將RNA沉淀出來(lái)；2)直接在酸性條件下抽提，酸性下DNA與蛋白質(zhì)進(jìn)入有機(jī)相而RNA留在水相關(guān)鍵的是抑制ＲＮＡ酶活性

TRIZOL法

TRIZOL試劑是直接從細(xì)胞或組織中提取總RNA的試劑。它在破碎和溶解細(xì)胞時(shí)能保持RNA的完整性。氯仿離心，樣品分成水樣層和有機(jī)層。RNA存在于水樣層中。異丙醇沉淀還原水樣層中的RNA。在除去水樣層后，樣品中的DNA和蛋白也能相繼以沉淀的方式還原。乙醇沉淀能析出中間層的DNA，在有機(jī)層中加入異丙醇能沉淀出蛋白。

完整RNA的提取和純化,是進(jìn)行RNA方面的研究工作,如Nothern雜交、mRNA分離、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及體外翻譯等的前提DNA的提取從各種材料中提取DNA方法不同，分離提取的難易程度也不同。對(duì)于低等生物如從病毒中提取DNA比較容易，多數(shù)病毒DNA分子量較小，提取時(shí)易保持其結(jié)構(gòu)完整性。從細(xì)菌及高等動(dòng)植物中提取DNA難度大一些。細(xì)菌DNA分子量較大，一般達(dá)2×10道爾頓。因此易被機(jī)械張力剪斷。細(xì)菌DNA，除核DNA外，還有質(zhì)粒DNA等。蛋白質(zhì)提取基本步驟：清洗組織/細(xì)胞（緩沖鹽液）裂解細(xì)胞（裂解液）離心去除膜組分等獲得可溶性蛋白質(zhì)純化（離心、層析、電泳等）電泳概念：帶電物質(zhì)在電場(chǎng)中向相反電極移動(dòng)的現(xiàn)象稱為電泳（electrophoresis）。原理：在一定pH條件下，每一種分子都具有特定的電荷（種類和數(shù)量）、大小和形狀，在一定時(shí)間內(nèi)它們?cè)谙嗤妶?chǎng)中泳動(dòng)速度不同，各自集中到特定的位置上而形成緊密的泳動(dòng)帶。當(dāng)用低濃度的熒光嵌入染料溴化乙啶(Ethidiumbromide,EB)染色,在紫外光下至少可以檢出1-10ng的DNA條帶,從而可以確定DNA片段在凝膠中的位置。此外,還可以從電泳后的凝膠中回收特定的DNA條帶，用于以后的克隆操作。瓊脂糖凝膠電泳

瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂或瓊脂糖作支持介質(zhì)的一種電泳方法。對(duì)于分子量較大的樣品，如大分子核酸、病毒等，一般可采用孔徑較大的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離。

瓊脂糖凝膠分離DNA片度大小范圍較廣,不同濃度瓊脂糖凝膠可分離長(zhǎng)度從200bp至近50kb的DNA片段。其分辨率比聚丙烯酰胺凝膠低，但制備容易，分離范圍廣，尤其適于分離大片段DNA。瓊脂糖通常用水平裝置在強(qiáng)度和方向恒定的電場(chǎng)下電泳。

聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種電泳方法。

聚丙烯酰胺凝膠具有機(jī)械強(qiáng)度好，有彈性，透明，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，對(duì)pH和溫度變化小，沒(méi)有吸附和電滲作用小的特點(diǎn)。用于核酸和蛋白質(zhì)的分離、純化及檢測(cè)。聚丙烯酰胺分離小片段DNA(5-500bp)效果較好,其分辯力極高。

聚丙烯酰胺凝膠電泳按原理和操作形式的不同，主要有不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳，雙向電泳等類型。水平板式電泳槽垂直板式電泳槽反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Reversetranscription-Polymerasechainreaction）

抽提RNA總RNARTcDNAPCRDNAAnalysis:QuantificationorcDNAcloneRT－PCRPCR－聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外高效、快速、特異地?cái)U(kuò)增目的基因或DNA片段。原理：類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制在試管中的DNA的體外合成。用于基因分離克隆，序列分析，基因表達(dá)調(diào)控，基因多態(tài)性研究等許多方面?！簟簟粢?引物2模板PCR原理示意圖目的基因增加2n20～30循環(huán)94℃變性5’3’3’5’變性94℃引物退火45-65℃延伸72℃PCR過(guò)程示意圖模板PCR反應(yīng)產(chǎn)物積累規(guī)律示意圖平臺(tái)期產(chǎn)物量時(shí)間（循環(huán)數(shù)）PCR反應(yīng)五要素引物（primer）酶（TaqDNApolymerase）dNTP（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）模板（template）Mg2+（magnesium）實(shí)時(shí)熒光定量PCR常規(guī)PCR：借助電泳對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)的終產(chǎn)物進(jìn)行半定量及定性分析實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)：利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，最終精確的對(duì)起始模板的定量分析淬滅基團(tuán)R熒光定量PCR示意圖模板DNADNA探針RQQ報(bào)告基團(tuán)WesternBlotting§印跡法（blotting）是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用相應(yīng)的探測(cè)反應(yīng)來(lái)檢測(cè)樣品的一種方法?！?975年，Southern建立了將DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA雜交檢測(cè)特定的DNA片段的方法，稱為Southern印跡法?！於笕藗冇妙愃频姆椒?，對(duì)RNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行印跡分析，對(duì)RNA的印跡分析稱為Northern印跡法，對(duì)單向電泳后的蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Western印跡法，對(duì)雙向電泳后蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Eastern印跡法。WesternBlotting蛋白質(zhì)分離：十二烷基磺酸鈉―聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)?。旱鞍踪|(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC）上，稱為一個(gè)印跡（blot）固相免疫測(cè)定(ECL)：一抗、酶標(biāo)二抗、底物NorthernBlottingRNA片段經(jīng)電泳后,從凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上,然后用探針雜交。被檢對(duì)象為RNA,探針為DNA或RNA。應(yīng)用：檢測(cè)某一組織或細(xì)胞中已知的特異mRNA的表達(dá)水平。比較不同組織或細(xì)胞的同一基因的表達(dá)情況。提取RNA瓊脂糖凝膠變性電泳堿變性、轉(zhuǎn)移到NC膜與DNA或RNA探針雜交放射自顯影Northern印跡雜交NorthernBlottingRNA分離：瓊脂糖凝膠變性電泳（去除RNA

中的二級(jí)結(jié)構(gòu),保證RNA完全按分子大小分離）RNA轉(zhuǎn)?。篟NA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上探針雜交X光片進(jìn)行放射自顯影

pancreaskidneyskeletalliverlungplacentabrainheartGEFmRNANorthernblottinghybridization基因克隆

基因克?。ǚ肿涌寺olecularcloning）應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將目的基因與載體DNA結(jié)合成一具有自我復(fù)制能力的DNA分子（復(fù)制子、重組體），繼而通過(guò)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞、篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增、提取獲得大量同一DNA分子拷貝，或其表達(dá)產(chǎn)物?；蚩寺∈疽鈭D基本步驟提取目的基因:人工基因合成法(RT-PCR)目的基因與載體結(jié)合:限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞:轉(zhuǎn)化目的基因的檢測(cè)和表達(dá):無(wú)表達(dá)產(chǎn)物無(wú)表達(dá)產(chǎn)物有表達(dá)產(chǎn)物無(wú)表達(dá)產(chǎn)物載體（Vector）：是指運(yùn)載外源DNA有效進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)的工具。

限制性核酸內(nèi)切酶：切割DNADNA連接酶：生成3’－5’磷酸二酯鍵原核載體：質(zhì)粒(pBR322,pUC…）、噬菌