食品檢驗(yàn)選修12碩士6課件

第五章食品中獸藥殘留的檢驗(yàn)第一節(jié)概述一、食品中獸藥殘留的來(lái)源獸藥（veterinarydrugs）是指用于預(yù)防、治療和診斷動(dòng)物疾病或者有目的的調(diào)節(jié)動(dòng)物生理機(jī)能并規(guī)定作用、用途、用法、用量的物質(zhì)。主要包括：血清制品、疫苗、診斷制品、中藥材、中成藥、化學(xué)藥品、抗生素、生化藥品、放射性藥品及外用殺蟲劑、消毒劑等。獸藥殘留是指食品動(dòng)物用藥后，動(dòng)物性食品中含有某種獸藥的原型或其代謝產(chǎn)物以及與獸藥有關(guān)的雜質(zhì)殘留。主要?dú)埩舻墨F藥是抗生素類、激素藥類和驅(qū)蟲藥類。合理使用獸藥可以預(yù)防、治療和診斷動(dòng)物疾病，調(diào)節(jié)動(dòng)物生理機(jī)能，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)和繁殖，改善動(dòng)物食品或其乳制品的品質(zhì)。如果濫用獸藥，會(huì)造成動(dòng)物性食品種獸藥殘留，對(duì)人體造成危害。獸藥殘留的主要原因：3.動(dòng)物性食品保鮮

動(dòng)物性食品在運(yùn)輸和保存過(guò)程中，為了保鮮，加入某種抗生素以抑制微生物生長(zhǎng)繁殖，造成藥物殘留二、獸藥殘留的危害（一）毒性作用1.急性中毒如攝入含瘦肉精（鹽酸克倫特羅）殘留的豬肉或其肝、肺等內(nèi)臟后，會(huì)產(chǎn)生心悸、惡心、頭暈、肌肉震顫等急性中毒反應(yīng)。2.慢性中毒長(zhǎng)期食用含有殘留獸藥的動(dòng)物性食品，獸藥可在體內(nèi)不斷蓄積，到一定程度后，就會(huì)對(duì)人產(chǎn)生毒性作用。如磺胺類藥物可引起腎損害。3.“三致”作用如苯丙咪唑類抗蠕蟲藥能引起細(xì)胞染色體突變和致畸胎作用，妊娠婦女?dāng)z入過(guò)量苯丙咪唑類藥物殘留的動(dòng)物性食品，可能發(fā)生胎兒畸型。（二）耐藥性動(dòng)物反復(fù)接觸某種抗生素，體內(nèi)耐藥菌株大量繁殖，這些耐藥菌株通過(guò)動(dòng)物性食品傳給人，可能給疾病治療帶來(lái)困難。（三）過(guò)敏反應(yīng)青霉素、四環(huán)素、磺胺類藥物等能使部分人群發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)。當(dāng)攝入含這些抗生素殘留的動(dòng)物食品時(shí)，會(huì)使這部分人致敏，產(chǎn)生抗體。當(dāng)這些個(gè)體再接觸這些抗生素時(shí)，這些抗生素就會(huì)與抗體結(jié)合形成抗原抗體結(jié)合物，可能再次發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)。（四）激素（樣）作用具有激素樣活性的化合物作為同化劑用于畜牧。深部肌肉注射同化劑屬非法用藥。若埋植或注射同化激素后不久就將動(dòng)物宰殺，會(huì)有大量同化激素殘留，被人食入后可產(chǎn)生一系列激素樣作用。如潛在致癌性，發(fā)育毒性（兒童性早熟）等。

三、獸藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)和檢驗(yàn)方法我國(guó)農(nóng)業(yè)部2002年頒布了最新的獸藥在《動(dòng)物性食品中最高殘留限量》，可用于動(dòng)物食品，不需要制定最高殘留限量的藥物有88種；需制定最高殘留限量的有94種；可以使用，但不得檢出殘留的藥物有9種；禁止使用，且不得檢出殘留的藥物有31種。目前，我國(guó)已建立了40種動(dòng)物源性食品中獸藥殘留標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法，包括國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)。主要有氣相色譜法、高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫法（ELISA）和儀器聯(lián)用技術(shù)法。大多數(shù)獸藥極性和沸點(diǎn)偏高，使GC法的使用受到限制。HPLC法應(yīng)用的較多，但對(duì)某些獸藥殘留，檢出限達(dá)不到要求，如水產(chǎn)品中鏈霉素的殘留限量要求小于0.1μg/kg

（歐盟標(biāo)準(zhǔn)）。聯(lián)用技術(shù)優(yōu)勢(shì)結(jié)合，準(zhǔn)確度、靈敏度、選擇性都高，是國(guó)際上公認(rèn)和確認(rèn)的方法。包括GC-MS、LC-MS、LC-MS/MS、TLC-MS等。第二節(jié)食品中抗生素類獸藥殘留檢驗(yàn)一、四環(huán)素類抗生素的檢驗(yàn)1.四環(huán)素類抗生素的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)四環(huán)素類抗生素是家禽、家畜常用的防病治病藥物，包括四環(huán)素（TC）、土霉素（OTC）、金霉素（CTC）?；窘Y(jié)構(gòu)是十二氫化并四苯：TC、OTC、CTC的區(qū)別在于結(jié)構(gòu)式中R5和R7位上連接不同的離子或基團(tuán)。四環(huán)素類抗生素的理化性質(zhì)：使用該類抗生素如果在動(dòng)物宰殺時(shí)休藥期不夠，容易在動(dòng)物體內(nèi)造成殘留。制作工作曲線：取一定量切碎肉樣分別加不同濃度的TC、OTC和CTC混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按樣品處理方法處理后進(jìn)樣測(cè)定。標(biāo)樣濃度為橫坐標(biāo)，峰高為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線。樣品測(cè)定后，依標(biāo)準(zhǔn)曲線確定其濃度。出峰順序?yàn)椋和撩顾亍⑺沫h(huán)素、金霉素。二、氯霉素類抗生素的檢驗(yàn)氯霉素類獸藥包括氯霉素（CAP）、無(wú)味氯霉素（CRP）、乙酰氯霉素（CF）、甲砜霉素（TAP）、氟甲砜霉素（FF）等。CAPs對(duì)骨髓細(xì)胞、肝細(xì)胞有毒性作用，可導(dǎo)致氯霉素敏感者發(fā)生嚴(yán)重的再生障礙性貧血，規(guī)定為在動(dòng)物性食品中不得檢出。（1）氣相色譜法1）原理樣品經(jīng)提取、凈化、衍生化后，用毛細(xì)管氣相色譜分離，電子捕獲檢測(cè)器檢測(cè)。2）樣品處理取適量樣品，加乙腈提取，提取液過(guò)SPEC18柱凈化，凈化后用N，O-二（三甲基硅烷）三氯乙酸銨＋三甲基氯硅烷衍生化。3）測(cè)定HP-5毛細(xì)管色譜柱，程序升溫，檢測(cè)器溫度320℃，He氣作載氣。衍生的目的是使獸藥分子中的極性基團(tuán)，如羥基、氨基、羧基等變成弱極性，使化合物更易于揮發(fā)，適合GC分析要求。本法常用于牛奶中氯霉素類抗生素殘留的檢驗(yàn)。（2）高效液相色譜-質(zhì)譜法1）原理被分析物用乙酸乙酯提取，提取液濃縮后再用水溶解，固相萃取凈化，HPLC-MS測(cè)定。3）測(cè)定液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜儀，電噴霧離子源，C18柱，柱溫30℃，離子源溫度450℃，乙腈＋水（20＋80）流動(dòng)相，定性定量測(cè)定。氯霉素參考保留時(shí)間12.31min。本法為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法，適用于蜂蜜中CAP殘留測(cè)定，檢測(cè)限為2ng/g，采用于CAPs的確認(rèn)實(shí)驗(yàn)。三、磺胺類獸藥殘留檢驗(yàn)1.磺胺類獸藥的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)磺胺類藥（SAs）物具有氨基苯磺酰胺基本結(jié)構(gòu)，常用的有磺胺嘧啶（SD）、磺胺甲惡唑（SMZ）、磺胺甲氧嘧啶（SMM）、磺胺二甲基嘧啶（SM2）等。磺胺類藥物對(duì)某些人有致敏作用，易引起皮膚騷癢和蕁麻疹，重者引起血管性水腫，甚至出現(xiàn)死亡。在體內(nèi)蓄積達(dá)到一定程度，對(duì)肝、腎副作用大，還可以影響人的造血系統(tǒng)。中國(guó)和歐美等大多數(shù)國(guó)家規(guī)定動(dòng)物性食品和飼料中的SAs總量≤0.01mg/kg，日本規(guī)定動(dòng)物性食品中不得檢出SAs。檢驗(yàn)方法有HPLC法、GC法、GC-MS法、ELISA法、TLC法和分光光度法。HPLC是最常用的方法。2.HPLC法測(cè)定磺胺類獸藥殘留1）原理用乙酸乙酯提取被分析物，加正己烷萃取除去脂肪，過(guò)氧化鋁柱凈化去雜質(zhì)，減壓干燥后殘留物用流動(dòng)相溶解，高效液相色譜測(cè)定。2）樣品處理取適量樣品，加乙腈和少許無(wú)水硫酸鈉作2次均質(zhì)化處理，合并上清液，加適量正己烷振蕩除去樣品中的脂溶性雜質(zhì)，離心，棄去正己烷層。下層液體加適量正丙醇于50℃減壓干燥，加乙腈溶解殘留物，過(guò)氧化鋁B小柱，用95％乙腈洗脫雜質(zhì)，用70％乙腈洗脫被測(cè)組分，收集洗脫液，加適量正丙醇，50℃減壓干燥后，準(zhǔn)確加入一定量流動(dòng)相溶解殘留物，待測(cè)定。3）測(cè)定色譜柱：C18柱（4.6mm×250mm，5μm），流動(dòng)相：乙腈＋甲醇＋水＋乙酸（2+2+9+0.2），紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)270nm，進(jìn)樣量：20μl?；前奉愃幬镒畲笪詹ㄩL(zhǎng)在260nm～280nm，本法同時(shí)測(cè)定多種磺胺類藥物，因此選擇270nm為測(cè)定波長(zhǎng)。4)方法說(shuō)明磺胺類藥物極性較強(qiáng)，95%乙腈的極性較小，洗脫能力較弱，僅能洗脫雜質(zhì)；70%乙腈溶液相對(duì)極性較大，能洗脫氧化鋁小柱中吸附的磺胺類藥物。氧化鋁有酸性、中性和堿性三種，氧化鋁B為堿性氧化鋁。四、硝基呋喃類獸藥殘留檢驗(yàn)1.概述硝基呋喃類（NFs）藥物包括：呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因等。硝基呋喃分子式：C8H7N3O5結(jié)構(gòu)為：黃色粉末，無(wú)臭、味苦，能溶于二甲基甲酰胺，在水、乙醇、三氯甲烷中微溶。硝基呋喃類藥物及代謝物均可使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物發(fā)生癌變和基因突變。國(guó)際食品法典委員會(huì)、中國(guó)和歐盟等大多數(shù)國(guó)家禁止使用此類獸藥。測(cè)定硝基呋喃類藥物的方法有:HPLC法、GC法、LC-MS法、ELISA法,最常用的是HPLC法。2.HPLC法測(cè)定畜禽肉中呋喃唑酮1）原理用乙酸乙酯洗脫C18填料吸附的被分析物，減壓濃縮至干，用乙腈－磷酸－水混合液溶解，過(guò)氧化鋁小柱后供HPLC檢測(cè)。2）樣品處理取適量蓄禽肉樣品，按1:1.5的質(zhì)量比加入C18填料，混勻后裝入玻璃層析柱中。用正己烷淋洗，去除脂肪。再用乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液。在55℃～60℃下減壓濃縮至干，加少量乙腈－磷酸－水混合液溶解殘?jiān)?，過(guò)氧化鋁小柱凈化，洗脫液供HPLC測(cè)定。3）測(cè)定C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈＋0.015mol/LH3PO4（2+8），流速0.7ml/min～1.0ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)367nm。用流動(dòng)相稀釋標(biāo)準(zhǔn)系列，經(jīng)氧化鋁小柱凈化依次測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)系列和樣品。本法適于雞的肌肉、肝、腎組織和魚肉組織中呋喃唑酮?dú)埩魷y(cè)定。第三節(jié)鹽酸克倫特羅殘留的檢驗(yàn)一、概述鹽酸克倫特羅商品名有咳喘素、息喘寧，俗名瘦肉精，結(jié)構(gòu)為：化學(xué)名為α-〔（叔丁氨基）甲基〕-4-氨基-3,5二氯苯甲醇鹽酸鹽。分子式:C12H18Cl2N2O-HCl白色結(jié)晶粉末，無(wú)臭、味苦。溶于水、乙醇，微溶與丙酮，不溶于乙醚?；瘜W(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，一般條件不能將其破壞，加入至172℃分解。含有鹽酸克倫特羅的肉食品加工時(shí)經(jīng)100℃沸水、燒烤、微波處理等過(guò)程其殘留不減少。鹽酸克倫特羅具有調(diào)節(jié)動(dòng)物神經(jīng)興奮功能，一次性攝入大量瘦肉精，會(huì)出現(xiàn)急性中毒反應(yīng)。長(zhǎng)期食用可致染色體畸變，誘發(fā)惡性腫瘤等。鑒于它的副作用，被列為禁止使用的飼料添加劑。WHO和FDA規(guī)定鹽酸克倫特羅在動(dòng)物體內(nèi)的最高殘留限量為肉0.2μg/kg；肝、腎0.6μg/kg；奶0.05μg/kg，我國(guó)規(guī)定的殘留限量為牛、馬肌肉0.1μg/kg；肝、腎0.5μg/kg；牛奶0.05μg/kg。二、鹽酸克倫特羅殘留的檢測(cè)1.GC-MS法1）原理

用高氯酸溶液勻漿樣品，超聲波輔助提取后凈化處理，經(jīng)N,O-雙三甲基硅烷三氟乙酰胺（BSTAF）衍生后用GC-MS測(cè)定，內(nèi)標(biāo)法定量。2）樣品處理（1）提取：取適量肉樣品，加一定量0.1mol/L高氯酸勻漿，超聲波輔助提取后置于80℃水浴，冷卻后離心，取上清液。沉淀用高氯酸洗滌，再離心，合并上清液。加入氯化鈉，混勻，用異丙醇+乙酸乙酯（40＋60）振蕩提取，取上層有機(jī)相，水相用異丙醇－乙酸乙酯再提取一次，合并有機(jī)相，用60℃水浴蒸發(fā)至近干。（2）凈化用乙醇、水、NaH2PO4緩沖液、水依次清洗陽(yáng)離子交換柱；然后取適量樣液過(guò)柱；分別用水、乙醇淋洗去雜質(zhì)；最后用乙醇＋濃氨水（98+2）洗脫分析物；收集洗脫液，吹氮?dú)鉂饪s至干。（3）衍生化凈化后試樣殘?jiān)右掖己蛢?nèi)標(biāo)物：1-異丙氨基-3-〔對(duì)-（2-甲氧基）苯氧基〕-2-丙醇L（＋）酒石酸鹽（美托洛爾），迅速加入衍生劑（BSTAF），密閉，于75℃衍生化。蒸干后用適量甲苯定容，待用。鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)系列同時(shí)衍生化。

3）測(cè)定毛細(xì)管色譜柱（30m×0.25mm），載氣：He（99.99%），進(jìn)樣口溫度240℃，進(jìn)樣量1μl，質(zhì)譜特征離子峰：鹽酸克倫特羅：m/z86、187、243、262；美托洛爾：m/z72、223。取1μl樣品衍生液或標(biāo)準(zhǔn)系列衍生液注入GC-MS儀，以試樣峰（m/z86、187、243、262）與內(nèi)標(biāo)峰（m/z72、223）的相對(duì)保留值定性，以試樣峰（m/z86）和內(nèi)標(biāo)峰（m/z72）的峰面積比值單點(diǎn)或多點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)定量。4）方法說(shuō)明采用超聲波輔助提取，介質(zhì)中的微小氣泡爆裂，有破碎細(xì)胞壁的作用，加速殘留獸藥溶出；加氯化鈉起液－液萃取時(shí)防止乳化作用；衍生化前凈化處理，防止有相同官能團(tuán)雜質(zhì)生成衍生物干擾測(cè)定。2.酶聯(lián)免疫（ELISA）法ELISA法是國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法（GB/T5009.192-2003）的第三法，目前國(guó)內(nèi)多用ELISA法篩選，GC-MS或HPLC法確認(rèn)。酶聯(lián)免疫法基于抗原抗體競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)進(jìn)行測(cè)定。微孔板包被有克倫特羅IgG抗體，加入競(jìng)爭(zhēng)性酶標(biāo)記克倫特羅和標(biāo)準(zhǔn)（或試樣）溶液?？藗愄亓_與酶標(biāo)記克倫特羅競(jìng)爭(zhēng)克倫特羅抗體，沒(méi)與抗體結(jié)合的酶標(biāo)記克倫特羅在洗滌步驟中被除去。加入底物和發(fā)色劑于微孔板，標(biāo)記物上的酶催化底物反應(yīng)使無(wú)色發(fā)色劑轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)色，加入反應(yīng)停止液使顏色由藍(lán)轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。在波長(zhǎng)450nm處測(cè)定吸光度值，與克倫特羅濃度成反比。樣品前處理（提取、凈化）步驟與GC-MS法相同，采用試劑盒進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)，用分光光度計(jì)測(cè)定。第四節(jié)激素類獸藥殘留的檢驗(yàn)一、概述激素（hormone)包括同化激素和其他生長(zhǎng)促進(jìn)劑。甾體類同化激素：雄激素類（甲基睪酮、苯丙酸諾龍等；雌激素類：雌二醇、炔雌醇等；非甾體類同化激素，如己烯雌酚、雙烯雌酚等；孕激素類：孕酮、炔諾酮等。雌激素類是18個(gè)碳原子雌烴為基本結(jié)構(gòu)；雄激素類是以19個(gè)碳原子雄烴為基本結(jié)構(gòu)；孕激素類是以21個(gè)碳原子雄烴為基本結(jié)構(gòu)。同化激素一般是白色結(jié)晶或粉末，不溶于水，易溶于乙醚、乙醇、丙酮、三氯甲烷等有機(jī)溶劑。激素殘留對(duì)人體健康的危害是：擾亂激素平衡、導(dǎo)致內(nèi)分泌相關(guān)腫瘤、出生缺陷、生育缺陷、性早熟、男性女性化，誘發(fā)女性乳腺癌、卵巢癌等疾病。中國(guó)、歐盟和日本將同化激素列為所有食品動(dòng)物禁用物質(zhì)。檢驗(yàn)方法有熒光分析法、GC、HPLC和GC-MS等。二、HPLC法測(cè)定蓄禽肉中己烯雌酚殘留1.原理用甲醇提取分析物，高效液相色譜儀測(cè)定，于波長(zhǎng)230nm處測(cè)定吸光度，同樣條件下繪制工作曲線，采用工作曲線法定量。2.樣品處理準(zhǔn)確稱取適量絞碎肉樣，加甲醇充分?jǐn)嚢?，振蕩提取，離心，移出上清液，重復(fù)提取2次，合并上清液，