《測序技術(shù)介紹》教學(xué)培訓(xùn)模板課件

Thistemplateistheinternalstandardcoursewaretemplateoftheenterprise測序技術(shù)介紹Thistemplateistheinternal測序技術(shù)發(fā)展史測序技術(shù)發(fā)展史一代測序1954年，Whitfeld等用化學(xué)降解法測定多聚核糖核苷酸序列，是關(guān)于DNA測序技術(shù)的較早報(bào)道。1977年，Sanger發(fā)明DNA雙脫氧核苷酸末端終止測序法（chainterminatorsequencing），A.M.Maxam和W.Gilbert發(fā)明DNA化學(xué)降解測序法(chemicaldegradationsequencing)，2項(xiàng)技術(shù)的出現(xiàn)，標(biāo)志第1代測序技術(shù)誕生。一代測序1954年，Whitfeld等用化學(xué)降解法測定多Sanger測序法的原理每一次DNA測序反應(yīng)都由4個(gè)獨(dú)立反應(yīng)組成；由于DNA雙鏈中核苷酸以3′，5′-磷酸二酯鍵相連，因此在測序過程中摻入2′，3′-雙脫氧核苷三磷酸———ddNTP（不含3′-OH），當(dāng)ddNTP位于DNA雙鏈的延伸末端時(shí)，無羥基3′端不能與其他脫氧核苷酸形成3′，5′-磷酸二酯鍵，因此，DNA雙鏈合成便終止；若在終止位點(diǎn)摻入ddATP，則新生鏈末端為A，若摻入ddTTP、ddCTP、ddGTP，相應(yīng)地，新生鏈末端則是T、C或G。Sanger測序法的原理每一次DNA測序反應(yīng)都由4個(gè)獨(dú)《測序技術(shù)介紹》教學(xué)培訓(xùn)模板課件《測序技術(shù)介紹》教學(xué)培訓(xùn)模板課件《測序技術(shù)介紹》教學(xué)培訓(xùn)模板課件《測序技術(shù)介紹》教學(xué)培訓(xùn)模板課件該測序技術(shù)的具體做法如下：將模板、引物、4種dNTP（其中含有一種為放射性同位素標(biāo)記的核苷酸）與DNA聚合酶共同保溫，形成的混合物包含許多長短不一的片段，最后利用聚丙烯酰胺變性凝膠電泳（SDS）分離該混合物，得到放射性同位素自顯影條帶圖譜，人們依據(jù)凝膠電泳圖即可讀出DNA雙鏈的堿基序列組成。該測序技術(shù)的具體做法如下：將模板、引物、4種dNTP（其中《測序技術(shù)介紹》教學(xué)培訓(xùn)模板課件《測序技術(shù)介紹》教學(xué)培訓(xùn)模板課件《測序技術(shù)介紹》教學(xué)培訓(xùn)模板課件自動化測序?qū)嶋H上已成為當(dāng)今dna序列分析的主流。美國PEABI公司已生產(chǎn)出373型、377型、310型、3700和3100型等dna測序儀，其中310型是臨床檢測實(shí)驗(yàn)室中使用最多的一種型號。自動化測序?qū)嶋H上已成為當(dāng)今dna序列分析的主流。美國PE測序過程中的常見問題分析在進(jìn)行DNA測序時(shí)，緊接引物的10—30Bases有時(shí)不一定能完全讀清楚。由于DNA結(jié)構(gòu)上的原因，有時(shí)會出現(xiàn)反應(yīng)中途無法進(jìn)行之情況。如：G/Crich;G/CCluster；PolyA、PolyT的連續(xù)結(jié)構(gòu)等。此外，另一種情況為反應(yīng)中途出現(xiàn)的套峰現(xiàn)象，此種情況一般為DNA結(jié)構(gòu)中的重復(fù)序列，造成測序用引物和模板之間有二個(gè)以上的結(jié)合位點(diǎn)。具體問題分析如下：1：測序結(jié)果有很多套峰，出現(xiàn)很多N值原因分析：PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行測序，在PCR產(chǎn)物長度以后將無反應(yīng)信號，機(jī)器將產(chǎn)生許多N值。

在序列的起始端出現(xiàn)N值，主要是由于有未去除的染料單體造成的干擾峰，是機(jī)器無法正確判讀出位何值。有時(shí)，引物二聚體或者起始端小片段的丟失，也會出現(xiàn)N值。模版本身含雜合序列，有等位基因。測序過程中的常見問題分析在進(jìn)行DNA測序時(shí)，緊接引物的10測序過程中的常見問題分析2：為什么找不到我的PCR引物序列？用PCR引物作為測序引物，所測序列是從引物3末端后第一個(gè)堿基開始的，所以就找不到您的測序引物了?？梢赃M(jìn)行反向測序，得到引物的反向互補(bǔ)序列。還可以將所測片段克隆到適當(dāng)載體中，由于通用引物與插入序列有一段距離，就可以測出您的引物序列。3：測序結(jié)果和文獻(xiàn)資料不一樣，為什么?原因有很多，如同一種動物，在不同的種族之間，或者不同的個(gè)體之間，基因序列也不一定完全一樣。如果是PCR產(chǎn)物克隆測序,那還有PCR過程中的錯(cuò)配因素等等。我們提供的測序結(jié)果是客戶樣品序列的忠實(shí)結(jié)果，不能保證和文獻(xiàn)序列完全一致。4：過短的PCR產(chǎn)物為什么不適于直接測序？首先由于一般的PCR產(chǎn)物純化試劑盒要求產(chǎn)物片段大于200bp,過短的PCR產(chǎn)物不能進(jìn)行純化；再者，測序的前50bp和后50bp的序列是不好的，所以不適于直接測序。測序過程中的常見問題分析2：為什么找不到我的PCR引物序列？測序過程中的常見問題分析5：酒精如果沒有揮發(fā)完全,在約300bp處會出現(xiàn)連續(xù)異常的G峰，酒精揮發(fā)時(shí)間過長會導(dǎo)致DNA斷裂。第一個(gè)峰，重疊干擾。如果不判讀為干擾峰，那就說明樣品不純，如果是基因組DNA，就很好地說明了樣品為雜合子，該位點(diǎn)可能存在SNP現(xiàn)象（T/G）。如果判讀為干擾峰，我們只需認(rèn)定樣品此處堿基為T為行了。第二個(gè)峰，錯(cuò)位干擾。如果不判讀為干擾峰，則說明樣本可能比預(yù)期多一個(gè)堿基（G），如果判讀為干擾峰，我們?nèi)灾恍枵J(rèn)定樣品此處堿基為T為行了。測序過程中的常見問題分析5：酒精如果沒有揮發(fā)完全,在約300測序過程中的常見問題分析6：為什么用PCR產(chǎn)物或質(zhì)粒測序時(shí)，經(jīng)常會出現(xiàn)套峰現(xiàn)象?下圖是pGEM-T載體測序的結(jié)果，在83位點(diǎn)處測序結(jié)果出現(xiàn)雙峰，即模板中含有兩個(gè)或兩個(gè)以上的相同載體，但是插入片段不同。解決辦法：重新挑取單克隆或者重新提取質(zhì)粒。需要注意的是，重新進(jìn)行PCR反應(yīng)或者酶切鑒定僅能證明該克隆含有插入片段，并不足以證明模板的單一。測序過程中的常見問題分析6：為什么用PCR產(chǎn)物或質(zhì)粒測序時(shí)，測序過程中的常見問題分析7：poly結(jié)構(gòu)的測序結(jié)果以polyT為例，在polyA/T結(jié)構(gòu)之后往往出現(xiàn)移碼現(xiàn)象，而在polyG/C之后會往往導(dǎo)致測序信號的衰減。解決辦法：使用反向引物對模板進(jìn)行測序，測到該poly結(jié)構(gòu)處，即可完成模板全長的拼接。測序過程中的常見問題分析7：poly結(jié)構(gòu)的測序結(jié)果第二代測序技術(shù)（Next-GenerationSequencing）第二代測序技術(shù)（Next-GenerationSequen各自的優(yōu)點(diǎn)454測序平臺得到的片段能夠達(dá)到400bp，并且讀長的質(zhì)量高；Solexa測序平臺的性價(jià)比最高，在數(shù)據(jù)量相同的情況下，測序成本僅為454測序平臺的1/10；SOLiD測序平臺準(zhǔn)確度能夠達(dá)到99.94%，在片段覆蓋率為15×?xí)r，測序準(zhǔn)確度可接近100%。各自的優(yōu)點(diǎn)454測序平臺得到的片段能夠達(dá)到400bp，并2005年底，454公司推出第一個(gè)基于焦磷酸測序原理的高通量基因組測序系統(tǒng)——GenomeSequencer20System，這是核酸測序技術(shù)發(fā)展史上里程碑式的事件。隨后，羅氏公司以1.55億美元收購了454公司，并在2006年推出了更新的GSFLX測序系統(tǒng)，該系統(tǒng)可在10小時(shí)的運(yùn)行中獲得100萬條讀長（reads），4~6億個(gè)堿基信息（basepair），且準(zhǔn)確率達(dá)到99%以上。2008年，GSFLX系統(tǒng)再次升級，通量提高了5倍，讀長和準(zhǔn)確率也有所增加。雖然454GS測序平臺也許不是市場占有率最高的測序儀，但截至2011年3月，利用該系統(tǒng)進(jìn)行研究的論文已發(fā)表超過1000余篇，而它在讀長上的優(yōu)勢明顯勝于另兩套系統(tǒng)，因此在從頭測序（denovo）和宏基因組測序（metagenome）方面有著不可替代的地位。2005年底，454公司推出第一個(gè)基于焦磷酸測2006年，Solexa公司也推出了自己的NGS系統(tǒng)——GenomeAnalyzer，簡稱GA。這套基于DNA簇（DNAcluster）、橋式PCR（BridgePCR）和可逆阻斷（Reversibleterminator）等核心技術(shù)的系統(tǒng)具有高通量、低錯(cuò)誤率、低成本、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。2007年，Illumina公司以6億美元的高價(jià)收購了Solexa，使GA得以商品化。GA最早期的版本一次運(yùn)行可獲得1Gb的數(shù)據(jù)，因此也有1GbAnalyzer的含義，而最新的Hiseq2000平臺則能夠在10天的運(yùn)行中獲得300Gb以上的數(shù)據(jù)，讀取的堿基長度達(dá)到150bp左右。更有消息稱，Illumina已完成了600Gb的運(yùn)行測試并在部分客戶中開展了前期體驗(yàn)，Tb（1000Gb）級的測試Run也將于年內(nèi)進(jìn)行。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，Illumina公司已售出超過600臺/套GAIIx和Hiseq2000平臺，2010年僅深圳華大基因研究院一家就購買了128臺Hiseq2000，一舉成為全球最大的基因組測序與分析中心，Illumina公司在測序領(lǐng)域的影響力由此可見一斑。2006年，Solexa公司也推出了自己的NG在Sanger測序時(shí)代，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（ABI）一直是該行業(yè)的龍頭老大，其壟斷地位無人能撼，從早期的377到全自動化的3730xl，ABI的測序儀被廣泛應(yīng)用在基因組學(xué)研究的各個(gè)方面。然而在第二代測序技術(shù)迅猛發(fā)展之初，ABI起步較晚，顯得有些漫不經(jīng)心。直到2005年454公司推出GS平臺，ABI的領(lǐng)先地位受到威脅，這才開始發(fā)力，迅速收購了研發(fā)NGS的一家小公司Agencourt，并于2007年推出了它的SOLiD測序平臺。此后SOLiD不斷升級，目前已到SOLiD5版本（SOLiD5500xl）。SOLiD的全稱是SequencingbyOligoLigationDetection，即寡聚物連接檢測測序，其基本原理是通過熒光標(biāo)記的8堿基單鏈DNA探針與模板配對連接，發(fā)出不同的熒光信號，從而讀取目標(biāo)序列的堿基排列順序。在該方法下，目標(biāo)序列的所有堿基都被讀取了兩遍，因此SOLiD最大的優(yōu)勢就是它的高準(zhǔn)確率。據(jù)悉，SOLiD5平臺的測序通量已達(dá)到30Gb/天，成本低于60美元/Gb，準(zhǔn)確率高達(dá)99.99%。并且由于SOLiD系統(tǒng)采用的不是PCR反應(yīng)進(jìn)行DNA合成與測序，因此對于高GC含量的樣本，SOLiD系統(tǒng)具有非常大的優(yōu)勢。在Sanger測序時(shí)代，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（454測序原理焦磷酸測序法（Pyrosequencing)的原理454測序原理焦磷酸測序法（Pyrosequencing)的454測序原理焦磷酸測序法（Pyrosequencing)的原理454測序原理焦磷酸測序法（Pyrosequencing)的454測序原理焦磷酸測序法（Pyrosequencing)的原理454測序原理焦磷酸測序法（Pyrosequencing)的454測序原理在454測序儀中，A、T、G、C四種堿基是分別存儲在單獨(dú)的試劑瓶中的，每步反應(yīng)四種堿基依次加入反應(yīng)池，當(dāng)堿基配對結(jié)合，就會釋放出一個(gè)焦磷酸（PPi），而這個(gè)焦磷酸在酶的作用下，將熒光素氧化成氧化熒光素，并發(fā)出光信號，從而讀取出這一位置的堿基信息。454測序儀的整個(gè)實(shí)驗(yàn)步驟可大致概括為：樣品處理文庫制備emPCR反應(yīng)板準(zhǔn)備上機(jī)測序454測序原理在454測序儀中，A、T、G、C四種堿基是分別454測序原理樣品處理：樣品處理主要是針對大片段的DNA分子，如基因組DNA、Fosmid或BAC質(zhì)粒等，利用超聲或氮?dú)獯驍鄬⑦@些DNA分子片段化，然后采用瓊脂糖凝膠電泳回收或磁珠純化，選擇500-800bp的DNA片段。對于非編碼RNA或PCR產(chǎn)物，則不需要這一步驟。454測序原理樣品處理：454測序原理文庫制備包括接頭連接和磁珠純化兩步，454的文庫接頭分A、B兩種，各44bp，由20bp的PCR引物、20bp的測序引物及4bp（TCAG）的“key”堿基構(gòu)成，其中B接頭的5’端帶有生物素（Biotin）標(biāo)記，用于磁珠純化步驟。經(jīng)過磁珠結(jié)合與DNA變性之后，只有A+目的片段+B形式的連接產(chǎn)物得以富集，另兩種形式（AA、BB）的產(chǎn)物都被去除。454測序原理文庫制備包括接頭連接和磁珠純化兩步，454的文454測序原理emPCR（乳液PCR)是454測序的一個(gè)關(guān)鍵步驟，將富集到的文庫與測序磁珠、各反應(yīng)物混合，加入特定的礦物油和表面活性劑，再利用振蕩器劇烈振蕩，使反應(yīng)體系形成油包水（water-in-oil）的穩(wěn)定乳濁液。在理想條件下，每一個(gè)液滴，或稱微反應(yīng)器（microreactor）中將只包含一個(gè)磁珠和一條單鏈DNA，通過控制該步驟的條件，1mL乳液中可以形成至少10的6次方個(gè)理想的微反應(yīng)器。經(jīng)過PCR擴(kuò)增后，每一個(gè)磁珠上將形成密集的DNA簇，這些DNA序列完全相同，即可用于后續(xù)的步驟。隨后，乳液混合物被打破，擴(kuò)增的片段依然結(jié)合在磁珠上。454測序原理emPCR（乳液PCR)是454測序的一個(gè)關(guān)鍵454測序原理454測序的反應(yīng)板稱為PTP（PicoTiterPlate），含有350萬個(gè)由光纖組成的小孔，每個(gè)孔的直徑為29μm，而測序磁珠的直徑為20μm，因此每個(gè)孔中僅能容納一個(gè)磁珠。將磁珠與測序試劑加入PTP中，使之可用于上機(jī)測序。454測序原理454測序的反應(yīng)板稱為PTP（PicoTit454測序原理測序步驟如前所述，四種堿基在泵的控制下依次加入反應(yīng)板，反應(yīng)完成后再洗去，每延伸一個(gè)或若干個(gè)堿基，就會發(fā)出一次光信號，通過記錄信號的有無和強(qiáng)度，即可測定DNA序列。454測序原理測序步驟如前所述，四種堿基在泵的控制下依次加入《測序技術(shù)介紹》教學(xué)培訓(xùn)模板課件454測序原理優(yōu)缺點(diǎn)：454測序準(zhǔn)確度較高，當(dāng)讀長超過400bp時(shí)，其準(zhǔn)確性仍能達(dá)到99%以上；主要的錯(cuò)誤來自于同聚物，即相同堿基的連續(xù)延伸，如ATTTG這樣一段序列，A和G的讀取沒有問題，但T只記錄了一次光信號，僅信號強(qiáng)度與ATG序列的T有所不同，因此同聚物越長，可能產(chǎn)生的誤差就越大。目前，由于454測序儀在讀長上的明顯優(yōu)勢，它在大基因組從頭測序（denovo）、轉(zhuǎn)錄組分析、基因組結(jié)構(gòu)分析等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。454測序原理優(yōu)缺點(diǎn)：Solexa測序Solexa測序Solexa測序常用術(shù)語：SBS：邊合成邊測序反應(yīng)，每次SBS會延伸一個(gè)堿基，大約耗時(shí)70分鐘。Run：單次上機(jī)測序反應(yīng)，可以產(chǎn)生4G-75G測序通量不等。Lane：單泳道，每條泳道可以直接物理區(qū)分測序樣品，1次run最多可以同時(shí)上樣8條Lane。Channel：Lane的同義詞。Tile：小區(qū)，每條Lane中排有2列tile，合計(jì)120個(gè)小區(qū)。每個(gè)小區(qū)上分布數(shù)目繁多的簇結(jié)合位點(diǎn)。Cluster：簇，在Solexa測序技術(shù)中會采用橋式PCR方式生產(chǎn)DNA簇，每個(gè)DNA簇才能產(chǎn)生亮度達(dá)到CCD可以分辨的熒光點(diǎn)。Solexa測序常用術(shù)語：Solexa測序Index：標(biāo)簽，在Solexa多重測序（MultiplexedSequencing）過程中會使用Index來區(qū)分樣品，并在常規(guī)測序完成后，針對Index部分額外進(jìn)行7個(gè)循環(huán)的測序，通過Index的識別，可以在1條Lane中區(qū)分12種不同的樣品。Barcode:

Index同義詞Fasta：一種序列存儲格式。一個(gè)序列文件若以FASTA格式存儲，則每一條序列的第一行以“>”開頭，而跟隨“>”的是序列的ID號（即唯一的標(biāo)識符）及對該序列的描述信息；第二行開始是序列內(nèi)容，序列短于61nt的，則一行排列完；序列長于61nt的，則每行存儲61nt，最后剩下小于61nt的，在最后一行排列完；第二條序列另起一行，仍然由“>”和序列的ID號開始，以此類推。Solexa測序Index：標(biāo)簽，在Solexa多重測序（MSolexa測序Fastq：Fastq是Solexa測序技術(shù)中一種反映測序序列的堿基質(zhì)量的文件格式。第一行以“@”符號開頭，后面緊跟一個(gè)序列的描述信息；第二行是該序列的內(nèi)容；第三行以“+”符號開頭，后面緊跟的內(nèi)容與第一行一樣，同樣是該序列的描述信息；而第四行是第二行中的序列內(nèi)容每個(gè)堿基所對應(yīng)的測序質(zhì)量值。PF%：PF%是指符合測序質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的簇的百分比（MultiplexedSequencing），與測序的通量相關(guān)聯(lián)。Read：Solexa是成簇反應(yīng)的，每個(gè)簇對應(yīng)一條DNA序列片段，成為一個(gè)read。Solexa測序Fastq：Fastq是Solexa測序技術(shù)Solexa測序Solexa測序Solexa測序Solexa測序Solexa測序Solexa測序Solexa測序Solexa測序Solexa測序Solexa測序Solexa測序Solexa測序Solexa測序Solexa測序Solexa測序Solexa測序Solexa測序應(yīng)用：

Solexa平臺的應(yīng)用范圍極廣，幾乎囊括了目前基因組學(xué)研究的所有方面，例如基因組從頭測序（denovo）、重測序（re-sequencing）、基因組結(jié)構(gòu)分析、轉(zhuǎn)錄組測序、表達(dá)譜分析、小RNA及非編碼RNA測序、表觀遺傳學(xué)研究等等。Solexa測序應(yīng)用：SOLiD測序SOLiD測序SOLiD測序SOLiD測序SOLiD測序SOLiD測序SOLiD測序SOLiD測序SOLiD測序SOLiD測序SOLiD測序SOLiD測序SOLiD測序SOLiD測序SOLiD測序SOLiD測序SOLiD測序SOLiD測序SOLiD測序SOLiD測序SOLiD測序SOLiD測序SOLiD測序SOLiD測序SOLiD測序SOLiD測序SOLiD測序SOLiD測序SOLiD測序SOLiD測序SOLiD測序SOLiD測序三者比較Ｒｏｃｈｅ／４５４測序技術(shù)讀取長度（６００～１０００ｂｐ），在３種測序技術(shù)中最長，可以對未知基因組進(jìn)行從頭測序，但其通量最低（０．５～１Ｇｂ／ｒｕｎ）。當(dāng)遇到ｐｏｌｙｍｅｒ（如ＡＡＡＡＡＡ等）時(shí)，堿基個(gè)數(shù)和熒光信號強(qiáng)度不成線性關(guān)系，即判斷重復(fù)堿基有困難。三者比較Ｒｏｃｈｅ／４５４測序技術(shù)讀取長度（６００～１００三者比較Ｉｌｌｕｍｉｎａ／Ｓｏｌｅｘａ屬于高度自動化的系統(tǒng)，讀取片段比其它種類的測序多，適合進(jìn)行大量小片段的測序（如ｍｉｃｒｏＲＮＡｐｒｏｆｉｌｉｎｇ），其測序通量大，其新機(jī)型Ｈｉｓｅｑ２０００產(chǎn)出量為６００Ｇｂ／ｒｕｎ，但基于可逆反應(yīng)時(shí)隨反應(yīng)輪數(shù)增加效率降低、信號減弱，并且讀長（通常為１００ｂｐ）比Ｒｏｃｈｅ／４５４短，給從頭測序拼接帶來困難。三者比較Ｉｌｌｕｍｉｎａ／Ｓｏｌｅｘａ屬于高度自動化的系統(tǒng)，三者比較ＡＢＩ／ＳＯＬｉＤ技術(shù)每個(gè)堿基讀取２次，有非常高的準(zhǔn)確性，特別是針對ＳＮＰ的檢測。此外，靈活的系統(tǒng)和完善的磁珠編碼系統(tǒng)可以進(jìn)行樣品的ｐｏｏｌｉｎｇ來分割測序區(qū)域，特別適用于具有高質(zhì)量參考基因組序列物種的重測序，但是該測序讀長（５０ｂｐ）最短，并且讀取長度受反應(yīng)輪數(shù)的限制，給從頭測序拼接帶來困難。三者比較ＡＢＩ／ＳＯＬｉＤ技術(shù)每個(gè)堿基讀?。泊?，有非常高的準(zhǔn)第三代測序技術(shù)原理：脫氧核苷酸用熒光標(biāo)記，顯微鏡可以實(shí)時(shí)記錄熒光的強(qiáng)度變化。當(dāng)熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸被摻入DNA鏈的時(shí)候，它的熒光就同時(shí)能在DNA鏈上探測到。當(dāng)它與DNA鏈形成化學(xué)鍵的時(shí)候，它的熒光基團(tuán)就被DNA聚合酶切除，熒光消失。這種熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸不會影響DNA聚合酶的活性，并且在熒光被切除之后，合成的DNA鏈和天然的DNA鏈完全一樣。第三代測序技術(shù)原理：第三代測序技術(shù)技術(shù)關(guān)鍵：第一：因?yàn)樵陲@微鏡實(shí)時(shí)記錄DNA鏈上的熒光的時(shí)候，DNA鏈周圍的眾多的熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸形成了非常強(qiáng)大的熒光背景。這種強(qiáng)大的熒光背景使單分子的熒光探測成為不可能。PacificBiosciences公司發(fā)明了一種直徑只有幾十納米的納米孔[zero-modewaveguides(ZMWs)]，單分子的DNA聚合酶被固定在這個(gè)孔內(nèi)。在這么小的孔內(nèi)，DNA鏈周圍的熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸有限，而且由于A，T，C，G這四種熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸非?？焖俚貜耐饷孢M(jìn)入到孔內(nèi)又出去，它們形成了非常穩(wěn)定的背景熒光信號。而當(dāng)某一種熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸被摻入到DNA鏈時(shí)，這種特定顏色的熒光會持續(xù)一小段時(shí)間，直到新的化學(xué)鍵形成，熒光基團(tuán)被DNA聚合酶切除為止。第二：共聚焦顯微鏡實(shí)時(shí)地快速地對集成在板上的無數(shù)的納米小孔同時(shí)進(jìn)行記錄。第三代測序技術(shù)技術(shù)關(guān)鍵：第三代測序技術(shù)技術(shù)特點(diǎn)：1、它實(shí)現(xiàn)了DNA聚合酶內(nèi)在自身的反應(yīng)速度，一秒可以測10個(gè)堿基，測序速度是化學(xué)法測序的2萬倍。2、它實(shí)現(xiàn)了DNA聚合酶內(nèi)在自身的延續(xù)性，一個(gè)反應(yīng)就可以測非常長的序列。二代測序現(xiàn)在可以測到上百個(gè)堿基，但是三代測序現(xiàn)在就可以測幾千個(gè)堿基。3、它的精度非常高，達(dá)到99.9999%。4、直接測RNA的序列。既然DNA聚合酶能夠?qū)崟r(shí)觀測，那么以RNA為模板復(fù)制DNA的逆轉(zhuǎn)錄酶也同樣可以。RNA的直接測序，將大大降低體外逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的系統(tǒng)誤差。5、第二個(gè)是直接測甲基化的DNA序列。實(shí)際上DNA聚合酶復(fù)制A、T、C、G的速度是不一樣的。正常的C或者甲基化的C為模板，DNA聚合酶停頓的時(shí)間不同。根據(jù)這個(gè)不同的時(shí)間，可以判斷模板的C是否甲基化。第三代測序技術(shù)技術(shù)特點(diǎn)：第三代測序技術(shù)第三代測序技術(shù)Thistemplateistheinternalstandardcoursewaretemplateoftheenterprise課程結(jié)束ThistemplateistheinternalSWOT分析模板SWOT分析模板72SWOT分析是市場營銷管理中經(jīng)常使用的功能強(qiáng)大的分析工具，最早是由美國舊金山大學(xué)的管理學(xué)教授在80年代初提出來的：S代表strength(優(yōu)勢)，W代表weakness(弱勢)，O代表opportunity(機(jī)會)，T代表threat(威脅)。市場分析人員經(jīng)常使用這一工具來掃描、分析整個(gè)行業(yè)和市場，獲取相關(guān)的市場資訊，為高層提供決策依據(jù)，其中，S、W是內(nèi)部因素，O、T是外部因素。它在制定公司發(fā)展戰(zhàn)略和進(jìn)行競爭對手分析中也經(jīng)常被使用。SWOT的分析技巧類似于波士頓咨詢（BCG）公司的增長/份額矩陣（TheGrowth/ShareMatrix），什么是SWOT分析SWOT分析是市場營銷管理中經(jīng)常使用的功能強(qiáng)大的分析工具，最73內(nèi)部環(huán)境優(yōu)勢Strengths劣勢Weakness機(jī)會Opportunities威脅ThreatsSWOT分析傳統(tǒng)矩陣示意圖外部環(huán)境內(nèi)部環(huán)境優(yōu)勢劣勢機(jī)會威脅SWOT分析傳統(tǒng)矩陣示意圖外部環(huán)境74SWOT行業(yè)分析適用范圍業(yè)務(wù)單元及產(chǎn)品線分析競爭對手分析SWOT企業(yè)自身SBUSWOT分析SWOTSWOT企業(yè)自身SBUSWOT分析主要競爭對手SBUSWOT分析企業(yè)的內(nèi)外部環(huán)境與行業(yè)平均水平進(jìn)行比較當(dāng)選擇行業(yè)領(lǐng)域中只有少數(shù)競爭對手時(shí)，可以考慮做SWOT組圖進(jìn)行比較SWOT行業(yè)分析適用范圍業(yè)務(wù)單元及產(chǎn)品線分析競爭對手分析SW75SWOT分析步驟分析環(huán)境因素構(gòu)造SWOT矩陣制定行動計(jì)劃運(yùn)用各種調(diào)查研究方法，分析出公司所處的各種環(huán)境因素，即外部環(huán)境因素和內(nèi)部能力因素。

將調(diào)查得出的各種因素根據(jù)輕重緩急或影響程度等排序方式，構(gòu)造SWOT矩陣。

在完成環(huán)境因素分析和SWOT矩陣的構(gòu)造后，便可以制定出相應(yīng)的行動計(jì)劃。

SWOT分析步驟分析環(huán)境因素構(gòu)造SWOT矩陣制定行動計(jì)劃運(yùn)用76SW優(yōu)勢與劣勢分析（內(nèi)部環(huán)境分析）提高公司盈利性產(chǎn)品線的寬度產(chǎn)品的質(zhì)量產(chǎn)品價(jià)格產(chǎn)品的可靠性產(chǎn)品的適用性服務(wù)的及時(shí)性服務(wù)態(tài)度……競爭優(yōu)勢可以指消費(fèi)者眼中一個(gè)企業(yè)或它的產(chǎn)品有別于其競爭對手的任何優(yōu)越的東西。需要注意的是一定要從消費(fèi)者的角度出發(fā)，尋找與競爭者或行業(yè)平均水平比較，公司的產(chǎn)品與服務(wù)有什么優(yōu)勢/劣勢；而不是從公司的角度出發(fā)，衡量企業(yè)的競爭優(yōu)勢。SW優(yōu)勢與劣勢分析（內(nèi)部環(huán)境分析）提高公司盈利性產(chǎn)品線的寬度77通過一定努力，建立自身競爭優(yōu)勢引起競爭者注意，開始作出反應(yīng)直接進(jìn)攻企業(yè)優(yōu)勢所在，或采取更為有力的策略競爭優(yōu)勢受到削弱，尋找新的策略增強(qiáng)自身競爭優(yōu)勢根據(jù)SW分析，公司建立并維持自身的競爭優(yōu)勢企業(yè)在維持競爭優(yōu)勢過程中，必須深刻認(rèn)識自身的資源和能力，采取適當(dāng)?shù)拇胧?。因?yàn)橐粋€(gè)企業(yè)一旦在某一方面具有了競爭優(yōu)勢，勢必會吸引到競爭對手的注意。而影響企業(yè)競爭優(yōu)勢的持續(xù)時(shí)間，主要的是三個(gè)關(guān)鍵因素：（1）建立這種優(yōu)勢要多長時(shí)間?（2）能夠獲得的優(yōu)勢有多大？（3）競爭對手作出有力反應(yīng)需要多長時(shí)間？如果企業(yè)分析清楚了這三個(gè)因素，就會明確自己在建立和維持競爭優(yōu)勢中的地位了。通過一定努力，建立自身競爭優(yōu)勢引起競爭者注意，開始作出反應(yīng)直78OT機(jī)會與威脅分析（外部環(huán)境分析）環(huán)境發(fā)展趨勢分為兩大類：環(huán)境威脅環(huán)境機(jī)會環(huán)境威脅指的是環(huán)境中一種不利的發(fā)展趨勢所形成的挑戰(zhàn)，如果不采取果斷的戰(zhàn)略行為，這種不利趨勢將導(dǎo)致公司的競爭地位受到削弱。環(huán)境機(jī)會就是對公司行為富有吸引力的領(lǐng)域，在這一領(lǐng)域中，該公司將擁有競爭優(yōu)勢。OT機(jī)會與威脅分析（外部環(huán)境分析）環(huán)境發(fā)展趨勢分為兩大類：環(huán)79OT機(jī)會與威脅分析方法一：PEST法PEST法政治／法律:經(jīng)濟(jì)社會文化技術(shù)壟斷法律環(huán)境保護(hù)法稅法對外貿(mào)易規(guī)定勞動法政府穩(wěn)定性經(jīng)濟(jì)周期GNP趨勢利率貨幣供給通貨膨脹失業(yè)率可支配收入能源供給成本人口統(tǒng)比收入分配社會穩(wěn)定生活方式的變化教育水平消費(fèi)政府對研究的投入政府和行業(yè)對技術(shù)的重視新技術(shù)的發(fā)明和進(jìn)展技術(shù)傳播的速度折舊和報(bào)廢速度OT機(jī)會與威脅分析方法一：PEST法PEST法政治／法律:經(jīng)80OT機(jī)會與威脅分析方法一：波特五力模型競爭者供應(yīng)商客戶替代者新進(jìn)入者進(jìn)入本行業(yè)有哪些壁壘？它們阻礙新進(jìn)入者的作用有多大？本企業(yè)怎樣確定自己的地位（自己進(jìn)入或者阻止對手進(jìn)入）？購買者轉(zhuǎn)而購買替代品的轉(zhuǎn)移成本；公司可以采取什么措施來降低成本或增加附加值來降低消費(fèi)者購買替代品的風(fēng)險(xiǎn)？供貨商的品牌或價(jià)格特色；供貨商的戰(zhàn)略中本企業(yè)的地位；供貨商之間的關(guān)系；從供貨商之間轉(zhuǎn)移的成本本企業(yè)的部件或原材料產(chǎn)品占買方成本的比例；各買方之間是否有聯(lián)合的危險(xiǎn)；本企業(yè)與買方是否具有戰(zhàn)略合作關(guān)系行業(yè)內(nèi)競爭者的均衡程度、增長速度、固定成本比例、本行業(yè)產(chǎn)品或服務(wù)的差異化程度、退出壁壘等，決定了一個(gè)行業(yè)內(nèi)的競爭激烈程度OT機(jī)會與威脅分析方法一：波特五力模型競爭者供應(yīng)商客戶替代者81構(gòu)造SWOT矩陣在構(gòu)造SWOT過程中，將那些對公司發(fā)展有直接的、重要的、大量的、迫切的、久遠(yuǎn)的影響因素優(yōu)先排列出來，而將那些間接的、次要的、少許的、不急的、短暫的影響因素排列在后面。

案例：1997年香港郵政對特快專遞業(yè)務(wù)單元做的SWOT分析SWT特快專遞服務(wù)推出較早技術(shù)支持較強(qiáng)（如電子追蹤服務(wù)以郵局為服務(wù)終端，服務(wù)網(wǎng)絡(luò)覆蓋面廣O特快專遞”過去的形象不太好認(rèn)知率不高可靠性與速度不及私營公司私營速遞公司多以大公司為主要客戶中小機(jī)構(gòu)、個(gè)人的需求得不到滿足，是個(gè)被忽視的市場香港近年經(jīng)濟(jì)不太景氣，外部環(huán)境不利速遞業(yè)競爭對手林立，正面沖突可能招致報(bào)復(fù)構(gòu)造SWOT矩陣在構(gòu)造SWOT過程中，將那些對公司發(fā)展有直接82制訂行動計(jì)劃制定計(jì)劃的基本思路是：發(fā)揮優(yōu)勢因素，克服弱點(diǎn)因素，利用機(jī)會因素，化解威脅因素；考慮過去，立足當(dāng)前，著眼未來。運(yùn)用系統(tǒng)分析的綜合分析方法，將排列與考慮的各種環(huán)境因素相互匹配起來加以組合，得出一系列公司未來發(fā)展的可選擇對策。SWOTWT對策

最小與最小對策，即考慮弱點(diǎn)因素和威脅因素，目的是努力使這些因素都趨于最小。

悲觀

WO對策

最小與最大對策，即著重考慮弱點(diǎn)因素和機(jī)會因素，目的是努力使弱點(diǎn)趨于最小，使機(jī)會趨于最大

苦樂參半

ST對策

最小與最大對策，即著重考慮優(yōu)勢因素和威脅因素，目的是努力使優(yōu)勢因素趨于最大，是威脅因素趨于最小。

苦樂參半

SO對策

最大與最大對策，即著重考慮優(yōu)勢因素和機(jī)會因素，目的在于努力使這兩種因素都趨于最大。

理想

小大大小制訂行動計(jì)劃制定計(jì)劃的基本思路是：發(fā)揮優(yōu)勢因素，克服弱點(diǎn)因素83Thistemplateistheinternalstandardcoursewaretemplateoftheenterprise測序技術(shù)介紹Thistemplateistheinternal測序技術(shù)發(fā)展史測序技術(shù)發(fā)展史一代測序1954年，Whitfeld等用化學(xué)降解法測定多聚核糖核苷酸序列，是關(guān)于DNA測序技術(shù)的較早報(bào)道。1977年，Sanger發(fā)明DNA雙脫氧核苷酸末端終止測序法（chainterminatorsequencing），A.M.Maxam和W.Gilbert發(fā)明DNA化學(xué)降解測序法(chemicaldegradationsequencing)，2項(xiàng)技術(shù)的出現(xiàn)，標(biāo)志第1代測序技術(shù)誕生。一代測序1954年，Whitfeld等用化學(xué)降解法測定多Sanger測序法的原理每一次DNA測序反應(yīng)都由4個(gè)獨(dú)立反應(yīng)組成；由于DNA雙鏈中核苷酸以3′，5′-磷酸二酯鍵相連，因此在測序過程中摻入2′，3′-雙脫氧核苷三磷酸———ddNTP（不含3′-OH），當(dāng)ddNTP位于DNA雙鏈的延伸末端時(shí)，無羥基3′端不能與其他脫氧核苷酸形成3′，5′-磷酸二酯鍵，因此，DNA雙鏈合成便終止；若在終止位點(diǎn)摻入ddATP，則新生鏈末端為A，若摻入ddTTP、ddCTP、ddGTP，相應(yīng)地，新生鏈末端則是T、C或G。Sanger測序法的原理每一次DNA測序反應(yīng)都由4個(gè)獨(dú)《測序技術(shù)介紹》教學(xué)培訓(xùn)模板課件《測序技術(shù)介紹》教學(xué)培訓(xùn)模板課件《測序技術(shù)介紹》教學(xué)培訓(xùn)模板課件《測序技術(shù)介紹》教學(xué)培訓(xùn)模板課件該測序技術(shù)的具體做法如下：將模板、引物、4種dNTP（其中含有一種為放射性同位素標(biāo)記的核苷酸）與DNA聚合酶共同保溫，形成的混合物包含許多長短不一的片段，最后利用聚丙烯酰胺變性凝膠電泳（SDS）分離該混合物，得到放射性同位素自顯影條帶圖譜，人們依據(jù)凝膠電泳圖即可讀出DNA雙鏈的堿基序列組成。該測序技術(shù)的具體做法如下：將模板、引物、4種dNTP（其中《測序技術(shù)介紹》教學(xué)培訓(xùn)模板課件《測序技術(shù)介紹》教學(xué)培訓(xùn)模板課件《測序技術(shù)介紹》教學(xué)培訓(xùn)模板課件自動化測序?qū)嶋H上已成為當(dāng)今dna序列分析的主流。美國PEABI公司已生產(chǎn)出373型、377型、310型、3700和3100型等dna測序儀，其中310型是臨床檢測實(shí)驗(yàn)室中使用最多的一種型號。自動化測序?qū)嶋H上已成為當(dāng)今dna序列分析的主流。美國PE測序過程中的常見問題分析在進(jìn)行DNA測序時(shí)，緊接引物的10—30Bases有時(shí)不一定能完全讀清楚。由于DNA結(jié)構(gòu)上的原因，有時(shí)會出現(xiàn)反應(yīng)中途無法進(jìn)行之情況。如：G/Crich;G/CCluster；PolyA、PolyT的連續(xù)結(jié)構(gòu)等。此外，另一種情況為反應(yīng)中途出現(xiàn)的套峰現(xiàn)象，此種情況一般為DNA結(jié)構(gòu)中的重復(fù)序列，造成測序用引物和模板之間有二個(gè)以上的結(jié)合位點(diǎn)。具體問題分析如下：1：測序結(jié)果有很多套峰，出現(xiàn)很多N值原因分析：PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行測序，在PCR產(chǎn)物長度以后將無反應(yīng)信號，機(jī)器將產(chǎn)生許多N值。

在序列的起始端出現(xiàn)N值，主要是由于有未去除的染料單體造成的干擾峰，是機(jī)器無法正確判讀出位何值。有時(shí)，引物二聚體或者起始端小片段的丟失，也會出現(xiàn)N值。模版本身含雜合序列，有等位基因。測序過程中的常見問題分析在進(jìn)行DNA測序時(shí)，緊接引物的10測序過程中的常見問題分析2：為什么找不到我的PCR引物序列？用PCR引物作為測序引物，所測序列是從引物3末端后第一個(gè)堿基開始的，所以就找不到您的測序引物了。可以進(jìn)行反向測序，得到引物的反向互補(bǔ)序列。還可以將所測片段克隆到適當(dāng)載體中，由于通用引物與插入序列有一段距離，就可以測出您的引物序列。3：測序結(jié)果和文獻(xiàn)資料不一樣，為什么?原因有很多，如同一種動物，在不同的種族之間，或者不同的個(gè)體之間，基因序列也不一定完全一樣。如果是PCR產(chǎn)物克隆測序,那還有PCR過程中的錯(cuò)配因素等等。我們提供的測序結(jié)果是客戶樣品序列的忠實(shí)結(jié)果，不能保證和文獻(xiàn)序列完全一致。4：過短的PCR產(chǎn)物為什么不適于直接測序？首先由于一般的PCR產(chǎn)物純化試劑盒要求產(chǎn)物片段大于200bp,過短的PCR產(chǎn)物不能進(jìn)行純化；再者，測序的前50bp和后50bp的序列是不好的，所以不適于直接測序。測序過程中的常見問題分析2：為什么找不到我的PCR引物序列？測序過程中的常見問題分析5：酒精如果沒有揮發(fā)完全,在約300bp處會出現(xiàn)連續(xù)異常的G峰，酒精揮發(fā)時(shí)間過長會導(dǎo)致DNA斷裂。第一個(gè)峰，重疊干擾。如果不判讀為干擾峰，那就說明樣品不純，如果是基因組DNA，就很好地說明了樣品為雜合子，該位點(diǎn)可能存在SNP現(xiàn)象（T/G）。如果判讀為干擾峰，我們只需認(rèn)定樣品此處堿基為T為行了。第二個(gè)峰，錯(cuò)位干擾。如果不判讀為干擾峰，則說明樣本可能比預(yù)期多一個(gè)堿基（G），如果判讀為干擾峰，我們?nèi)灾恍枵J(rèn)定樣品此處堿基為T為行了。測序過程中的常見問題分析5：酒精如果沒有揮發(fā)完全,在約300測序過程中的常見問題分析6：為什么用PCR產(chǎn)物或質(zhì)粒測序時(shí)，經(jīng)常會出現(xiàn)套峰現(xiàn)象?下圖是pGEM-T載體測序的結(jié)果，在83位點(diǎn)處測序結(jié)果出現(xiàn)雙峰，即模板中含有兩個(gè)或兩個(gè)以上的相同載體，但是插入片段不同。解決辦法：重新挑取單克隆或者重新提取質(zhì)粒。需要注意的是，重新進(jìn)行PCR反應(yīng)或者酶切鑒定僅能證明該克隆含有插入片段，并不足以證明模板的單一。測序過程中的常見問題分析6：為什么用PCR產(chǎn)物或質(zhì)粒測序時(shí)，測序過程中的常見問題分析7：poly結(jié)構(gòu)的測序結(jié)果以polyT為例，在polyA/T結(jié)構(gòu)之后往往出現(xiàn)移碼現(xiàn)象，而在polyG/C之后會往往導(dǎo)致測序信號的衰減。解決辦法：使用反向引物對模板進(jìn)行測序，測到該poly結(jié)構(gòu)處，即可完成模板全長的拼接。測序過程中的常見問題分析7：poly結(jié)構(gòu)的測序結(jié)果第二代測序技術(shù)（Next-GenerationSequencing）第二代測序技術(shù)（Next-GenerationSequen各自的優(yōu)點(diǎn)454測序平臺得到的片段能夠達(dá)到400bp，并且讀長的質(zhì)量高；Solexa測序平臺的性價(jià)比最高，在數(shù)據(jù)量相同的情況下，測序成本僅為454測序平臺的1/10；SOLiD測序平臺準(zhǔn)確度能夠達(dá)到99.94%，在片段覆蓋率為15×?xí)r，測序準(zhǔn)確度可接近100%。各自的優(yōu)點(diǎn)454測序平臺得到的片段能夠達(dá)到400bp，并2005年底，454公司推出第一個(gè)基于焦磷酸測序原理的高通量基因組測序系統(tǒng)——GenomeSequencer20System，這是核酸測序技術(shù)發(fā)展史上里程碑式的事件。隨后，羅氏公司以1.55億美元收購了454公司，并在2006年推出了更新的GSFLX測序系統(tǒng)，該系統(tǒng)可在10小時(shí)的運(yùn)行中獲得100萬條讀長（reads），4~6億個(gè)堿基信息（basepair），且準(zhǔn)確率達(dá)到99%以上。2008年，GSFLX系統(tǒng)再次升級，通量提高了5倍，讀長和準(zhǔn)確率也有所增加。雖然454GS測序平臺也許不是市場占有率最高的測序儀，但截至2011年3月，利用該系統(tǒng)進(jìn)行研究的論文已發(fā)表超過1000余篇，而它在讀長上的優(yōu)勢明顯勝于另兩套系統(tǒng)，因此在從頭測序（denovo）和宏基因組測序（metagenome）方面有著不可替代的地位。2005年底，454公司推出第一個(gè)基于焦磷酸測2006年，Solexa公司也推出了自己的NGS系統(tǒng)——GenomeAnalyzer，簡稱GA。這套基于DNA簇（DNAcluster）、橋式PCR（BridgePCR）和可逆阻斷（Reversibleterminator）等核心技術(shù)的系統(tǒng)具有高通量、低錯(cuò)誤率、低成本、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。2007年，Illumina公司以6億美元的高價(jià)收購了Solexa，使GA得以商品化。GA最早期的版本一次運(yùn)行可獲得1Gb的數(shù)據(jù)，因此也有1GbAnalyzer的含義，而最新的Hiseq2000平臺則能夠在10天的運(yùn)行中獲得300Gb以上的數(shù)據(jù)，讀取的堿基長度達(dá)到150bp左右。更有消息稱，Illumina已完成了600Gb的運(yùn)行測試并在部分客戶中開展了前期體驗(yàn)，Tb（1000Gb）級的測試Run也將于年內(nèi)進(jìn)行。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，Illumina公司已售出超過600臺/套GAIIx和Hiseq2000平臺，2010年僅深圳華大基因研究院一家就購買了128臺Hiseq2000，一舉成為全球最大的基因組測序與分析中心，Illumina公司在測序領(lǐng)域的影響力由此可見一斑。2006年，Solexa公司也推出了自己的NG在Sanger測序時(shí)代，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（ABI）一直是該行業(yè)的龍頭老大，其壟斷地位無人能撼，從早期的377到全自動化的3730xl，ABI的測序儀被廣泛應(yīng)用在基因組學(xué)研究的各個(gè)方面。然而在第二代測序技術(shù)迅猛發(fā)展之初，ABI起步較晚，顯得有些漫不經(jīng)心。直到2005年454公司推出GS平臺，ABI的領(lǐng)先地位受到威脅，這才開始發(fā)力，迅速收購了研發(fā)NGS的一家小公司Agencourt，并于2007年推出了它的SOLiD測序平臺。此后SOLiD不斷升級，目前已到SOLiD5版本（SOLiD5500xl）。SOLiD的全稱是SequencingbyOligoLigationDetection，即寡聚物連接檢測測序，其基本原理是通過熒光標(biāo)記的8堿基單鏈DNA探針與模板配對連接，發(fā)出不同的熒光信號，從而讀取目標(biāo)序列的堿基排列順序。在該方法下，目標(biāo)序列的所有堿基都被讀取了兩遍，因此SOLiD最大的優(yōu)勢就是它的高準(zhǔn)確率。據(jù)悉，SOLiD5平臺的測序通量已達(dá)到30Gb/天，成本低于60美元/Gb，準(zhǔn)確率高達(dá)99.99%。并且由于SOLiD系統(tǒng)采用的不是PCR反應(yīng)進(jìn)行DNA合成與測序，因此對于高GC含量的樣本，SOLiD系統(tǒng)具有非常大的優(yōu)勢。在Sanger測序時(shí)代，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（454測序原理焦磷酸測序法（Pyrosequencing)的原理454測序原理焦磷酸測序法（Pyrosequencing)的454測序原理焦磷酸測序法（Pyrosequencing)的原理454測序原理焦磷酸測序法（Pyrosequencing)的454測序原理焦磷酸測序法（Pyrosequencing)的原理454測序原理焦磷酸測序法（Pyrosequencing)的454測序原理在454測序儀中，A、T、G、C四種堿基是分別存儲在單獨(dú)的試劑瓶中的，每步反應(yīng)四種堿基依次加入反應(yīng)池，當(dāng)堿基配對結(jié)合，就會釋放出一個(gè)焦磷酸（PPi），而這個(gè)焦磷酸在酶的作用下，將熒光素氧化成氧化熒光素，并發(fā)出光信號，從而讀取出這一位置的堿基信息。454測序儀的整個(gè)實(shí)驗(yàn)步驟可大致概括為：樣品處理文庫制備emPCR反應(yīng)板準(zhǔn)備上機(jī)測序454測序原理在454測序儀中，A、T、G、C四種堿基是分別454測序原理樣品處理：樣品處理主要是針對大片段的DNA分子，如基因組DNA、Fosmid或BAC質(zhì)粒等，利用超聲或氮?dú)獯驍鄬⑦@些DNA分子片段化，然后采用瓊脂糖凝膠電泳回收或磁珠純化，選擇500-800bp的DNA片段。對于非編碼RNA或PCR產(chǎn)物，則不需要這一步驟。454測序原理樣品處理：454測序原理文庫制備包括接頭連接和磁珠純化兩步，454的文庫接頭分A、B兩種，各44bp，由20bp的PCR引物、20bp的測序引物及4bp（TCAG）的“key”堿基構(gòu)成，其中B接頭的5’端帶有生物素（Biotin）標(biāo)記，用于磁珠純化步驟。經(jīng)過磁珠結(jié)合與DNA變性之后，只有A+目的片段+B形式的連接產(chǎn)物得以富集，另兩種形式（AA、BB）的產(chǎn)物都被去除。454測序原理文庫制備包括接頭連接和磁珠純化兩步，454的文454測序原理emPCR（乳液PCR)是454測序的一個(gè)關(guān)鍵步驟，將富集到的文庫與測序磁珠、各反應(yīng)物混合，加入特定的礦物油和表面活性劑，再利用振蕩器劇烈振蕩，使反應(yīng)體系形成油包水（water-in-oil）的穩(wěn)定乳濁液。在理想條件下，每一個(gè)液滴，或稱微反應(yīng)器（microreactor）中將只包含一個(gè)磁珠和一條單鏈DNA，通過控制該步驟的條件，1mL乳液中可以形成至少10的6次方個(gè)理想的微反應(yīng)器。經(jīng)過PCR擴(kuò)增后，每一個(gè)磁珠上將形成密集的DNA簇，這些DNA序列完全相同，即可用于后續(xù)的步驟。隨后，乳液混合物被打破，擴(kuò)增的片段依然結(jié)合在磁珠上。454測序原理emPCR（乳液PCR)是454測序的一個(gè)關(guān)鍵454測序原理454測序的反應(yīng)板稱為PTP（PicoTiterPlate），含有350萬個(gè)由光纖組成的小孔，每個(gè)孔的直徑為29μm，而測序磁珠的直徑為20μm，因此每個(gè)孔中僅能容納一個(gè)磁珠。將磁珠與測序試劑加入PTP中，使之可用于上機(jī)測序。454測序原理454測序的反應(yīng)板稱為PTP（PicoTit454測序原理測序步驟如前所述，四種堿基在泵的控制下依次加入反應(yīng)板，反應(yīng)完成后再洗去，每延伸一個(gè)或若干個(gè)堿基，就會發(fā)出一次光信號，通過記錄信號的有無和強(qiáng)度，即可測定DNA序列。454測序原理測序步驟如前所述，四種堿基在泵的控制下依次加入《測序技術(shù)介紹》教學(xué)培訓(xùn)模板課件454測序原理優(yōu)缺點(diǎn)：454測序準(zhǔn)確度較高，當(dāng)讀長超過400bp時(shí)，其準(zhǔn)確性仍能達(dá)到99%以上；主要的錯(cuò)誤來自于同聚物，即相同堿基的連續(xù)延伸，如ATTTG這樣一段序列，A和G的讀取沒有問題，但T只記錄了一次光信號，僅信號強(qiáng)度與ATG序列的T有所不同，因此同聚物越長，可能產(chǎn)生的誤差就越大。目前，由于454測序儀在讀長上的明顯優(yōu)勢，它在大基因組從頭測序（denovo）、轉(zhuǎn)錄組分析、基因組結(jié)構(gòu)分析等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。454測序原理優(yōu)缺點(diǎn)：Solexa測序Solexa測序Solexa測序常用術(shù)語：SBS：邊合成邊測序反應(yīng)，每次SBS會延伸一個(gè)堿基，大約耗時(shí)70分鐘。Run：單次上機(jī)測序反應(yīng)，可以產(chǎn)生4G-75G測序通量不等。Lane：單泳道，每條泳道可以直接物理區(qū)分測序樣品，1次run最多可以同時(shí)上樣8條Lane。Channel：Lane的同義詞。Tile：小區(qū)，每條Lane中排有2列tile，合計(jì)120個(gè)小區(qū)。每個(gè)小區(qū)上分布數(shù)目繁多的簇結(jié)合位點(diǎn)。Cluster：簇，在Solexa測序技術(shù)中會采用橋式PCR方式生產(chǎn)DNA簇，每個(gè)DNA簇才能產(chǎn)生亮度達(dá)到CCD可以分辨的熒光點(diǎn)。Solexa測序常用術(shù)語：Solexa測序Index：標(biāo)簽，在Solexa多重測序（MultiplexedSequencing）過程中會使用Index來區(qū)分樣品，并在常規(guī)測序完成后，針對Index部分額外進(jìn)行7個(gè)循環(huán)的測序，通過Index的識別，可以在1條Lane中區(qū)分12種不同的樣品。Barcode:

Index同義詞Fasta：一種序列存儲格式。一個(gè)序列文件若以FASTA格式存儲，則每一條序列的第一行以“>”開頭，而跟隨“>”的是序列的ID號（即唯一的標(biāo)識符）及對該序列的描述信息；第二行開始是序列內(nèi)容，序列短于61nt的，則一行排列完；序列長于61nt的，則每行存儲61nt，最后剩下小于61nt的，在最后一行排列完；第二條序列另起一行，仍然由“>”和序列的ID號開始，以此類推。Solexa測序Index：標(biāo)簽，在Solexa多重測序（MSolexa測序Fastq：Fastq是Solexa測序技術(shù)中一種反映測序序列的堿基質(zhì)量的文件格式。第一行以“@”符號開頭，后面緊跟一個(gè)序列的描述信息；第二行是該序列的內(nèi)容；第三行以“+”符號開頭，后面緊跟的內(nèi)容與第一行一樣，同樣是該序列的描述信息；而第四行是第二行中的序列內(nèi)容每個(gè)堿基所對應(yīng)的測序質(zhì)量值。PF%：PF%是指符合測序質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的簇的百分比（MultiplexedSequencing），與測序的通量相關(guān)聯(lián)。Read：Solexa是成簇反應(yīng)的，每個(gè)簇對應(yīng)一條DNA序列片段，成為一個(gè)read。Solexa測序Fastq：Fastq是Solexa測序技術(shù)Solexa測序Solexa測序Solexa測序Solexa測序Solexa測序Solexa測序Solexa測序Solexa測序Solexa測序Solexa測序Solexa測序Solexa測序Solexa測序Solexa測序Solexa測序Solexa測序Solexa測序應(yīng)用：

Solexa平臺的應(yīng)用范圍極廣，幾乎囊括了目前基因組學(xué)研究的所有方面，例如基因組從頭測序（denovo）、重測序（re-sequencing）、基因組結(jié)構(gòu)分析、轉(zhuǎn)錄組測序、表達(dá)譜分析、小RNA及非編碼RNA測序、表觀遺傳學(xué)研究等等。Solexa測序應(yīng)用：SOLiD測序SOLiD測序SOLiD測序SOLiD測序SOLiD測序SOLiD測序SOLiD測序SOLiD測序SOLiD測序SOLiD測序SOLiD測序SOLiD測序SOLiD測序SOLiD測序SOLiD測序SOLiD測序SOLiD測序SOLiD測序SOLiD測序SOLiD測序SOLiD測序SOLiD測序SOLiD測序SOLiD測序SOLiD測序SOLiD測序SOLiD測序SOLiD測序SOLiD測序SOLiD測序SOLiD測序SOLiD測序三者比較Ｒｏｃｈｅ／４５４測序技術(shù)讀取長度（６００～１０００ｂｐ），在３種測序技術(shù)中最長，可以對未知基因組進(jìn)行從頭測序，但其通量最低（０．５～１Ｇｂ／ｒｕｎ）。當(dāng)遇到ｐｏｌｙｍｅｒ（如ＡＡＡＡＡＡ等）時(shí)，堿基個(gè)數(shù)和熒光信號強(qiáng)度不成線性關(guān)系，即判斷重復(fù)堿基有困難。三者比較Ｒｏｃｈｅ／４５４測序技術(shù)讀取長度（６００～１００三者比較Ｉｌｌｕｍｉｎａ／Ｓｏｌｅｘａ屬于高度自動化的系統(tǒng)，讀取片段比其它種類的測序多，適合進(jìn)行大量小片段的測序（如ｍｉｃｒｏＲＮＡｐｒｏｆｉｌｉｎｇ），其測序通量大，其新機(jī)型Ｈｉｓｅｑ２０００產(chǎn)出量為６００Ｇｂ／ｒｕｎ，但基于可逆反應(yīng)時(shí)隨反應(yīng)輪數(shù)增加效率降低、信號減弱，并且讀長（通常為１００ｂｐ）比Ｒｏｃｈｅ／４５４短，給從頭測序拼接帶來困難。三者比較Ｉｌｌｕｍｉｎａ／Ｓｏｌｅｘａ屬于高度自動化的系統(tǒng)，三者比較ＡＢＩ／ＳＯＬｉＤ技術(shù)每個(gè)堿基讀?。泊?，有非常高的準(zhǔn)確性，特別是針對ＳＮＰ的檢測。此外，靈活的系統(tǒng)和完善的磁珠編碼系統(tǒng)可以進(jìn)行樣品的ｐｏｏｌｉｎｇ來分割測序區(qū)域，特別適用于具有高質(zhì)量參考基因組序列物種的重測序，但是該測序讀長（５０ｂｐ）最短，并且讀取長度受反應(yīng)輪數(shù)的限制，給從頭測序拼接帶來困難。三者比較ＡＢＩ／ＳＯＬｉＤ技術(shù)每個(gè)堿基讀?。泊危蟹浅８叩臏?zhǔn)第三代測序技術(shù)原理：脫氧核苷酸用熒光標(biāo)記，顯微鏡可以實(shí)時(shí)記錄熒光的強(qiáng)度變化。當(dāng)熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸被摻入DNA鏈的時(shí)候，它的熒光就同時(shí)能在DNA鏈上探測到。當(dāng)它與DNA鏈形成化學(xué)鍵的時(shí)候，它的熒光基團(tuán)就被DNA聚合酶切除，熒光消失。這種熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸不會影響DNA聚合酶的活性，并且在熒光被切除之后，合成的DNA鏈和天然的DNA鏈完全一樣。第三代測序技術(shù)原理：第三代測序技術(shù)技術(shù)關(guān)鍵：第一：因?yàn)樵陲@微鏡實(shí)時(shí)記錄DNA鏈上的熒光的時(shí)候，DNA鏈周圍的眾多的熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸形成了非常強(qiáng)大的熒光背景。這種強(qiáng)大的熒光背景使單分子的熒光探測成為不可能。PacificBiosciences公司發(fā)明了一種直徑只有幾十納米的納米孔[zero-modewaveguides(ZMWs)]，單分子的DNA聚合酶被固定在這個(gè)孔內(nèi)。在這么小的孔內(nèi)，DNA鏈周圍的熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸有限，而且由于A，T，C，G這四種熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸非常快速地從外面進(jìn)入到孔內(nèi)又出去，它們形成了非常穩(wěn)定的背景熒光信號。而當(dāng)某一種熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸被摻入到DNA鏈時(shí)，這種特定顏色的熒光會持續(xù)一小段時(shí)間，直到新的化學(xué)鍵形成，熒光基團(tuán)被DNA聚合酶切除為止。第二：共聚焦顯微鏡實(shí)時(shí)地快速地對集成在板上的無數(shù)的納米小孔同時(shí)進(jìn)行記錄。第三代測序技術(shù)技術(shù)關(guān)鍵：第三代測序技術(shù)技術(shù)特點(diǎn)：1、它實(shí)現(xiàn)了DNA聚合酶內(nèi)在自身的反應(yīng)速度，一秒可以測10個(gè)堿基，測序速度是化學(xué)法測序的2萬倍。2、它實(shí)現(xiàn)了DNA聚合酶內(nèi)在自身的延續(xù)性，一個(gè)反應(yīng)就可以測非常長的序列。二代測序現(xiàn)在可以測到上百個(gè)堿基，但是三代測序現(xiàn)在就可以測幾千個(gè)堿基。3、它的精度非常高，達(dá)到99.9999%。4、直接測RNA的序列。既然DNA聚合酶能夠?qū)崟r(shí)觀測，那么以RNA為模板復(fù)制DNA的逆轉(zhuǎn)錄酶也同樣可以。RNA的直接測序，將大大降低體外逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的系統(tǒng)誤差。5、第二個(gè)是直接測甲基化的DNA序列。實(shí)際上DNA聚合酶復(fù)制A、T、C、G的速度是不一樣的。正常的C或者甲基化的C為模板，DNA聚合酶停頓的時(shí)間不同。根據(jù)這個(gè)不同的時(shí)間，可以判斷模板的C是否甲基化。第三代測序技術(shù)技術(shù)特點(diǎn)：第三代測序技術(shù)第三代測序技術(shù)Thistemplateistheinternalstandardcoursewaretemplateoftheenterprise課程結(jié)束ThistemplateistheinternalSWOT分析模板SWOT分析模板155SWOT分析是市場營銷管理中經(jīng)常使用的功能強(qiáng)大的分析工具，最早是由美國舊金山大學(xué)的管理學(xué)教授在80年代初提出來的：S代表strength(優(yōu)勢)，W代表weakness(弱勢)，O代表opportunity(機(jī)會)，T代表threat(威脅)。市場分析人員經(jīng)常使用這一工具來掃描、分析整個(gè)行業(yè)和市場，獲取相關(guān)的市場資訊，為高層提供決策依據(jù)，其中，S、W是內(nèi)部因素，O、T是外部因素。它在制定公司發(fā)展戰(zhàn)略和進(jìn)行競爭對手分析中也經(jīng)常被使用。SWOT的分析技巧類似于波士頓咨詢（BCG）公司的增長/份額矩陣（TheGrowth/ShareMatrix），什么是SWOT分析SWOT分析是市場營銷管理中經(jīng)常使用的功能強(qiáng)大的分析工具，最156內(nèi)部環(huán)境優(yōu)勢Strengths劣勢Weakness機(jī)會Opportunities威脅Threats