B族鏈球菌檢測的標(biāo)準(zhǔn)操作程序

B族鏈球菌檢測的標(biāo)準(zhǔn)操作程序B族鏈球菌檢測的標(biāo)準(zhǔn)操作程序B族鏈球菌檢測的標(biāo)準(zhǔn)操作程序資料僅供參考文件編號：2022年4月B族鏈球菌檢測的標(biāo)準(zhǔn)操作程序版本號：A修改號：1頁次：1.0審核：批準(zhǔn):發(fā)布日期：B族鏈球菌檢測的標(biāo)準(zhǔn)操作程序?qū)嶒?yàn)室名稱項(xiàng)目編號制定日期B族鏈球菌（GBS）核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）年月日【目的】保證檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠?！具m用范圍】適用于本實(shí)驗(yàn)室的檢驗(yàn)人員?！驹揝OP變動程序】本標(biāo)準(zhǔn)操作程序的變動，可由任一使用本SOP的工作人員提出，并報(bào)經(jīng)下述人員批準(zhǔn)簽字：專業(yè)主管、科主任?！驹噭吭噭┟Q：B族鏈球菌（GBS）核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）生產(chǎn)廠家：北京現(xiàn)代高達(dá)生物技術(shù)有限責(zé)任公司包裝規(guī)格：20人份/盒試劑盒組成：序號半成品名稱主要組分1DNA提取液Tris-HCl、NaCH、Triton、EDTA2GBSPCR反應(yīng)液Tap酶、UNG、引物、探針等3GBS陽性對照品含目標(biāo)片段的滅火大腸桿菌4空白對照品純化水5說明書貯藏條件及有效期：試劑盒應(yīng)置2－8℃【儀器設(shè)備】儀器名稱：儀器廠家：儀器型號：儀器校準(zhǔn)：本儀器由儀器廠家工程師負(fù)責(zé)校準(zhǔn)?！緳z驗(yàn)原理】本試劑盒利用Taqman探針實(shí)時PCR技術(shù)，針對B族鏈球菌基因組特異且無高頻SNP位點(diǎn)的序列區(qū)域cAMP因子，設(shè)計(jì)出特異性引物和探針，配以全封閉PCR體系，檢測標(biāo)本中的B族鏈球菌DNA。體系中通過加入內(nèi)參照系統(tǒng)排除PCR反應(yīng)過程中可能的假陰性結(jié)果，并通過加入U(xiǎn)NG避免可能的擴(kuò)增污染物造成的假陽性結(jié)果?！緲?biāo)本要求】1.樣本采集：采用藻酸鈣、普通棉拭子或滌綸拭子采集生殖道或直腸等部位帶上皮細(xì)胞的分泌物標(biāo)本。（1）妊娠34-37周孕婦生殖道分泌物：先拭去陰道過多的分泌物，采用無菌拭子插入陰道至內(nèi)1/3處，沿陰道壁輕輕旋轉(zhuǎn)取得分泌物，將采集的拭子置于無菌管中，密閉送檢；（2）妊娠34-37周孕婦直腸分泌物：將拭子插入肛門，在肛門括約肌以上約處，沿腸壁輕輕旋轉(zhuǎn)取得標(biāo)本，將采集的拭子置于無菌管中，密閉送檢；（3）樣本一經(jīng)送檢，則應(yīng)盡快送至檢測實(shí)驗(yàn)室，運(yùn)輸應(yīng)符合當(dāng)?shù)胤ㄒ?guī)。2.標(biāo)本存放：待測樣本在2-8℃保存不應(yīng)超過24小時；-18℃以下保存不超過4天。樣本的凍融次數(shù)：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明，樣本凍融6次以內(nèi)無影響，但應(yīng)盡量避免凍融。3.樣本的運(yùn)輸條件：冷凍（干冰運(yùn)輸）4天內(nèi)無影響，冷藏（冰袋運(yùn)輸）2天內(nèi)無影響。4.含血樣本無法正常檢測應(yīng)避免。5.研究顯示，常用栓劑藥物“保婦康栓”會對試劑盒檢測造成較大影響，因此取樣前應(yīng)避免該藥品的使用。【檢驗(yàn)方法】1.DNA提?。ㄔ跇悠诽幚韰^(qū)操作）（1）妊娠34-37周孕婦生殖道或直腸分泌物：取含有分泌物的生理鹽水1ml13000rpm離心10min，棄上清液，沉淀（如不明顯可再重復(fù)一遍離心）加無菌生理鹽水1ml混勻，13000rpm離心5min，棄上清。沉淀加入50μlDNA提取液充分混勻，99℃~100℃加熱處理10min，13000rpm離心10min，吸取上清至離心管中保存，DNA提取完畢。（2）GBS陽性對照品提?。喝?0μlGBS陽性對照品加入離心管中（用滅菌生理鹽水補(bǔ)齊至1ml），13000rpm離心10min，棄上清。沉淀加入50μlDNA提取液充分混勻，99-100℃加熱處理10min，13000rpm離心10min，吸取上清至離心管中保存，DNA提取完畢。（3）空白對照品提取：同GBS陽性對照品提取。建議：DNA提取完畢后應(yīng)盡快進(jìn)行PCR檢測，以保證檢測效果；2.GBSPCR反應(yīng)液配制（在試劑準(zhǔn)備區(qū)進(jìn)行）解凍試劑，在打開蓋子之前震蕩并短暫離心各試劑管。按標(biāo)本數(shù)量（需包含陰性對照品及GBS陽性對照品）分裝GBSPCR反應(yīng)液。按每管35μl分裝至PCR反應(yīng)管/板中，轉(zhuǎn)入樣品處理區(qū)。3.加樣（在樣品處理區(qū)進(jìn)行）分裝好的各反應(yīng)管/板分別加入處理好的DNA樣品5μl、陰性對照品5μl及陽性對照品各5μl。短暫離心使所有試劑集中到反應(yīng)管底部（不能有氣泡），確定蓋好管蓋或封膜后，立即進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。注意：陽性定量參考品含有高濃度的目標(biāo)DNA，請務(wù)必小心操作，避免污染4.PCR擴(kuò)增（在PCR檢測區(qū)進(jìn)行）按以下方案運(yùn)行儀器程序：（1）UNG反應(yīng)：50℃2min；（2）預(yù)變性：95℃5min；（3）PCR：(95℃15sec→60℃35sec)45個循環(huán)；60℃時分別檢測FAM和HEX通道熒光信號，選擇反應(yīng)體系40μl。5.閾值設(shè)定閾值設(shè)定在空白對照正常擴(kuò)增曲線的上方，基線設(shè)定可選擇3-5個循環(huán)，一般情況選擇為，若是最高濃度樣本的Ct值小于，則在3~5之間按照低于最高濃度樣本Ct值設(shè)定；這類高濃度樣本應(yīng)稀釋后再進(jìn)行檢測。具體儀器設(shè)定如下：ABI7500基線、閾值設(shè)定：調(diào)整Baseline的Start值可在3~5之間，End值≤，閾值線設(shè)定以剛好超過正常空白對照擴(kuò)增曲線（無規(guī)則的噪音線）的最高點(diǎn)，即空白對照Ct值或者“Undet”為準(zhǔn)；6.質(zhì)量控制（1）FAM通道檢測結(jié)果：a)空白對照品：Ct值不顯示；b)CT陽性對照品：Ct<；（2）HEX通道檢測結(jié)果：內(nèi)參照：Ct≤；注：以上要求需在同一次實(shí)驗(yàn)中同時滿足。7.檢測結(jié)果分析和判定（1）陰性結(jié)果判定：如果FAM通道無Ct值顯示,而HEX通道信號正常（Ct≤），則該樣品為陰性;（2）陽性結(jié)果判定：a)若樣品的FAM通道Ct≤，則判定樣品為陽性；b)若樣品的<Ct≤，則建議對該樣本進(jìn)行重試，如重試結(jié)果仍為<Ct≤或Ct≤，則判定為陽性；如Ct不顯示且HEX通道信號正常（Ct≤），則判定為陰性。注：HEX通道是內(nèi)參照的信號通道，通過HEX信號檢測可排除由于PCR體系的干擾因素或性能下降造成的假陰性反應(yīng)。8.擴(kuò)增曲線形態(tài)：正常擴(kuò)增為標(biāo)準(zhǔn)S形擴(kuò)增曲線【結(jié)果解釋】實(shí)驗(yàn)室存在試劑污染，樣品交叉污染會出現(xiàn)假陽性結(jié)果；試劑運(yùn)輸；保存不當(dāng)或試劑配置不準(zhǔn)確引起的試劑性能下降，出現(xiàn)假陰性或試劑定量不準(zhǔn)確的結(jié)果。內(nèi)參照HEX通道無Ct值顯示表明PCR反應(yīng)受到抑制，擴(kuò)增失敗。本試劑盒檢測結(jié)果不能直接作為臨床確診或排除病例的依據(jù)，僅供臨床醫(yī)生參考。【檢驗(yàn)方法的局限性】當(dāng)待檢測樣本中被檢測核酸濃度低于1×10基因拷貝/ml時可能會發(fā)生假陰性結(jié)果。【注意事項(xiàng)】1.實(shí)驗(yàn)前請仔細(xì)閱讀本說明書；2.每次實(shí)驗(yàn)應(yīng)設(shè)置陰性對照品；試劑使用前應(yīng)充分融化并混勻；自備滅菌生理鹽水；3.反應(yīng)管中應(yīng)盡量避免氣泡的產(chǎn)生，管蓋需蓋緊；4.實(shí)驗(yàn)室必須嚴(yán)格遵循PCR基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室的管理規(guī)范，操作人員必須經(jīng)過培訓(xùn)，合格后方能上崗；5.實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格分區(qū)進(jìn)行，即試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本處理區(qū)和PCR檢測區(qū)，各區(qū)的白大衣、手套和帽子等不能帶入其它區(qū)域，各區(qū)儀器設(shè)備不能帶入其它區(qū)域；6.請使用無菌帶濾芯吸頭，實(shí)驗(yàn)中廢棄的吸頭應(yīng)棄于含10%次氯酸鈉的廢液缸中；實(shí)驗(yàn)全過程必須帶一次性手套；7.擴(kuò)增結(jié)束后不要打開管子，應(yīng)密封