血漿病毒滅活研究進(jìn)展

LagneauxL,DelforgeA,SnoeckR,etal.JInfectDis,1996;174(5):913～919MoriT,AndoK,TanakaK,etal.Blood,

89(10):5～dreH,RollagH,OlafsenMD,etal.APMIS,2000;108:223～230血漿滅活研究進(jìn)中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué) (廣州聶綜述吳審摘要]隨著醫(yī)學(xué)科學(xué)的進(jìn)步血液的安全性愈來(lái)愈受到關(guān)注。為了提高血液的安全性在血液檢測(cè)項(xiàng)目逐漸增加的同時(shí),血液檢測(cè)技術(shù)也在不斷改進(jìn)。然而,由于血液后窗口期的存在,血液輸注仍無(wú)法達(dá)到零風(fēng)險(xiǎn)”在臨床輸血中血漿的輸注占有較大的比例;而血漿中也是含量較多的血液成分之一近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的血漿滅活技術(shù)在提高血漿安全性方面具有一定的潛力。血漿滅活的技術(shù)很多目前比較成技術(shù)有兩種:溶劑去污劑方法和亞甲基藍(lán)聯(lián)合可見(jiàn)光照射方法;此外,以核酸為靶點(diǎn)的光化學(xué)技術(shù)倍受矚目。在過(guò)去的50,隨著塑料采血袋的應(yīng)用,抗凝劑以及血細(xì)胞保存方法的不斷改進(jìn),血庫(kù)更好地滿(mǎn)足了臨床用血的需要。今天,隨著醫(yī),臨床用血不斷提高,成分輸血比例不斷增長(zhǎng),公眾對(duì)醫(yī)學(xué)的認(rèn)知水平和法律意識(shí)也不斷增強(qiáng),血液的安全性愈來(lái)愈受到關(guān)注。為了提高血液的安全性,在血液檢測(cè)項(xiàng)目逐漸增加的同時(shí),血液檢測(cè)技術(shù)也在不斷改進(jìn)。到目前為止,對(duì)于輸血的檢測(cè)方法已不僅僅局限于學(xué)的檢測(cè),在世界許多發(fā)達(dá)國(guó)家已采用的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù),如核酸檢(NAT),在我國(guó)的一些血站也在開(kāi)展了這一項(xiàng)目[1-3。盡管血液檢測(cè)的水平不斷提高血液的輸注仍存在著風(fēng)險(xiǎn)。其原因有二:一是檢測(cè)方法具有一定的局限性,還不能檢出少數(shù)血液中的和微生物,尤其是對(duì)于“窗口期”的血液,漏檢的可能性很大:播的還未列入常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目,也著血液的安全[,。55%,血漿的輸注在各種血液成分的輸注中占有很大的比例;同時(shí),由于輸血在各種血液成分中并不是均勻分布各種血液成分的性也不一樣,

細(xì)胞和血小板相對(duì)較安全。因此如何減少血漿血醫(yī)學(xué)中關(guān)注的課題。近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的血液成分滅活技術(shù),在提高輸血安全性方面具有一定潛力[56。血漿輸注具有、細(xì)菌、微生物等引起的疾病潛在的。通常認(rèn)為,HBV,HCV,CMV和逆轉(zhuǎn)錄(如HIV和HTLV)均可以通過(guò)血漿輸注。一份來(lái)自的報(bào)告顯示,輸注一個(gè)單位的全血血液成分的率:HBVl/63000;HCV約為1100HIV1680000[7某些微生物,如錐蟲(chóng)屬和巴貝蟲(chóng)屬類(lèi)微生物也可以通過(guò)血漿傳現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)存在的缺的面對(duì)血液成分安全的,檢測(cè)血液的技術(shù)也在不斷改進(jìn)。但是,現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)還存 的血液仍有可能逃避檢測(cè)系統(tǒng),成為疾病的。絕大多數(shù)對(duì)血液的檢測(cè)仍停留在學(xué)水平,對(duì)于HBV,HCV,HIV的檢測(cè)采用標(biāo)志物酶標(biāo)技術(shù)完成由于“窗口期”的存在,已的血液標(biāo)志物(HCV和HIV抗體,HBV表面抗原)的檢測(cè)可以為,造成不合格血液的漏檢[8,9。據(jù),約90%的漏檢血液是由于“窗口期”原因,血液中心的研究提示我國(guó)的情況也是如此[10。某些開(kāi)發(fā)了核酸檢測(cè)技術(shù)(NAT),提高了檢出的幾率,HBVDNA56天的“窗口期”間含量很低,NAT很難檢測(cè)到;對(duì)于HCV,也存在這樣的問(wèn)題。曾有人過(guò)輸注經(jīng)NAT檢測(cè)合格的血液后了HCV的病例[11。此外,NAT費(fèi)用昂貴,也成為推廣應(yīng)用的。不僅如此,CMV,HAV,HEV微小B19,細(xì)菌和微生物篩選并未列入常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目,也是血液輸注的安全隱患[12。血漿滅活技為了進(jìn)一步提高輸注血液的安全性,在不斷改進(jìn)檢測(cè)技術(shù)的同時(shí),許多開(kāi)始了血液成分滅活技術(shù)的研究。血漿的滅活對(duì)于血漿滅活的技術(shù)很多,目前比較成技術(shù)有兩種:溶劑去污劑方法和亞甲基藍(lán)聯(lián)合可見(jiàn)光照射方法。由于上述兩種方法仍存在一定的缺點(diǎn),研究者們?nèi)栽谔剿餍碌难獫{滅活方法,其中以核酸為靶點(diǎn)的光化學(xué)技3.1/(solvent/detergent,S/D)。SD2500人份、同型、融化的新鮮冰凍血漿混合(400ml全血分離1人份),1%3-N丁酸磷酸鹽[tri(n-butyl)phosphate,TNBP]和去污劑1%TritonX-100,在31℃孵育4小時(shí),用大豆C-18,由此的的血漿經(jīng)無(wú)菌過(guò)濾裝于200ml塑料袋,再次冰凍,于-30℃保存13,1。經(jīng)過(guò)SD方法處理血漿后,可以滅活脂包膜如HBV、HCV、HIV-1/、HTLV-I/Ⅱ和CMV,該血漿也不會(huì)這些無(wú)法測(cè)定的突變型或尚不知名的脂包膜;然而,S/D方法對(duì)于非脂包膜如HAV和微小病

B19沒(méi)有滅活作用。S/D方法處理的血漿仍具有潛在的[15。有研究表明,經(jīng)過(guò)S/D方法處理的血漿,其中某些血漿蛋白,如纖維30%,-C50S/D方法處理的血漿中含有的其它凝血因子水平與FFP相近。都與FFP相似,纖維蛋白原含量不少于1.8mg/ml,但蛋白C和蛋白S水平比FFP減少20%～40%,與過(guò)S/D處理的血漿相比,vonWillebrand因子多倍體水平減少最多。它以標(biāo)準(zhǔn)化劑量供應(yīng),并含有恒定的凝血因子和其它有用蛋白量SD處理的血漿對(duì)治療性凝血因子缺乏,頻繁輸入大量血漿的血栓性血小板減少性紫癜以及血漿交換具有特別重要的意[16然而,由于該技術(shù)要求大批量處理血漿,它更適合于血漿蛋白制品的原料血漿的滅活而無(wú)法處理臨床輸注的單份血漿[17。3.2亞甲基藍(lán)(methyleneblue,MB)聯(lián)合光照(Light)方法。亞甲基藍(lán)屬于吩噻嗪類(lèi)。吩噻嗪類(lèi)的合成最早由Caro在1876年報(bào)道,15年后,Ehrlich將其用來(lái)治療瘧疾。由于吩噻嗪類(lèi)既可與細(xì)胞膜上的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)結(jié)合,又可與核酸結(jié)合,經(jīng)過(guò)一定波長(zhǎng)的光照后,可產(chǎn)生活躍的氧原子,破壞脂包膜和阻止其[18。近年來(lái)有研究者用MB光照對(duì)某些RNA和DNA進(jìn)行滅活,取得了一定的效果。MB帶有正電荷,其陽(yáng)離子與核酸具有較高的親和力,尤其與鳥(niǎo)嘌呤殘基具有更好的親和作用。與此同時(shí),MB帶有正電荷,經(jīng)過(guò)一定波長(zhǎng)的可見(jiàn)光照射后,進(jìn)入激發(fā)狀態(tài):當(dāng)從激發(fā)態(tài)回到初態(tài)時(shí),它可釋放能量,傳遞給周破壞脂包膜,殺死。因此,該方法對(duì)于包膜和非包膜都有效[19。在我國(guó),MB/光照方法對(duì)血漿進(jìn)行滅活,實(shí)驗(yàn)表明:MB/光照滅活血漿中幾乎所有的有包膜都會(huì)被滅活,但對(duì)無(wú)包膜的沒(méi)有效果[20用該方法滅活,操作簡(jiǎn)單,只需將無(wú)菌MB直接加入融化的冰凍血漿中,用適當(dāng)波長(zhǎng)的光照處理,即可達(dá)到滅活的效果。MB/,VSV病毒(HIV的模型)和Sindbis(HCV的模型)滴度大大下降,達(dá)到國(guó)際公認(rèn)的血漿滅活有效性指標(biāo)但在整個(gè)過(guò)程中,應(yīng)嚴(yán)格控制滅活的條件。不同的滅活條件,滅活效果不同:MB的濃度、光照強(qiáng)度、光源波長(zhǎng)不同,滅活的效果迥異[18,19。該方法可完成對(duì)單人份血漿的滅活,不需象S/D處理的血漿在滅活后從血漿分離去污劑,整個(gè)操作過(guò)程簡(jiǎn)便易行。然而,該方法也具有一些無(wú)法克服的缺點(diǎn)。用該方法滅活后,血漿蛋白的含量和活性[21;此外,還有學(xué)者研究表明,MB在可以累積,具有潛在的致突變作用。在美國(guó),該方法沒(méi)有獲得FDA的。因此,該方法在世界范圍內(nèi)并沒(méi)有被所有國(guó)家采用[22,23。3.3以核酸為靶點(diǎn)的光化學(xué)技術(shù)。這種滅活病毒的技術(shù)也稱(chēng)為核酸打靶技術(shù)(nucleicacidedtechnology),通常應(yīng)用核酸特異性的加合物的形成(nucleicacidspecificadductformation)來(lái)介導(dǎo)滅活;近年來(lái)以補(bǔ)骨脂素介導(dǎo)的光化學(xué)技術(shù)已日趨成熟;B2.3.1補(bǔ)骨脂素聯(lián)合紫外線(UVA照射滅活的技術(shù)。補(bǔ)骨脂素分子能夠可逆地NN螺旋體中UVA照射后補(bǔ)骨脂素分子與核酸分子中嘧啶堿基共價(jià)結(jié)合。如補(bǔ)脂素分子相對(duì)或鄰嘧啶堿基之間,核酸鏈將共價(jià)交叉連接。如果交叉連接的DNA或RNA螺旋體不能得到及時(shí)修復(fù),就不能繼續(xù)完全或精確,DNA或RNA即被滅活DNARNA存在于細(xì)胞核內(nèi),而血漿中沒(méi)有有效的有核細(xì)胞治療成分,因而血漿本身并不成為補(bǔ)骨脂素技術(shù)的打靶點(diǎn),經(jīng)過(guò)上述滅活技術(shù)處理后,血漿的治療功能不會(huì)受到破壞[2

8-8-methoxypsoralen8-MOP)及其它一些皮膚病的藥物。1988年,有學(xué)者聯(lián)合應(yīng)用補(bǔ)骨脂素和長(zhǎng)波長(zhǎng)紫外光(UVA320～400nm滅活血漿中的HBV,結(jié)果取得了良好的效果。結(jié)果表明,不僅RNA和DNA可以被滅活,而且對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌也有效然而該技術(shù)是否對(duì)其它菌株的細(xì)菌和HIV-I也有效,還有待進(jìn)一步證實(shí)。8-MOP滅活具有安全性。與治療牛癬和其它皮膚病的藥量相比,滅活使用的8-MOP劑量是很小的。給最大滅活劑量的8-MOP,沒(méi)有發(fā)現(xiàn)不良的副作用。但用8-MOP光化學(xué)技術(shù)滅活需要時(shí)間較長(zhǎng),一般需1～6小時(shí),在如此長(zhǎng)時(shí)間的紫外光照射之下,血漿中有效的治療成分——不穩(wěn)定的凝血V和可能失活,研究者們還在不斷尋求更有效的滅活的技術(shù)。3.3.1.2S-59介導(dǎo)的光化學(xué)技術(shù)。最近,Lin及其合作者了一種新的補(bǔ)骨脂內(nèi)酯衍生物S-59,其商品名為amotosalen,它是從100多種新的補(bǔ)骨脂內(nèi)酯衍生物,可以有效滅活。HCV(105)HBV1055)人的濃縮血小板(300ml),然后用S-59處理污染的血小板,將處理后的血小板輸注給黑猩猩,沒(méi)有發(fā)現(xiàn)黑猩猩乙型和丙型肝炎26。其它的研究表明:S-59處理的血小板,保存期間可以滅活高水平的T細(xì)胞,抑制白細(xì)胞的細(xì)胞和合成,抑制DNA和RNA的擴(kuò)增。更重要的是,S-59滅活T細(xì)胞后,可以防止免疫正?；蛎庖呷毕莸氖笠浦材Ｐ桶l(fā)生TA-GVHD[27。S-介導(dǎo)的滅活的技術(shù)對(duì)于血漿的。于DNA或RNA,達(dá)到滅活的效果。一是S-59雙鏈DNA或RNA:二是經(jīng)過(guò)長(zhǎng)波長(zhǎng)紫外線照射,S-59共價(jià)結(jié)合在DNA或RNA的一條單鏈上,(monoadduct);三是進(jìn)一步的光照引起單加合DNARNA的第二條鏈反應(yīng),形成共價(jià)交聯(lián)物,從而阻斷DNA或RNA的、轉(zhuǎn)錄和翻譯,達(dá)到滅活的效果。光照結(jié)束后,S-59和DNA或RNA的嘧啶堿基形成單加合物(monoadducts)或共價(jià)交聯(lián)產(chǎn)物(covalentcrosslink),殘余的S-59和上述反應(yīng)compoundadsorptiondevice,CAD)而去除28,29。漿,其中的,如HBV、HCV、HIV-1,、CMV以及多種G+G-的細(xì)菌可以被滅活。Van等人用紫外線A(波長(zhǎng)介于320～400nm之間)聯(lián)合S-59照射處理人血小板和血漿,結(jié)果表明,單純使用150mM的S-59或3J/cm2紫外線照射,并不能滅活T.cruzi。然而,使用150mM的S-59聯(lián)合3J/cm2紫外線照射處理血小板和血漿,可使的滴度水平下降5.4log以上[29。S-59介導(dǎo)的光化學(xué)技術(shù)已經(jīng)進(jìn)入臨床期試驗(yàn),該技術(shù)的研究成功將3.3.1.3其它補(bǔ)骨脂素衍生物介導(dǎo)的光化學(xué)其它補(bǔ)骨脂素也有一定的效果但由于各有缺點(diǎn),不能成為有潛力的滅活技術(shù)。如:氨甲基補(bǔ)骨脂素(aminomethy-4,5′-thimethylporalen,AMT它是一種合成的補(bǔ)骨脂素,能增強(qiáng)與核酸的連接親和力,它與核酸的結(jié)合能力比8-MOP10倍,因而能加快滅活的速度,有較強(qiáng)的滅活的能力;但AMT在避光時(shí)表現(xiàn)出誘變性,具有潛在的毒性,現(xiàn)已不再使用還有鹵化補(bǔ)骨脂素,已經(jīng)被證實(shí)不能有效滅活[27,30。3.3.2核黃素介導(dǎo)的光化學(xué)技術(shù)。核黃素,又B2,其分子為多環(huán)共價(jià)結(jié)合的平面結(jié),有一條糖基側(cè)鏈,因而具有水溶性。平面結(jié)構(gòu)是保證核黃素DNA或RNA的堿基的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。核黃素易的細(xì)胞膜與其DNARNA結(jié)合,經(jīng)過(guò)短時(shí)間一定波長(zhǎng)的光照后DNA螺旋或RNA上的鳥(niǎo)嘌呤堿基斷

裂,DNA或RNA受損,從而抑制和細(xì)菌等DNA或RNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯,其繼續(xù),達(dá)到滅活的效果。由于血小板、紅DNA,B2對(duì)它們沒(méi)有破壞作用。維生素B2具有水溶性,容易細(xì)胞膜,因而可以作用于多種無(wú)包膜和細(xì)胞內(nèi)[31,32。1965,就有學(xué)者進(jìn)行維生素B2結(jié)合可見(jiàn)光或紫外線光照滅活TobaccoMosaic實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示該技術(shù)具有可行性[32。在正常情況下,需要從外界攝取維生素B2,從而維持紅細(xì)胞膜的完整性,參與新陳代謝。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,維生素B2介導(dǎo)的光化學(xué)技術(shù)滅活后,維生素B2的降解產(chǎn)物與攝入的維生素B2在正常代謝的產(chǎn)物相同。一份來(lái)自丹麥的回顧性研究表明:1977年到之間,約有55000個(gè)新生兒接受了藍(lán)光照射治療新生兒黃疸,他們發(fā)生的幾率與未接受藍(lán)光治療的兒童相比沒(méi)有顯著性差異,表明核黃素經(jīng)過(guò)光照后代謝產(chǎn)物對(duì)具有全性。因此,核黃素聯(lián)合可見(jiàn)光照射滅活血漿病毒的技術(shù),具有可靠的安全性[32-3。核黃素滅活血漿的研究尚處于早期階段。到目前為止,至今未見(jiàn)有公開(kāi)的相關(guān)論文,僅在互聯(lián)網(wǎng)絡(luò)和一些專(zhuān)業(yè)雜志上有過(guò)零星的相關(guān)。有學(xué)者將維生素B2作為光敏劑,加入猴子體內(nèi)的血小板中,該血小板懸浮30%70的添加液中,用波長(zhǎng)大于350nm的可見(jiàn)光(20Joules/cm2)和紫外線(20Joules/cm2)混合照射后,立即輸注到猴子體內(nèi),發(fā)現(xiàn)血小板中的被滅活。有學(xué)者將新鮮冰凍血漿(FFP)融化后與模型孵育,再,并用紫外線A照射,在照射過(guò)程中不斷搖勻。將溫度控30℃左右。結(jié)果發(fā)現(xiàn),該方法可將血漿中模型滅活,而且對(duì)有包膜和無(wú)包膜都有效[3。由于核黃素來(lái)源方便、價(jià)格低廉,本身及光照后分解代謝產(chǎn)物對(duì)無(wú)毒副作用等優(yōu)點(diǎn),毒的滅活具有其它滅活技術(shù)無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)小結(jié)與展血漿滅活技術(shù)已經(jīng)取得很大的進(jìn)展。S-59介導(dǎo)的光化學(xué)技術(shù)已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)。核黃素介導(dǎo)的光化學(xué)技術(shù),也將為血液的安全性提供更可靠的途徑。[56這些滅活技術(shù)的成功,將為臨床血漿輸注提供更加安全的保障,為血漿輸注開(kāi)創(chuàng)新。TabotE,EpsteinJS.Transfusion,2002;42(91230～AllainJP,ThomasM,SawledaS.TransfusMed,2002;12(4):275～283ShanH,WangJX,RenFR,eta1.Lancet,2002;(9347):1770～WakeDJ,CuttingWA.TropDoct,1998;28(1):4～BusckM,ChamberlandM,EpsteinJ,eta1.VoxSang,1999;77(2):67～76NessP.C1inChem,2000;46(8pt2):1270～AubuchonJP,BirkmeyerJD,BusP.AnnInternMed,1997;127:905～909MoorAC,DubblelamanTM,VansteveninckJ.JHaemato1,1999;62(1):1～RothWK,SeifriedE.TransfusC1inBiol,2001;8(3):282～28410.中國(guó)輸血雜志,2001;14(增):18～SchuttlerGC,CaspariC,JurschCA.Lancet,2000;355:41～42BlumelJ,SehmidtI,EffenbergerW,etaTransfusion,2002;42(11):1473～EdardsCA,PietMP,ChinS.VoxSang,1987;52:KleinHG,DoddyRY,DzikWH.Transfusion,1988;38:102SolheimBG,RollagH,SvennevigHL,eta1.Transfusion,2000;40(1):84～90BeckKH,MorsmansY,Kr erV,eta

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