DNA生物合成課件

第三章DNA的生物合成第三章1

中心法則(TheCentralDogma)

遺傳信息從DNA到蛋白質(zhì)的傳遞規(guī)律.DNA的遺傳信息轉(zhuǎn)錄為RNA，RNA通過翻譯指導(dǎo)合成蛋白質(zhì)。DNA還通過復(fù)制將遺傳信息代代相傳。1970年發(fā)現(xiàn)RNA能逆轉(zhuǎn)錄為DNA，是對中心法則的補充。

逆轉(zhuǎn)錄 逆轉(zhuǎn)錄2

復(fù)制 DNA的生物合成 逆轉(zhuǎn)錄

復(fù)制（replication）：

以親代DNA為模板合成兩個相同子代DNA的過程。DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)堿基配對規(guī)律DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)3

第一節(jié)復(fù)制的特征第一節(jié)復(fù)制的特征4ParentalDNAPossiblemechanismsforreplicationParentalDNAPossiblemechanism5

半保留復(fù)制的實驗依據(jù)(M.Meselson&F.W.Stahl,1958)N14半保留復(fù)制的實驗依據(jù)N146DNA生物合成課件7

一.半保留復(fù)制 (semiconservativereplication)復(fù)制時，親代的雙鏈DNA解開成兩條單鏈，分別作為模板，以dNTP(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)為原料,

按照堿基配對(A－T、G－C)規(guī)律與模板上的堿基配對,經(jīng)依賴DNA的DNA聚合酶(DNA-pol)催化,合成一條與模板互補的新鏈,新形成的兩個子代DNA分子與親代DNA堿基序列完全相同。每個子代DNA分子中一股單鏈?zhǔn)菑挠H代完整地接受過來,另一股單鏈?zhǔn)切潞铣傻?故稱為半保留復(fù)制。 一.半保留復(fù)制8

9DNA生物合成課件10

半保留復(fù)制的意義

按半保留復(fù)制方式，子代DNA與親代DNA的堿基序列一致，即子代保留了親代的全部遺傳信息，體現(xiàn)了遺傳的保守性。是物種穩(wěn)定的分子基礎(chǔ)，但是相對的，不是絕對的。半保留復(fù)制的意義 11

二.雙向復(fù)制1.復(fù)制起始點(origin,ori)：多數(shù)生物體內(nèi)DNA分子兩條鏈同時復(fù)制。復(fù)制是在DNA分子的特定位點開始，稱為復(fù)制起始點，常用ori(origin)表示。原核生物的DNA只有一個Ori位點，復(fù)制從起點開始，到終點結(jié)束，完成整個DNA分子的復(fù)制,即原核生物的DNA只有一個復(fù)制單位,為單復(fù)制子，稱為復(fù)制體。

復(fù)制子：能獨立完成復(fù)制的功能單位。oriori12真核生物染色體DNA有多個復(fù)制起始點。同時形成多個復(fù)制單位，從一個DNA復(fù)制起始點起始的DNA復(fù)制區(qū)域稱復(fù)制子(replicon)，每個復(fù)制子在一個細(xì)胞分裂周期中必須起動而且只能起動一次，真核生物染色體為多復(fù)制子。真核生物染色體DNA有多個復(fù)制起始點。同時形成多個復(fù)制單位13

2.復(fù)制叉(replicationfork)

復(fù)制時，雙鏈DNA由起始點處打開，沿兩條張開的單鏈模板合成DNA新鏈，兩側(cè)形成的Y型結(jié)構(gòu)稱為復(fù)制叉(replicationfork)。

14

3.雙向復(fù)制(bidirectionalreplication)復(fù)制是從一個起始點開始，同時向兩個方向進(jìn)行，稱為雙向復(fù)制。

15三.半不連續(xù)復(fù)制DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的兩條鏈走向相反，復(fù)制時兩條鏈都能作為模板合成子代DNA。DNA的新鏈合成只能沿5’→3’方向進(jìn)行。DNA解鏈并開始復(fù)制后，一條新鏈合成方向與復(fù)制叉移動方向相同，即以3’→5’走向的親代鏈為模板，因此該鏈可沿5’→3’方向連續(xù)合成，這條新鏈稱為領(lǐng)頭鏈。另一條鏈合成方向與復(fù)制叉移動方向相反，新鏈不能連續(xù)合成稱為隨從鏈。隨從鏈的復(fù)制必須待模板鏈解鏈至一定長度才能進(jìn)行復(fù)制，隨復(fù)制叉延伸過程，可合成許多DNA片段(岡崎片段)，再經(jīng)連接酶催化形成連續(xù)的新鏈。這種領(lǐng)頭鏈連續(xù)復(fù)制，隨從鏈不連續(xù)復(fù)制的方式稱DNA復(fù)制的半不連續(xù)性。

三.半不連續(xù)復(fù)制DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的兩條鏈走向相反，復(fù)制時兩16

領(lǐng)頭鏈(leadingstrand)

順著解鏈方向生成的子鏈，其復(fù)制是連續(xù)進(jìn)行的，得到一條連續(xù)的子鏈。

17

隨從鏈(laggingstrand)

復(fù)制方向與解鏈方向相反，須等解開足夠長度的模板鏈才能繼續(xù)復(fù)制，得到的子鏈由不連續(xù)的片段所組成。岡崎片段(Okazakifragment)岡崎片段(Okazakifragment)18

岡崎片段： 1968年日本生化學(xué)者岡崎利用電鏡及放射自顯影技術(shù)，觀察到DNA復(fù)制中出現(xiàn)一些不連續(xù)的片段，因而將這些不連續(xù)的片段稱為岡崎片段。 原核生物的岡崎片段為一至二千個核苷酸，真核生物約為數(shù)百個核苷酸。

19DNA生物合成課件20

第二節(jié)DNA復(fù)制的酶學(xué)

21

DNA復(fù)制體系復(fù)制是在酶催化下的核苷酸聚合過程,需要多種物質(zhì)的共同參與:

底物：dNTP(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)；

聚合酶(polymerase)：依賴DNA的DNA聚合酶，簡寫為DNA-pol或DDDP；

模板(template)：解開成單鏈的DNA母鏈；

引物(primer)：提供3′-OH末端的寡核苷酸；

其他的酶和蛋白質(zhì)因子

22

一、DNA聚合酶催化dNTP聚合到核酸鏈上的酶。是DNA復(fù)制的主要酶。全稱叫依賴DNA的DNA聚合酶（DNAdependentDNApolymerase）或DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶（DNA-directedDNApolymerase），均縮寫為DDDP。一、DNA聚合酶23

(一)DNA聚合酶催化的反應(yīng)

1.5′至3′的聚合活性

催化四種dNTP一個一個地接到DNA鏈上去。 (dNMP)n+dNTP→(dNMP)n+1+PPi

24

聚合反應(yīng)機(jī)理：依賴于引物和模板催化核苷酸聚合有方向性：5′3′依賴于引物和模板25

聚合反應(yīng)的特點： (1)以單鏈DNA為模板 (2)以dNTP為原料 (3)引物提供3′-OH (4)聚合方向為5′→3′(5)形成3′-5′磷酸二酯鍵

26

2.核酸外切酶活性3′→5′外切酶活性：切除錯配的核苷酸即時校讀5′→3′外切酶活性：切除引物切除突變的片段？3′→5′外切酶活性：5′→3′外切酶活性：？27

(二)DNA聚合酶的種類

1.原核生物的DNA聚合酶pol-I（400:pol-II40:pol-III20）5′→3′聚合酶活性+++3′→5′外切酶活性+++5′→3′外切酶活性+–-功能切除引物填補空隙修復(fù)合成不清復(fù)制的主要酶活性最高pol-Ipol-IIpol-III5′→3′聚合酶活性+28

DNA-polI:單一肽鏈的大分子，二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋為主，含A－R18個α-螺旋。曾被稱為復(fù)制酶(replicase)含量最多功能:對復(fù)制中的錯誤進(jìn)行校讀，對復(fù)制和修復(fù)中出現(xiàn)的空隙進(jìn)行填補。proteaseDNA-polI:protease29

N-terminalC-terminalProtease小片段（323A.A）：具有5′→3′外切酶活性大片段（604A.A）：具有5’→3’聚合活性和3′→5′外切酶活性(Klenow片段)是實驗室常用的工具酶。可被水解成兩個片段

N-terminalC-terminalProtease小30

DNA-polIII:是E.coli的復(fù)制酶，在復(fù)制延長中真正起聚合新鏈作用的DNA聚合酶。由10種亞基組成的不對稱二聚體：?核心酶(α,ε,θ):3’→5’外切酶活性和5’→3’聚合酶活性?β亞基:slidingclampprotein?γ-復(fù)合物:識別帶引物的單鏈DNA，促進(jìn)全酶組裝至模板上，穩(wěn)定酶結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)核心酶活性。催化效率最高DNA-polIII:31DNA生物合成課件32

2.真核生物的DNA聚合酶DNA-pol—引物酶活性，復(fù)制起始引發(fā)DNA-pol—沒有其他DNA-pol時才起作用DNA-pol—催化線粒體DNA的復(fù)制DNA-pol—復(fù)制中延長子鏈的主要酶，有解螺旋酶活性DNA-pol—與原核生物的DNA-polI相似，在復(fù)制中起校讀、修復(fù)和填補缺口作用。

33

(三)復(fù)制的保真性(fidelity)

至少依賴三種機(jī)制：

1.遵守嚴(yán)格的堿基配對規(guī)律； 2.聚合酶在復(fù)制延長中對堿基的選擇功能； 3.復(fù)制中的即時校讀功能。

34DNA生物合成課件35

二、解旋解鏈酶類 解開并理順DNA雙鏈，維持DNA處于單鏈狀態(tài)。主要有解螺旋酶、

DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶和單鏈DNA結(jié)合蛋白。

36

(一)解螺旋酶(helicase)

:

模板對復(fù)制的指導(dǎo)作用在于堿基的準(zhǔn)確配對，而堿基卻埋在雙螺旋的內(nèi)部。只有把DNA解開成單鏈，它才能起模板作用。 解螺旋酶是最早發(fā)現(xiàn)的與復(fù)制有關(guān)的蛋白質(zhì)，當(dāng)時稱為rep蛋白。作用是利用ATP供能，解開DNA雙鏈。

37

復(fù)制相關(guān)蛋白的基因：dnaA、dnaB、dnaC……dnaX 相應(yīng)的表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)：DnaA、DnaB、DnaC……DnaX DnaA：辨認(rèn)復(fù)制起始位點

DnaB：解螺旋酶 DnaC：輔助解螺旋酶使其在起始點上 結(jié)合并打開雙鏈。

38

(二)單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSB)

:

大腸桿菌SSB是由177個氨基酸殘基組成的同源四聚體，結(jié)合單鏈DNA的跨度約32個核苷酸單位。 SSB與解開的DNA單鏈緊密結(jié)合，防止重新形成雙鏈，并免受核酸酶降解。在復(fù)制中維持模板處于單鏈狀態(tài)并保護(hù)單鏈的完整。

39DNA生物合成課件40

(三)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶(topoisomerase)

拓?fù)洌菏侵肝矬w或圖像作彈性移位而又保持物體原有的性質(zhì)。

拓?fù)洚悩?gòu)酶：是一類可改變DNA拓?fù)錁?gòu)象的酶。對DNA分子的作用是既能水解、又能連接磷酸二酯鍵

可松弛DNA超螺旋，有利于DNA解鏈。

41

42

拓?fù)洚悩?gòu)酶I（topoI）:

在原核生物曾被稱為－蛋白。主要作用是切開DNA雙鏈中的一股，使DNA解鏈旋轉(zhuǎn)中不打結(jié)，DNA變?yōu)樗沙跔顟B(tài)再封閉切口。催化反應(yīng)不需要ATP。

43DNA生物合成課件44

拓?fù)洚悩?gòu)酶II（

topoII）:

在原核生物又叫旋轉(zhuǎn)酶(gyrase)。能切斷DNA雙鏈，使螺旋松弛。在ATP參與下，松弛的DNA進(jìn)入負(fù)超螺旋，再連接斷端。

45

46

三、引物酶和引發(fā)體引物酶(primase):依賴DNA的RNA聚合酶。

催化RNA引物的合成。

在大腸桿菌，引物酶是dnaG基因的產(chǎn)物。RNA引物：

在DNA模板的復(fù)制起始部位由引物酶催化NTP的聚合，形成短片段的RNA，為DNA聚合提供3′-OH末端。

47

引發(fā)體(primosome):

是由DnaB、DnaC等蛋白因子一起形成復(fù)合體，再結(jié)合引物酶(DnaG)形成較大的聚合體，結(jié)合到模板DNA上。

復(fù)制開始時，在引發(fā)體的下游解開雙鏈，再由引物酶催化引物的合成。DNA生物合成課件48

四、DNA連接酶（DNAligase）連接DNA鏈3-OH末端和相鄰DNA鏈5-P末端，形成磷酸二酯鍵，從而把兩段相鄰的DNA鏈連接成完整的鏈。反應(yīng)需要ATP/NAD+。只能連接堿基互補基礎(chǔ)上雙鏈中的單鏈缺口，不能連接單獨存在的DNA或RNA單鏈。若DNA兩股都有單鏈缺口，只要缺口前后堿基互補也可連接。ATPATP49

DNA連接酶在復(fù)制、DNA修復(fù)、

重組、剪接中均起縫合缺口作用。是重要的工具酶之一。

50

第三節(jié)DNA生物合成過程第三節(jié)51

一、原核生物DNA的生物合成（一）復(fù)制的起始1.識別復(fù)制起始點2.解開DNA雙鏈：由拓?fù)洚悩?gòu)酶松弛超螺旋，解螺旋酶解開雙鏈，SSB結(jié)合到單鏈上使其穩(wěn)定。3.形成引發(fā)體和生成引物

GenomeinE.coliGenomeinE.coli52E.coli復(fù)制起始點——oriC的序列特征三組各13bp的串連重復(fù)序列（Tandemrepeats）兩對9bp反向重復(fù)序列（invertedrepeats）,富含AT，是DnaA蛋白的結(jié)合部位。E.coli復(fù)制起始點——oriC的序列特征三組各53(1)DnaA辨認(rèn)并結(jié)合oriC處并使此區(qū)域DNA解鏈。(2)DnaB在DnaC協(xié)助下解開雙鏈并沿解鏈方向移動，逐漸置換DnaA，SSB結(jié)合于解開的單鏈DNA上。(3)引物酶DnaG進(jìn)入，形成由DnaB、DnaC、DnaG和DNA起始復(fù)制區(qū)構(gòu)成的引發(fā)體。

DNA生物合成課件54DNA生物合成課件55DNA生物合成課件56(4)引發(fā)體的蛋白質(zhì)在DNA鏈上可以移動,消耗ATP。(5)引物酶DnaG沿5’→3’方向催化NTP聚合，合成短鏈RNA引物。引物長度約為十幾個到幾十個核苷酸不等。聚合酶Ⅲ催化第一個dNTP與引物3‘-OH生成磷酸二酯鍵。拓?fù)涿缸饔?使解鏈順利進(jìn)行。DNA生物合成課件57復(fù)制的起始復(fù)制的起始58大腸桿菌DNA復(fù)制的步驟大腸桿菌DNA復(fù)制的步驟59參與復(fù)制起始的各種因子DnaA蛋白辨認(rèn)起始點解螺旋酶（DnaB蛋白，rep蛋白）解開DNA雙鏈DnaC蛋白協(xié)助解螺旋酶引物酶（DnaG蛋白）催化RNA引物生成SSB穩(wěn)定解開的單鏈拓?fù)洚悩?gòu)酶理順DNA鏈oriC(245bp的DNA組分)E.coli的復(fù)制起始點名稱功能參與復(fù)制起始的各種因子DnaA蛋白60

（二）復(fù)制的延長

在DNA聚合酶催化下，以解開的單鏈為模板，以四種dNTP為原料，進(jìn)行聚合作用。即新進(jìn)入的dNTP與引物或延長中的子鏈上3′－OH形成磷酸二酯鍵，由5′3′方向延長子鏈。（二）復(fù)制的延長61半不連續(xù)復(fù)制：（1）領(lǐng)頭鏈合成方向與解鏈方向一致,連續(xù)合成（2）隨從鏈方向與解鏈方向相反,5'→3'不連續(xù)合成

半不連續(xù)復(fù)制：62

同一復(fù)制叉上，領(lǐng)頭鏈先于隨從鏈復(fù)制，但兩鏈由同一DNA-polⅢ催化合成同一復(fù)制叉上，領(lǐng)頭鏈先于隨從鏈復(fù)制，63

64（三）復(fù)制的終止原核生物為環(huán)狀DNA，雙向復(fù)制，兩個復(fù)制叉的匯合點就是復(fù)制的終點(termination,Ter)E.coli的復(fù)制終點(32位點)位于環(huán)形染色體和OriC相對處，有特異的終止區(qū)序列，剛好把DNA分成2個半圓,雙向復(fù)制進(jìn)行180度后在終點匯合。（三）復(fù)制的終止原核生物為環(huán)狀DNA，雙向復(fù)制，兩個復(fù)制叉的65

隨從鏈不連續(xù)片段的連接1.引物水解:前一個岡崎片段延長至后一片段時,DNA-polI水解引物；2.填補空隙:polⅠ利用前一個岡崎片段的3′-OH,催化dNTP聚合填補空缺；3.片段連接:DNA連接酶連接二個DNA片段，形成完整的DNA鏈。領(lǐng)頭鏈引物水解后的空隙由環(huán)狀DNA最后復(fù)制的3′-OH末端延長填補并連接。復(fù)制終止后,2個子代DNA分子相互鉸鏈在一起,在拓?fù)涿涪蜃饔孟?將其分開。

66222222222222233333333333333333333333333333333333333332222222222222222222222223333333333333333333367真核生物細(xì)胞分裂的時相變化——細(xì)胞周期:

G1phase:periodgrowthofcell

Sphase:DNA合成期

G2phase:cellsprepareformitosis

Mphase:mitosis

Gophase:nondividingcellsDNAreplicateperiodically二.真核生物DNA的生物合成真核生物細(xì)胞分裂的時相變化——DNAreplicatep68真核生物DNA復(fù)制的特點真核染色質(zhì)DNA結(jié)構(gòu)龐大，DNA復(fù)制有多個起始點，通過許多獨立復(fù)制子完成。每個復(fù)制子有固定復(fù)制起點，雙向復(fù)制。各起點復(fù)制起始不同步。真核生物DNA聚合酶有DNA-polα、β、γ、δ、ε。DNA-polδ在復(fù)制延長中起催化作用，有解螺旋酶活性。DNA-polα有引物酶活性。拓?fù)洚悩?gòu)酶復(fù)制因子(Replicationfactor,RF):RFA,RFC等.增殖細(xì)胞核抗原(Proliferationcellnuclearantigen,PCNA)聚合DNA速度比原核DNA-pol慢，但總體速度不慢。隨后鏈也是不連續(xù)合成，岡崎片段比原核細(xì)胞的短，只有數(shù)百個核苷酸。真核生物DNA復(fù)制的特點真核染色質(zhì)DNA結(jié)構(gòu)龐大，DNA復(fù)制69真核生物線性染色體:多個復(fù)制起點，復(fù)制叉到達(dá)下一個起點或分子末端時即終止。真核生物線性染色體:70DNA生物合成課件71DNA生物合成課件72真核DNA復(fù)制的同時,組蛋白、非組蛋白同時合成,復(fù)制完成后,裝配成核蛋白,組成染色體。真核DNA復(fù)制的同時,組蛋白、非組蛋白同時合成,復(fù)制完成后,73DNAligaseDNApolymeraseRNaseHRemoveRNAprimerFillthegapJoinDNAfragmentsDNApolεDNAligase真核生物復(fù)制的終止DNAligaseDNApolymeraseRNase74

染色體DNA呈線性，復(fù)制在末端停止。

75DNA生物合成課件76

端粒與端粒酶

端粒(telomere)是位于真核細(xì)胞線性染色體末端的特殊結(jié)構(gòu),由一段串聯(lián)重復(fù)的富含T、G的DNA短序列與端粒結(jié)合蛋白構(gòu)成；端粒具有穩(wěn)定染色體，防止末端降解和融合的功能；并維持DNA復(fù)制的完整性。端粒DNA序列在進(jìn)化上高度保守，不同生物的端粒序列都很相似，由長5-10bp的重復(fù)單位串聯(lián)而成，人類的重復(fù)序列為TTAGGG，長約15kb；端粒平均長度隨細(xì)胞分裂次數(shù)的增多及年齡的增長而變短,端粒DNA逐漸變短而消失,可導(dǎo)致染色體穩(wěn)定性下降，細(xì)胞隨之衰老。端粒與端粒酶77熒光原位雜交顯示的端粒（上）和端粒序列（下）熒光原位雜交顯示的端粒（上）和端粒序列（下）78DNA生物合成課件79端粒酶(telomerase)由RNA和蛋白質(zhì)構(gòu)成的一種核糖核蛋白復(fù)合體，RNA分子含復(fù)制端粒DNA所需的核苷酸模板，其蛋白質(zhì)部分具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性。能以自身的RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成端粒DNA，維持端粒的長度。人類端粒酶含三部分：端粒酶RNA(HumantelomeraseRNA,hTR)、端粒酶協(xié)同蛋白(Humantelomeraseassociatedprotein1,hTP1)、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(Humantelomerasereversetranscriptase,hTRT).除骨髓干細(xì)胞、胚胎原始干細(xì)胞等細(xì)胞外,大多數(shù)正常人體細(xì)胞檢測不到端粒酶活性。惡性腫瘤細(xì)胞中,85%～90%端粒酶強(qiáng)陽性。端粒酶可作為腫瘤標(biāo)志和腫瘤治療靶點.

端粒酶(telomerase)80

爬行模型：

81DNA生物合成課件82DNA生物合成課件83

端粒及端粒酶的意義：端粒的長短及端粒酶活性變化與細(xì)胞水平的老化(aging)及腫瘤的發(fā)生有一定關(guān)系。

84第四節(jié)逆轉(zhuǎn)錄和其他復(fù)制方式一.逆轉(zhuǎn)錄病毒和逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄(reversetranscription)——以RNA為模板，dNTP為原料,在逆轉(zhuǎn)錄酶催化下,合成與RNA互補的DNA的過程。

逆轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase,依賴RNA的DNA聚合酶) 1.RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性 2.RNA水解酶活性 3.DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性第四節(jié)逆轉(zhuǎn)錄和其他復(fù)制方式853DmodelofHIVreversetranscriptase3DmodelofHIVreversetransc86

逆轉(zhuǎn)錄過程：逆轉(zhuǎn)錄酶催化的DNA合成反應(yīng)也是5′→3′方向。需要的引物是病毒本身的一種tRNA。逆轉(zhuǎn)錄酶催化的DNA合成反應(yīng)也是5′→3′方向。87DNA生物合成課件88DNA生物合成課件89DNA生物合成課件901.Aretrovirus-specificcellulartRNAhybridizeswithacomplementaryregioncalledtheprimer-bindingsite(PBS).2.ADNAsegmentisextendedfromtRNAbasedonthesequenceoftheretroviralgenomicRNA.3.TheviralRandU5sequencesareremovedbyRNaseH.4.Firstjump:DNAhybridizeswiththeremainingRsequenceatthe3'end.5.ADNAstrandisextendedfromthe3'end.6.MostviralRNAisremovedbyRNaseH.7.AsecondDNAstrandisextendedfromtheviralRNA.8.BothtRNAandtheremainingviralRNAareremovedbyRNaseH.9.Secondjump:ThePBSregionofthesecondstrandhybridizeswiththePBSregionofthefirststrand.10.ExtensiononbothDNAstrands.

LTRstandsfor"longterminalrepeat".DNA生物合成課件91

RNA病毒經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄成為雙鏈DNA，能整合入宿主細(xì)胞基因組，并隨宿主細(xì)胞復(fù)制和表達(dá),可能使宿主細(xì)胞發(fā)生癌變。RNA病毒經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄成為雙鏈DNA，能整合入宿主細(xì)胞基因組，92DNA生物合成課件93Atypical,"minimal"retrovirusconsistsof:1.anouterenvelopewhichwasderivedfromtheplasmamembraneofitshost2.manycopiesofanenvelopeproteinembeddedinthelipidbilayerofitsenvelope3.acapsid;aproteinshellcontaining4.twomoleculesofRNAand5.moleculesoftheenzymereversetranscriptaseAtypical,"minimal"retroviru94HumanImmunodeficiencyVirus(HIV)

HumanImmunodeficiencyVirus(95DNA生物合成課件96Reversetranscription

invirus分子生物學(xué)研究可應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄酶合成DNA。以mRNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成的與mRNA堿基序列互補的DNA鏈，稱為互補DNA(complementaryDNA,cDNA)cDNAReversetranscription分子生物學(xué)研究可97

二.滾環(huán)復(fù)制和D環(huán)復(fù)制

一些簡單低等生物或染色體以外的DNA復(fù)制的特殊形式。

98D環(huán)復(fù)制滾環(huán)復(fù)制線粒體DNA為D環(huán)復(fù)制D環(huán)復(fù)制的特點是復(fù)制起點不在雙鏈DNA同一位點，內(nèi)、外環(huán)復(fù)制有時序差別

D環(huán)復(fù)制滾環(huán)復(fù)制線粒體DNA為D環(huán)復(fù)制D環(huán)復(fù)制的特點是復(fù)制起99

第四節(jié)

DNA損傷與修復(fù)

100

突變(mutation)： 是指遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)改變而引起的遺傳信息的改變，也稱為DNA損傷(DNAdamage)。 從分子水平來看，突變就是DNA分子上堿基的改變。

101DNA生物合成課件102

一、突變的意義(一)突變是進(jìn)化、分化的分子基礎(chǔ)

進(jìn)化過程是突變的不斷發(fā)生所造成的。沒有突變就沒有今天的五彩繽紛的世界。遺傳學(xué)家認(rèn)為：沒有突變就不會有遺傳學(xué)。

大量的突變都屬于由遺傳過程自然發(fā)生的，叫自發(fā)突變或自然突變（spontaneousmutation）。

103

(二)突變導(dǎo)致基因型改變

這種突變只有基因型的改變，而沒有可察覺的表型改變。

多態(tài)性(polymophism)：是用來描述個體之間的基因型差別現(xiàn)象。利用DNA多態(tài)性分析技術(shù)，可識別個體差異和種、株間差異。

104

(三)突變導(dǎo)致死亡突變發(fā)生在對生命至關(guān)重要的基因上，可導(dǎo)致個體或細(xì)胞的死亡。

105

(四)突變是某些疾病的發(fā)病基礎(chǔ)包括遺傳病、腫瘤及有遺傳傾向的病。有些已知其遺傳缺陷所在。但大多數(shù)尚在研究中。

106鐮狀細(xì)胞貧血

是一種常染色體顯性遺傳血紅蛋白(Hb)病。因β-肽鏈第6位氨基酸谷氨酸被纈氨酸所代替，構(gòu)成鐮狀血紅蛋白(HbS),取代了正常Hb(HbA)。鐮狀細(xì)胞貧血107DNA生物合成課件108

二、引發(fā)突變的因素

大量的突變屬自發(fā)突變，發(fā)生頻率為10-9。

用生活環(huán)境中導(dǎo)致突變的因素，在實驗室可以誘發(fā)突變，稱為誘變，導(dǎo)致突變的因素稱為誘變劑。主要有物理和化學(xué)因素。

109

物理因素：紫外線和各種輻射二聚體的形成影響了DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu),使復(fù)制和轉(zhuǎn)錄受阻二聚體的形成影響了DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu),使復(fù)制和轉(zhuǎn)錄受阻110

化學(xué)因素：常見的化學(xué)誘變劑化合物類別分子改變堿基類似物(如：5-BU)A→5-BU→G羥胺類(NH2OH)T→C亞硝酸鹽(NO2-)C→U烷化劑(如：氮芥類)G→mG化合物類別分子改變堿基類似物(如：5-BU)A→5-111

三、突變的類型(一)錯配（點突變）

——指DNA分子上一個堿基的變異（置換）。

1.轉(zhuǎn)換(transition)： 發(fā)生在同型堿基之間的置換嘌呤←→嘌呤嘧啶←→嘧啶 2.顛換(transversion)： 發(fā)生在異型堿基之間的置換嘌呤←→嘧啶

112

鐮形紅細(xì)胞貧血病人的Hb(HbS)與正常成人的Hb(HbA)比較HbSHbA基因模板鏈CACCTCmRNAGUGGAG肽鏈第6位氨基酸ValGluHbSHbA基因模板鏈CACCTCmRNAGUGGA113

(二)缺失(deletion)和插入(insertion)

1.缺失：一個堿基或一段核苷酸鏈從DNA大分子上缺失 2.插入：DNA大分子上插入一個堿基或一段核苷酸鏈

114

框移突變(frame-shiftmutation):

缺失和插入引起的三聯(lián)體密碼的閱讀方式改變，造成蛋白質(zhì)氨基酸排列順序發(fā)生改變。通常使基因產(chǎn)物完全失活，出現(xiàn)終止碼會使翻譯提前終止。

正常 5′……GCA

GUA

CAU

GUC…… 丙纈組纈缺失C5′……GAG

UAC

AUG

UC…… 谷酪蛋絲

115

(三)重排(rearrangement)

——DNA分子內(nèi)發(fā)生較大片段的交換，也稱為重組。 移位的DNA可以在新位點上顛倒方向反置（倒位），也可以在染色體 之間發(fā)生交換重組。

116第四章：DNA的突變、損傷和修復(fù)第四章：DNA的突變、損傷和修復(fù)117第一節(jié)：突變（mutation)第一節(jié)：突變（mutation)118一、突變的主要類型

突變是DNA堿基序列水平上的永久的、可遺傳的改變。堿基序列的變化可以分為下面幾種類型

：堿基替換（basesubstitution），即DNA分子中一個堿基被另一個堿基替代；插入（insertion），涉及一個或多個堿基插入到DNA序列中；缺失（deletion），涉及DNA序列上一個或多個堿基的缺失；第一節(jié)：突變（mutation)一、突變的主要類型突變是DNA堿基序列水平上的永久的119重復(fù)（duplication），一段堿基序列發(fā)生一次重復(fù)；倒位（inversion），一段堿基序列發(fā)生倒轉(zhuǎn)，但仍保留在原來的位置上；易位（translocation），一段堿基序列從原來的位置移出，并插入到基因組的另一位置。重復(fù)（duplication），一段堿基序列發(fā)生一次重復(fù)；倒1201.堿基替換堿基替換又稱為點突變（pointmutation），是一種最簡單的突變。堿基替換可以分為轉(zhuǎn)換（transition）和顛換（transversion）兩種類型。轉(zhuǎn)換是指嘌呤與嘌呤之間，或嘧啶與嘧啶之間的替換；顛換是指嘌呤與嘧啶之間的替換。1.堿基替換121DNA生物合成課件122DNA生物合成課件123DNA生物合成課件1242.缺失、插入、移碼突變基因的編碼序列中插入或者缺失一個或兩個堿基，會使DNA的閱讀框架發(fā)生改變，導(dǎo)致插入或缺失部位之后的所有密碼子都跟著發(fā)生變化，結(jié)果產(chǎn)生一種截短的或異常的多肽鏈，這種突變稱為移碼突變（frameshiftmutations）。移碼突變常常完全破壞了編碼蛋白質(zhì)的功能，除非移碼突變發(fā)生在靠近讀碼框的遠(yuǎn)端的地方。2.缺失、插入、移碼突變基因的編碼序列中插入或者缺失一個125DNA生物合成課件1263.DNA重排DNA重排包括缺失、倒位、易位和重復(fù)?；蚪M中相似序列之間的配對，以及隨后發(fā)生的重組可以造成DNA的重排。如圖，同一DNA分子的兩個同向重復(fù)序列之間的配對和重組將使兩個重復(fù)序列之間的部分形成一個獨立的環(huán)，從原來的DNA分子上釋放出來。原來的DNA分子則產(chǎn)生相應(yīng)的缺失。

3.DNA重排DNA重排包括缺失、倒位、易位和重復(fù)。127圖表示同一DNA分子上的兩個反向重復(fù)序列發(fā)生配對形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。配對后的重組將導(dǎo)致反向重復(fù)序列之間的部分發(fā)生倒位。例如，大腸桿菌染色體含有7個拷貝的rRNA基因。有一些大腸桿菌菌株，染色體上兩個rRNA操縱子之間的序列發(fā)生了倒位。這些菌株能夠存活，但生長速度比正常的菌株要慢一些。

圖表示同一DNA分子上的兩個反向重復(fù)序列發(fā)生配對形成128第二部分：突變的修復(fù)第二部分：突變的修復(fù)129一、光復(fù)活（Photoreactivation）

在可見光存在的情況下，DNA光解酶（DNAphotolyase）把環(huán)丁烷嘧啶二聚體分解為單體。DNA光解酶,又稱光復(fù)活酶（photoreactivatingenzyme）。光解酶在暗中結(jié)合到環(huán)丁烷二聚體上，吸收300～350nm的光后被激活，裂解二聚體后與DNA分子脫離。從光復(fù)活修復(fù)過程可以看出，光解酶不是將嘧啶二聚體替換掉，而是將兩個嘧啶環(huán)之間的非正?；瘜W(xué)鍵切開，恢復(fù)到原來的形式。由于這種修復(fù)作用只在可見光下才可發(fā)生，所以這種修復(fù)機(jī)制稱為光復(fù)活。

一、光復(fù)活（Photoreactivation）在130

(一)光修復(fù)(lightrepairing)光修復(fù)酶光修復(fù)酶131DNA生物合成課件132二、烷基的轉(zhuǎn)移二、烷基的轉(zhuǎn)移133核苷酸切除修復(fù)需要移去一段包括損傷在內(nèi)的核苷酸序列，然后再通過DNA合成把余下的單鏈缺口填補上。它可以修復(fù)一系列損傷，包括環(huán)丁烷二聚體、6－4光產(chǎn)物和鏈間交聯(lián)等引起的DNA變形（majordistortion）。盡管這些損傷也可以通過途徑進(jìn)行修復(fù)，但NER是它們的主要修復(fù)手段。其他能夠引起DNA產(chǎn)生顯著變形的損傷也可以通過該途徑進(jìn)行修復(fù)。但是，這種機(jī)制不能修復(fù)DNA上的錯配堿基，以及僅造成DNA微小變形的堿性類似物和甲基化堿基。三、核苷酸切除修復(fù)核苷酸切除修復(fù)需要移去一段包括損傷在內(nèi)的核苷酸序列，然后134

修復(fù)過程需要多種酶的一系列作用，其中包括UvrA,UvrB,UvrC和UvrD。由2個UvrA亞基和1個UvrB亞基構(gòu)成的復(fù)合體，非特異性地結(jié)合在DNA分子上，并沿DNA分子滑動，對DNA進(jìn)行掃描，其中UvrA負(fù)責(zé)檢測螺旋中的扭曲，一旦抵達(dá)扭曲部位，UvrA就會退出復(fù)合體。UvrB募集UvrC,UvrC具有核酸內(nèi)切酶活性，它切斷損傷位點兩側(cè)的磷酸二酯鍵，3’切割點距損傷位點4－5個核苷酸，5’切割點距損傷位點8個核苷酸。修復(fù)過程需要多種酶的一系列作用，其中包括UvrA,U135UvrD與5’端的切點結(jié)合。UvrD是一種解旋酶（又稱DNAhelicaseII），它解開兩個切點之間的DNA雙螺旋，導(dǎo)致一段短的帶有損傷的ssDNA和UvrC被釋放出來，此時UvrB仍結(jié)合于另一條單鏈DNA分子上，可能是防止單鏈被降解,也可能是指導(dǎo)DNA聚合酶I與缺口的3’OH結(jié)合，合成一段新的核苷酸片斷填補缺口，同時釋放出UvrB,最后一個磷酸二酯鍵由DNA連接酶催化形成。UvrD與5’端的切點結(jié)合。UvrD是一種解旋酶（又稱DNA136DNA生物合成課件137四、堿基切除修復(fù)DNA糖基化酶（glycosylases）能夠切斷脫氨堿基、甲基化堿基和氧化堿基等非正常堿基與脫氧核糖之間的糖苷鍵，在DNA上產(chǎn)生一個無嘌呤（apurinic）或無嘧啶（apyrimidinic）位點（AP位點）。細(xì)胞胞內(nèi)的AP核酸內(nèi)切酶，附著在AP位點上，并在AP位點的5’-端切斷磷酸二酯鍵，形成一個游離的3’－OH末端。DNA聚合酶I利用其5’-3’外切酶活性切去AP位點以及其下游的一段核苷酸序列，同時延伸3’-OH末端填補缺口。最后的切口由DNA連接酶封閉。四、堿基切除修復(fù)DNA糖基化酶（glycosylases138DNA生物合成課件139DNA生物合成課件140五、錯配修復(fù)（mismatchrepair）DNA聚合酶的3’→5’外切酶活性可將錯誤摻入的核苷酸去除。聚合酶的這種校正功能將DNA復(fù)制的忠實度提高100倍。然而，DNA聚合酶的校正作用并非絕對安全，有些錯誤插入的核苷酸會逃脫檢測，并在新合成的鏈與模板鏈之間形成錯誤配對。在下一輪復(fù)制時錯誤插入的核苷酸將指導(dǎo)與其互補的核苷酸插入到新合成的鏈中，結(jié)果導(dǎo)致DNA序列中產(chǎn)生一個永久性改變。五、錯配修復(fù)（mismatchrepair）DNA聚合141由于復(fù)制中出現(xiàn)的錯配堿基存在于子鏈中，因此該系統(tǒng)必須在復(fù)制叉通過之后有一種能夠識別親本鏈與子鏈的方法，以保證只從子鏈中糾正錯配的堿基。由于復(fù)制中出現(xiàn)的錯配堿基存在于子鏈中，因此該系統(tǒng)必須在復(fù)制叉142

當(dāng)新合成的DNA鏈上出現(xiàn)錯配的堿基對時，2分子的MutS識別并結(jié)合錯配的堿基對。接著2分子的MutL蛋白結(jié)合到MutS－DNA復(fù)合體上。DNA分子通過MutS－MutL復(fù)合體在兩個方向上的滑動形成一個回環(huán)。一旦遇到半甲基化的GATC序列，MutS－MutL便募集MutH。MutH在子鏈GATC序列的5’端切斷磷酸二酯鍵，產(chǎn)生一個3’－羥基末端和一個5’－磷酸末端(...pN-3'-OH+pGpApTpC....)。當(dāng)新合成的DNA鏈上出現(xiàn)錯配的堿基對時，2分子的MutS143核酸外切酶在解旋酶（UvrD）及Ssb蛋白的協(xié)作下，從切口處開始去除一段包括錯配堿基在內(nèi)的一段堿基序列。如果切口位于錯配位點的3’端，此步驟由外切核酸酶I負(fù)責(zé)完成。如果切口位于錯配位點的5’端，則由能夠從5’至3’方向降解核酸鏈的外切核酸酶VII或RecJ執(zhí)行。最后，DNA聚合酶III和DNA連接酶根據(jù)親本鏈的序列填補子鏈上被切除的部分，包括錯配的堿基。核酸外切酶在解旋酶（UvrD）及Ssb蛋白的協(xié)作下，從切口處144DNA生物合成課件145DNA生物合成課件146DNA生物合成課件147DNA生物合成課件148CH3GATC

CTAGGTGATC5′3′CTAG3′5′GTCH3CH3GATC

CTAGGTMutHMutSMutL切口CH3GATC

CTAGGT5′3′CH3

GATC5′3′

CTAG3′5′TGDNA解鏈酶核酸外切酶SSBdNMPsCH3GATC

CTAGGT5′3′DNA聚合酶DNA連接酶dNTPsCH3GATC

CTAGGC3.2DNA錯配修復(fù)的模型CH3GATCC149六、重組修復(fù)（recombinationalrepair）在討論重組修復(fù)機(jī)制之前，有必要先分析一下胸腺嘧啶二聚體對DNA復(fù)制的影響。當(dāng)聚合酶III遇到胸腺嘧啶二聚體時，會在二聚體位點停頓下來。這時，細(xì)胞會在二聚體的下游開始下一個岡崎片段的合成，新生鏈在二聚體對應(yīng)的位置上出現(xiàn)一個缺口。通過重組過程可填補新生鏈上的缺口。缺口可用圖所示的DNA重組方式填補：①受損DNA復(fù)制時，一條子代DNA分子在損傷的對應(yīng)部位出現(xiàn)缺口。六、重組修復(fù)（recombinationalrepair）150DNA生物合成課件151②另一條子代DNA分子完整的母鏈與有缺口的子鏈DNA進(jìn)行重組交換，母鏈DNA上相應(yīng)的片段被用于填補子鏈上的缺口，而母鏈DNA出現(xiàn)又出現(xiàn)一個新的缺口。③母鏈上的缺口再以另一條子鏈DNA為模板，經(jīng)DNA聚合酶催化合成一新DNA片段進(jìn)行填補，最后由DNA連接酶連接，完成修補。

一個雙鏈損傷變成兩個單鏈損傷②另一條子代DNA分子完整的母鏈與有缺口的子鏈DNA進(jìn)行重組152重組修復(fù)并不能去除損傷，損傷仍然保留在原來的位置。但是重組修復(fù)能使細(xì)胞完成DNA復(fù)制，并且新合成的子鏈?zhǔn)峭暾摹＝?jīng)多次復(fù)制后，損傷就被“沖淡”了，在子代細(xì)胞中只有一個細(xì)胞是帶有損傷DNA的。重組修復(fù)機(jī)制對于細(xì)胞處理不易被修復(fù)或者不能被修復(fù)的損傷有著特殊的意義。重組修復(fù)并不能去除損傷，損傷仍然保留在原來的位置。但是重153DNA生物合成課件154DNA生物合成課件155RecombinationalRepair(Post-ReplicationRepair)DNAreplicationStructuraldistortionExcisepatchfromintactstrandandinsertingapRepairgapExcisionrepair?(RecA)RecombinationalRepair(Post-R156六、SOS反應(yīng)（SOSresponses）1.SOS反應(yīng)：當(dāng)DNA受到嚴(yán)重?fù)p傷時，染色體的DNA復(fù)制被抑制，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生SOS反應(yīng)：大約20個參與DNA損傷修復(fù)和DNA復(fù)制功能恢復(fù)的基因的表達(dá)水平升高，細(xì)胞的DNA修復(fù)能力得到加強(qiáng)，甚至出現(xiàn)DNA的跨損傷（tanslesionsynthesis）合成。六、SOS反應(yīng)（SOSresponses）1.SOS反應(yīng)：1572.LexA:

在正常的細(xì)胞內(nèi)，SOS基因的誘導(dǎo)表達(dá)被阻遏蛋白LexA抑制。LexA以二聚體的形式與SOS基因啟動子區(qū)的SOS框（SOSbox，5‘-CTG--tenbases--CAG-3‘,TACTGTATATATATACAGTA-3′）結(jié)合阻遏了基因的轉(zhuǎn)錄起始。然而，此時細(xì)胞中的某些SOS基因產(chǎn)物也維持在相當(dāng)高的水平，這是因為有些基因具有另一個不受LexA調(diào)控的啟動子，或者基因的SOS框的堿基序列與一致序列的出入比較大，LexA與之結(jié)合得不是十分牢固。

2.LexA:1583.SOS反應(yīng)的誘導(dǎo)：

當(dāng)DNA受到嚴(yán)重?fù)p傷后，由于細(xì)胞內(nèi)的切除修復(fù)和重組修復(fù)致使DNA單鏈部分在細(xì)胞中積累。RecA蛋白因與單鏈DNA結(jié)合而被活化，活化后的RecA蛋白再與LexA結(jié)合，引起LexA的自切，解除LexA對SOS基因的阻遏作用。3.SOS反應(yīng)的誘導(dǎo)：1594.SOS基因：

在SOS反應(yīng)中，SOS基因是按照一定的順序被誘導(dǎo)表達(dá)的。SOS基因的表達(dá)時間由LexA與基因的SOS框的親和力決定。按照在SOS反應(yīng)中的表達(dá)時期，可以大致把SOS基因分為3組。首先被誘導(dǎo)的SOS基因是一些參與單鏈損傷修復(fù)的基因（比如，uvrA，uvrB，uvrD）或者與損傷耐受性有關(guān)的基因（比如，polB）。編碼LexA和DinI的基因也在這一時期被誘導(dǎo)表達(dá)。DinI的功能是延遲激活跨損傷的DNA合成。

4.SOS基因：160如果參與單鏈修復(fù)的基因不能幫助恢復(fù)正常的DNA合成速度，參與重組修復(fù)的基因便被誘導(dǎo)表達(dá)，它們包括recA和recN。如果出現(xiàn)大范圍的DNA損傷，依靠提高重組修復(fù)的能力仍不能克服損傷對DNA復(fù)制的抑制作用，以sfiA和umuDC為代表的第3組基因被激活。umuDC操縱子被激活后細(xì)胞會進(jìn)行DNA跨損傷復(fù)制。SfiA的作用是抑制細(xì)胞的分裂。如果DNA的復(fù)制速度恢復(fù)到正常，這3類基因按照與激活相反的次序依次被關(guān)閉。相反，如果細(xì)胞仍不能修復(fù)DNA損傷，原噬菌體被誘導(dǎo)裂解細(xì)胞。如果參與單鏈修復(fù)的基因不能幫助恢復(fù)正常的DNA合成速度，參與161geneGeneproduct/functionn.ofcopy/cellBasallevelSOSinducedcellExpressedfirstlexALexA/SOSrepressor1,3001uvrAUvrABCexcinuclease/excisionrepair20250uvrBUvrABCexcinuclease/excisionrepair2501,000uvrDHelicaseII/excisionrepair,fidelityofrecombinationalrepair5,000–8,00025,000–65,000polBDNApolymeraseII/translesionDNAsynthesis40300ruvASubunitofRuvABhelicase/recombinationalrepair7005,600geneGeneproduct/functionn.of162ruvBSubunitofRuvABhelicase/recombinationalrepair2001,600dinIInhibitionofUmuDprocessing<5002,300ExpressedsecondrecARecAcoprotease,synaptase/SOSderepressor,recombinationalrepair1,000–10,000100,000recNRecN/recombinationalrepair??ruvBSubunitofRuvABhelicase/163ExpressedlastsfiASfiA(SulA)/celldivisioninhibitor??umuDSubunitofUmuD′C/translesionDNAsynthesis1802,400umuCSubunitofUmuD′C/translesionDNAsynthesis0200ExpressedlastsfiASfiA(SulA)/1645.SOS誘導(dǎo)突變

umuC和umuD（UV-inducedmutagenesis,umu），它們屬于同一個操縱子，轉(zhuǎn)錄方向是DC。如上所述，與其他SOS基因一樣，umuC和umuD基因在正常情況下被LexA阻遏。當(dāng)DNA受損、復(fù)制受阻時，與單鏈DNA結(jié)合的RecA不但促進(jìn)LexA自體切割，同樣也能促進(jìn)UmuD的自體切割，只是RecA促進(jìn)UmuD切割的效率相當(dāng)?shù)停@就保證了UmuD在SOS反應(yīng)的晚期才會發(fā)生自體切割，形成UmuD’。兩分子UmuD’與一分子的UmuC組成的三聚體稱為DNA聚合酶V。5.SOS誘導(dǎo)突變umuC和umuD（UV-indu165在損傷位點，DNA聚合酶V取代停頓下來的DNA聚合酶III復(fù)制DNA的損傷區(qū)。這種DNA聚合酶的一個重要性質(zhì)是，雖然它們是模板依賴性的，但是它們向新生鏈的3’末端添加核苷酸時并不依賴堿基配對原則，因此DNA聚合酶V又稱為差錯傾向聚合酶（error-pronepolymerase）。在損傷位點的另一側(cè)，DNA聚合酶III迅速取代DNA聚合酶V進(jìn)行DNA合成。盡管這類DNA聚合酶在進(jìn)行跨損傷DNA合成時不遵循堿基配對原則，但是插入的核苷酸仍不是隨機(jī)的。在損傷位點，DNA聚合酶V取代停頓下來的DNA聚合酶III復(fù)166DNA生物合成課件167

第三章DNA的生物合成第三章168

中心法則(TheCentralDogma)

遺傳信息從DNA到蛋白質(zhì)的傳遞規(guī)律.DNA的遺傳信息轉(zhuǎn)錄為RNA，RNA通過翻譯指導(dǎo)合成蛋白質(zhì)。DNA還通過復(fù)制將遺傳信息代代相傳。1970年發(fā)現(xiàn)RNA能逆轉(zhuǎn)錄為DNA，是對中心法則的補充。

逆轉(zhuǎn)錄 逆轉(zhuǎn)錄169

復(fù)制 DNA的生物合成 逆轉(zhuǎn)錄

復(fù)制（replication）：

以親代DNA為模板合成兩個相同子代DNA的過程。DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)堿基配對規(guī)律DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)170

第一節(jié)復(fù)制的特征第一節(jié)復(fù)制的特征171ParentalDNAPossiblemechanismsforreplicationParentalDNAPossiblemechanism172

半保留復(fù)制的實驗依據(jù)(M.Meselson&F.W.Stahl,1958)N14半保留復(fù)制的實驗依據(jù)N14173DNA生物合成課件174

一.半保留復(fù)制 (semiconservativereplication)復(fù)制時，親代的雙鏈DNA解開成兩條單鏈，分別作為模板，以dNTP(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)為原料,

按照堿基配對(A－T、G－C)規(guī)律與模板上的堿基配對,經(jīng)依賴DNA的DNA聚合酶(DNA-pol)催化,合成一條與模板互補的新鏈,新形成的兩個子代DNA分子與親代DNA堿基序列完全相同。每個子代DNA分子中一股單鏈?zhǔn)菑挠H代完整地接受過來,另一股單鏈?zhǔn)切潞铣傻?故稱為半保留復(fù)制。 一.半保留復(fù)制175

176DNA生物合成課件177

半保留復(fù)制的意義

按半保留復(fù)制方式，子代DNA與親代DNA的堿基序列一致，即子代保留了親代的全部遺傳信息，體現(xiàn)了遺傳的保守性。是物種穩(wěn)定的分子基礎(chǔ)，但是相對的，不是絕對的。半保留復(fù)制的意義 178

二.雙向復(fù)制1.復(fù)制起始點(origin,ori)：多數(shù)生物體內(nèi)DNA分子兩條鏈同時復(fù)制。復(fù)制是在DNA分子的特定位點開始，稱為復(fù)制起始點，常用ori(origin)表示。原核生物的DNA只有一個Ori位點，復(fù)制從起點開始，到終點結(jié)束，完成整個DNA分子的復(fù)制,即原核生物的DNA只有一個復(fù)制單位,為單復(fù)制子，稱為復(fù)制體。

復(fù)制子：能獨立完成復(fù)制的功能單位。oriori179真核生物染色體DNA有多個復(fù)制起始點。同時形成多個復(fù)制單位，從一個DNA復(fù)制起始點起始的DNA復(fù)制區(qū)域稱復(fù)制子(replicon)，每個復(fù)制子在一個細(xì)胞分裂周期中必須起動而且只能起動一次，真核生物染色體為多復(fù)制子。真核生物染色體DNA有多個復(fù)制起始點。同時形成多個復(fù)制單位180

2.復(fù)制叉(replicationfork)

復(fù)制時，雙鏈DNA由起始點處打開，沿兩條張開的單鏈模板合成DNA新鏈，兩側(cè)形成的Y型結(jié)構(gòu)稱為復(fù)制叉(replicationfork)。

181

3.雙向復(fù)制(bidirectionalreplication)復(fù)制是從一個起始點開始，同時向兩個方向進(jìn)行，稱為雙向復(fù)制。

182三.半不連續(xù)復(fù)制DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的兩條鏈走向相反，復(fù)制時兩條鏈都能作為模板合成子代DNA。DNA的新鏈合成只能沿5’→3’方向進(jìn)行。DNA解鏈并開始復(fù)制后，一條新鏈合成方向與復(fù)制叉移動方向相同，即以3’→5’走向的親代鏈為模板，因此該鏈可沿5’→3’方向連續(xù)合成，這條新鏈稱為領(lǐng)頭鏈。另一條鏈合成方向與復(fù)制叉移動方向相反，新鏈不能連續(xù)合成稱為隨從鏈。隨從鏈的復(fù)制必須待模板鏈解鏈至一定長度才能進(jìn)行復(fù)制，隨復(fù)制叉延伸過程，可合成許多DNA片段(岡崎片段)，再經(jīng)連接酶催化形成連續(xù)的新鏈。這種領(lǐng)頭鏈連續(xù)復(fù)制，隨從鏈不連續(xù)復(fù)制的方式稱DNA復(fù)制的半不連續(xù)性。

三.半不連續(xù)復(fù)制DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的兩條鏈走向相反，復(fù)制時兩183

領(lǐng)頭鏈(leadingstrand)

順著解鏈方向生成的子鏈，其復(fù)制是連續(xù)進(jìn)行的，得到一條連續(xù)的子鏈。

184

隨從鏈(laggingstrand)

復(fù)制方向與解鏈方向相反，須等解開足夠長度的模板鏈才能繼續(xù)復(fù)制，得到的子鏈由不連續(xù)的片段所組成。岡崎片段(Okazakifragment)岡崎片段(Okazakifragment)185

岡崎片段： 1968年日本生化學(xué)者岡崎利用電鏡及放射自顯影技術(shù)，觀察到DNA復(fù)制中出現(xiàn)一些不連續(xù)的片段，因而將這些不連續(xù)的片段稱為岡崎片段。 原核生物的岡崎片段為一至二千個核苷酸，真核生物約為數(shù)百個核苷酸。

186DNA生物合成課件187

第二節(jié)DNA復(fù)制的酶學(xué)

188

DNA復(fù)制體系復(fù)制是在酶催化下的核苷酸聚合過程,需要多種物質(zhì)的共同參與:

底物：dNTP(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)；

聚合酶(polymerase)：依賴DNA的DNA聚合酶，簡寫為DNA-pol或DDDP；

模板(template)：解開成單鏈的DNA母鏈；

引物(primer)：提供3′-OH末端的寡核苷酸；

其他的酶和蛋白質(zhì)因子

189

一、DNA聚合酶催化dNTP聚合到核酸鏈上的酶。是DNA復(fù)制的主要酶。全稱叫依賴DNA的DNA聚合酶（DNAdependentDNApolymerase）或DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶（DNA-directedDNApolymerase），均縮寫為DDDP。一、DNA聚合酶190

(一)DNA聚合酶催化的反應(yīng)

1.5′至3′的聚合活性

催化四種dNTP一個一個地接到DNA鏈上去。 (dNMP)n+dNTP→(dNMP)n+1+PPi

191

聚合反應(yīng)機(jī)理：依賴于引物和模板催化核苷酸聚合有方向性：5′3′依賴于引物和模板192

聚合反應(yīng)的特點： (1)以單鏈DNA為模板 (2)以dNTP為原料 (3)引物提供3′-OH (4)聚合方向為5′→3′(5)形成3′-5′磷酸二酯鍵

193

2.核酸外切酶活性3′→5′外切酶活性：切除錯配的核苷酸即時校讀5′→3′外切酶活性：切除引物切除突變的片段？3′→5′外切酶活性：5′→3′外切酶活性：？194

(二)DNA聚合酶的種類

1.原核生物的DNA聚合酶pol-I（400:pol-II40:pol-III20）5′→3′聚合酶活性+++3′→5′外切酶活性+++5′→3′外切酶活性+–-功能切除引物填補空隙修復(fù)合成不清復(fù)制的主要酶活性最高pol-Ipol-IIpol-III5′→3′聚合酶活性+195

DNA-polI:單一肽鏈的大分子，二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋為主，含A－R18個α-螺旋。曾被稱為復(fù)制酶(replicase)含量最多功能:對復(fù)制中的錯誤進(jìn)行校讀，對復(fù)制和修復(fù)中出現(xiàn)的空隙進(jìn)行填補。proteaseDNA-polI:protease196

N-terminalC-terminalProtease小片段（323A.A）：具有5′→3′外切酶活性大片段（604A.A）：具有5’→3’聚合活性和3′→5′外切酶活性(Klenow片段)是實驗室常用的工具酶?？杀凰獬蓛蓚€片段

N-terminalC-terminalProtease小197

DNA-polIII:是E.coli的復(fù)制酶，在復(fù)制延長中真正起聚合新鏈作用的DNA聚合酶。由10種亞基組成的不對稱二聚體：?核心酶(α,ε,θ):3’→5’外切酶活性和5’→3’聚合酶活性?β亞基:slidingclampprotein?γ-復(fù)合物:識別帶引物的單鏈DNA，促進(jìn)全酶組裝至模板上，穩(wěn)定酶結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)核心酶活性。催化效率最高DNA-polIII:198DNA生物合成課件199

2.真核生物的DNA聚合酶DNA-pol—引物酶活性，復(fù)制起始引發(fā)DNA-pol—沒有其他DNA-pol時才起作用DNA-pol—催化線粒體DNA的復(fù)制DNA-pol—復(fù)制中延長子鏈的主要酶，有解螺旋酶活性DNA-pol—與原核生物的DNA-polI相似，在復(fù)制中起校讀、修復(fù)和填補缺口作用。

200

(三)復(fù)制的保真性(fidelity)

至少依賴三種機(jī)制：

1.遵守嚴(yán)格的堿基配對規(guī)律； 2.聚合酶在復(fù)制延長中對堿基的選擇功能； 3.復(fù)制中的即時校讀功能。

201DNA生物合成課件202

二、解旋解鏈酶類 解開并理順DNA雙鏈，維持DNA處于單鏈狀態(tài)。主要有解螺旋酶、

DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶和單鏈DNA結(jié)合蛋白。

203

(一)解螺旋酶(helicase)

:

模板對復(fù)制的指導(dǎo)作用在于堿基的準(zhǔn)確配對，而堿基卻埋在雙螺旋的內(nèi)部。只有把DNA解開成單鏈，它才能起模板作用。 解螺旋酶是最早發(fā)現(xiàn)的與復(fù)制有關(guān)的蛋白質(zhì)，當(dāng)時稱為rep蛋白。作用是利用ATP供能，解開DNA雙鏈。

204

復(fù)制相關(guān)蛋白的基因：dnaA、dnaB、dnaC……dnaX 相應(yīng)的表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)：DnaA、DnaB、DnaC……DnaX DnaA：辨認(rèn)復(fù)制起始位點

DnaB：解螺旋酶 DnaC：輔助解螺旋酶使其在起始點上 結(jié)合并打開雙鏈。

205

(二)單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSB)

:

大腸桿菌SSB是由177個氨基酸殘基組成的同源四聚體，結(jié)合單鏈DNA的跨度約32個核苷酸單位。 SSB與解開的DNA單鏈緊密結(jié)合，防止重新形成雙鏈，并免受核酸酶降解。在復(fù)制中維持模板處于單鏈狀態(tài)并保護(hù)單鏈的完整。

206DNA生物合成課件207

(三)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶(topoisomerase)

拓?fù)洌菏侵肝矬w或圖像作彈性移位而又保持物體原有的性質(zhì)。

拓?fù)洚悩?gòu)酶：是一類可改變DNA拓?fù)錁?gòu)象的酶。對DNA分子的作用是既能水解、又能連接磷酸二酯鍵

可松弛DNA超螺旋，有利于DNA解鏈。

208

209

拓?fù)洚悩?gòu)酶I（topoI）:

在原核生物曾被稱為－蛋白。主要作用是切開DNA雙鏈中的一股，使DNA解鏈旋轉(zhuǎn)中不打結(jié)，DNA變?yōu)樗沙跔顟B(tài)再封閉切口。催化反應(yīng)不需要ATP。

210DNA生物合成課件211

拓?fù)洚悩?gòu)酶II（

topoII）:

在原核生物又叫旋轉(zhuǎn)酶(gyrase)。能切斷DNA雙鏈，使螺旋松弛。在ATP參與下，松弛的DNA進(jìn)入負(fù)超螺旋，再連接斷端。

212

213

三、引物酶和引發(fā)體引物酶(primase):依賴DNA的RNA聚合酶。

催化RNA引物的合成。

在大腸桿菌，引物酶是dnaG基因的產(chǎn)物。RNA引物：

在DNA模板的復(fù)制起始部位由引物酶催化NTP的聚合，形成短片段的RNA，為DNA聚合提供3′-OH末端。

214

引發(fā)體(primosome):

是由DnaB、DnaC等蛋白因子一起形成復(fù)合體，再結(jié)合引物酶(DnaG)形成較大的聚合體，結(jié)合到模板DNA上。

復(fù)制開始時，在引發(fā)體的下游解開雙鏈，再由引物酶催化引物的合成。DNA生物合成課件215

四、DNA連接酶（DNAligase）連接DNA鏈3-OH末端和相鄰DNA鏈5-P末端，形成磷酸二酯鍵，從而把兩段相鄰的DNA鏈連接成完整的鏈。反應(yīng)需要ATP/NAD+。只能連接堿基互補基礎(chǔ)上雙鏈中的單鏈缺口，不能連接單獨存在的DNA或RNA單鏈。若DN