乳酸發(fā)酵研究進(jìn)展解析課件

發(fā)酵法生產(chǎn)乳酸技術(shù)進(jìn)展

發(fā)酵法生產(chǎn)乳酸技術(shù)進(jìn)展

一.概述

乳酸發(fā)酵:指糖經(jīng)無氧酵解而生成乳酸的發(fā)酵(lacticfermentation，fermentationoflacticacid)。與乙醇發(fā)酵同為生物體內(nèi)二種主要的發(fā)酵形式。在動物組織中，除特殊的內(nèi)臟外，幾乎所有的組織都具有進(jìn)行這種發(fā)酵的性質(zhì)，此過程稱為糖酵解。乳酸細(xì)菌能利用葡萄糖及其他相應(yīng)的可發(fā)酵性糖產(chǎn)生乳酸，稱為乳酸發(fā)酵。

乳酸是重要的天然有機(jī)酸,一元羧基酸（-羥基丙酸）.存在于酸牛奶而得名，產(chǎn)、銷量僅次于檸檬酸。

一.概述乳酸發(fā)酵:指糖經(jīng)無氧酵解而生成乳酸的發(fā)酵1780年瑞士化學(xué)家Scheele首先從酸乳中提煉得到乳酸;1857年P(guān)asteur在研究乳酸發(fā)酵過程中發(fā)現(xiàn)了乳酸菌;1878年J.Lister從酸敗的牛乳中分離了乳酸菌,命名為乳桿菌;自然發(fā)酵乳酸是1941年由Boutron和Fremy發(fā)現(xiàn)的;純種發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)乳酸是1981由美國CharlesEaveyy開始,荷蘭的Purac公司和美國的ADM公司是世界上較大的乳酸生產(chǎn)企業(yè)。中國有數(shù)十年乳酸生產(chǎn)歷史,安徽豐源生化公司(2002年建立)最大,設(shè)計年產(chǎn)3萬噸。

1780年瑞士化學(xué)家Scheele首先從酸乳中提煉得到乳酸;1.乳酸的理化性質(zhì)

HCH3-C-COOHOH

分子式C3H6O3,分子量為90.08，結(jié)構(gòu)中含有不對稱碳原子，具有旋光性.分子帶有(-OH)和羧基(-COOH)兩個官能團(tuán),是自然界中存在最廣泛的一種羥基羧酸。粘稠狀液體，無色，澄明，微具黃色，無嗅，味微酸，有較強(qiáng)吸濕性，可以與水、酒精和乙醚以任意比例混合。1.乳酸的理化性質(zhì)乳酸經(jīng)氧化可形成丙酮酸、乙醛、乙酸和二氧化碳.乳酸可被還原為丙酸,丙二醇(不飽和聚酯、環(huán)氧樹脂、聚氨酯樹脂的重要原料)乳酸縮合反應(yīng)生成線性聚脂-聚乳酸.乳酸酯化反應(yīng)為乳酸酯.乳酸脫水生成丙烯酸(400萬噸市場容量/a,絮凝劑,分散劑,復(fù)膜劑,油漆,皮革、造紙、紡織粘合劑等生產(chǎn)的重要工業(yè)原料,1.5萬元/噸)乳酸經(jīng)氧化可形成丙酮酸、乙醛、乙酸和二氧化碳.

2.乳酸的用途

①作為終端產(chǎn)品

食品飲料：酸味劑、調(diào)味劑、防腐劑;

現(xiàn)代醫(yī)藥：乳酸亞鐵鐵質(zhì)食品添加劑，容易被人體吸收，治療缺鐵性貧血;

日用化工:生產(chǎn)染料,可降解材料等等;

制革:鞣革劑;

農(nóng)業(yè):植物生長調(diào)節(jié)劑.

2.乳酸的用途乳酸鏈球菌素（Nisin）*乳酸鏈球菌素是由乳酸鏈球菌產(chǎn)生的一種多肽抗菌素類物質(zhì)，由34個氨基酸組成。它是一種高效、無毒的天然食品防腐劑。室溫下、酸性加熱條件下均很穩(wěn)定。如在pH2.0/121℃加熱30分鐘，產(chǎn)品仍很穩(wěn)定。乳酸鏈球菌的抗菌譜比較窄，它只能殺死或抑制革蘭氏陽性菌，特別是細(xì)菌孢子，對陰性菌、酵母菌均無作用。一般10-50ppm即有效。ADI0-33000IU/Kg(bw)(FAO/WHO,1994)乳酸鏈球菌是多肽，食用后在消化道中很快被蛋白水解酶分解成氨基酸，不會改變腸道內(nèi)正常菌群，以及引起常用其他抗菌素所出現(xiàn)的抗藥性，更不會與其它抗菌素出現(xiàn)交叉抗性。

乳酸鏈球菌素（Nisin）*乳酸鏈球菌素是由乳酸鏈球菌產(chǎn)生的2.乳酸的用途②化學(xué)工業(yè)中重要的平臺原料制成乳酸鹽,乳酸酯;催化生成乙醛,丙二醇,丙稀酸,戊二醛等;更為重要的是用于合成生物能夠降解的新型環(huán)保材料—聚乳酸(PLA).2.乳酸的用途聚乳酸*單個的乳酸分子中有一個羥基和一個羧基，多個乳酸分子在一起，-OH與別的分子的-COOH脫水縮合，-COOH與別的分子的-OH脫水縮合，就這樣，它們手拉手形成了聚合物，叫做聚乳酸。聚乳酸也稱為聚丙交酯，屬于聚酯家族。聚乳酸是以乳酸為主要原料聚合得到的聚合物，原料來源充分而且可以再生。聚乳酸的生產(chǎn)過程無污染，而且產(chǎn)品可以生物降解，實現(xiàn)在自然界中的循環(huán)，因此是理想的綠色高分子材料。

聚乳酸*單個的乳酸分子中有一個羥基和一個羧基，多個乳酸分子在二.乳酸發(fā)酵的工藝及控制—乳酸發(fā)酵是乳酸生產(chǎn)的關(guān)鍵步驟

1.菌種及產(chǎn)酸機(jī)理—菌種為發(fā)酵的基本要素目前乳酸生產(chǎn)菌種為細(xì)菌(乳桿菌為代表,Lactobacilusdelbrackii（德氏乳桿菌))和霉菌(以米根霉為代表,Rhizopusoryzae)乳制品、葡萄酒、酸泡菜、醬醪、醋醅中都可分離到乳酸菌.

二.乳酸發(fā)酵的工藝及控制—乳酸發(fā)酵是乳酸生產(chǎn)的關(guān)鍵步驟

1.同型乳酸發(fā)酵細(xì)菌發(fā)酵—乳球菌(Lactococcus),鏈球菌(Streptococcus).片球菌(Pediococcus)及乳桿菌(Lactobacilus)的部分。同型乳酸發(fā)酵同型乳酸發(fā)酵乳酸細(xì)菌→EMP→由1個葡萄糖分子產(chǎn)生2個乳酸分子(理論轉(zhuǎn)化率100%)優(yōu)勢:純度高;轉(zhuǎn)化率高;能耗低(需無菌空氣和攪拌動力都很低)。缺點:需在培養(yǎng)基中添加有機(jī)氮源,這樣增加了生產(chǎn)成本和分離純化難度。同型乳酸發(fā)酵乳酸細(xì)菌→EMP→由1個葡萄糖分子產(chǎn)生2個乳酸同型乳酸發(fā)酵同型乳酸發(fā)酵異型乳酸發(fā)酵異型乳酸發(fā)酵異型乳酸發(fā)酵細(xì)菌發(fā)酵—腸膜明串株菌（Leuconostocmesenteroides）、葡聚糖明串珠菌（L.dextranicum）、雙歧桿菌（Bifidobacteriumbifidum）等異型乳酸發(fā)酵細(xì)菌發(fā)酵—腸膜明串株菌（Leuconostoc異型乳酸發(fā)酵6-磷酸葡萄糖酸的途徑（磷酸酮解途徑）:異型乳酸發(fā)酵6-磷酸葡萄糖酸的途徑（磷酸酮解途徑）:總反應(yīng)式:C6H12O6+ADP+Pi→

CH3CHOHCHOH+CH3COOH+CO2+ATP通過磷酸戊糖途徑（HMP）,1mol己糖生成1mol乙醇、lmol二氧化碳和1mol乳酸。乳酸對糖轉(zhuǎn)化率50％。總反應(yīng)式:C6H12O6+ADP+Pi→CH3C雙歧途徑（磷酸酮糖途徑）雙歧發(fā)酵是雙歧桿菌發(fā)酵葡萄糖的一條途徑。經(jīng)HK途徑—磷酸己糖解酮酶途徑。發(fā)酵總應(yīng)式為：2C6H12O6

→2CH3CHOHCOOH+3CH3COOH此發(fā)酵過程中，2mol的葡萄糖生成2mol乳酸和3mol的乙酸，乳酸轉(zhuǎn)化率理論為50%。雙歧途徑（磷酸酮糖途徑）

米根霉(Rhizopusoryzae)是中國藥和酒曲中的重要霉菌之一。在土壤、空氣及其他物質(zhì)上亦常見。菌落疏松或稠密，最初白色后變?yōu)榛液种梁诤稚?，匍匐枝爬行，無色。假根發(fā)達(dá)，指狀或根狀分枝。囊托楔形，菌絲形成厚垣孢子，接合孢子未見。發(fā)育溫度30～35℃，最適溫度37℃，41℃亦能生長。能糖化淀粉、轉(zhuǎn)化蔗糖，產(chǎn)生乳酸、反丁烯二酸及微量酒精。產(chǎn)L(+)乳酸能力強(qiáng)，達(dá)70%左右。

米根霉發(fā)酵

米根霉(Rhizopusoryzae)是中國藥和酒曲發(fā)酵總應(yīng)式為：

2C6H12O6

→3CH3CHOHCOOH+C2H5OH+CO2

由2個葡萄糖分子產(chǎn)生3個乳酸分子(理論轉(zhuǎn)化率75%)缺點:好氧發(fā)酵,能耗大;傳遞限制,反應(yīng)效率低;轉(zhuǎn)化率低,雜酸難去除.優(yōu)點:有淀粉酶,能直接利用淀粉;培養(yǎng)基簡單,無機(jī)氮;單一的光學(xué)異構(gòu)體,L-乳酸.發(fā)酵總應(yīng)式為：2C6H12O6→3CH3CHOHCOOGLU：葡萄糖，PYR：丙酮酸，LAC：乳酸，MAL：蘋果酸，F(xiàn)UM：富馬酸，Ac-COA：乙酰輔酶ATCA：三羧酸循環(huán)，EMP：糖酵解途徑，a：乳酸脫氫酶，b：丙酮酸脫氫酶、乙醇脫氫酶，c：丙酮酸脫氫酶，d：丙酮酸激酶GLU：葡萄糖，PYR：丙酮酸，LAC：乳酸，MAL：蘋果酸固定化米根霉生產(chǎn)L-乳酸*-微生物學(xué)通報，1996.03，白姝，天津大學(xué)生物技術(shù)中心利用聚氨酯泡沫為載體固定化米根霉生產(chǎn)Ｌ－乳酸的新工藝。確定了固定化細(xì)胞發(fā)酵條件：葡萄糖濃度為50g／l，載體立方體邊長為４～８mm，載體量為20cm３／70ml培養(yǎng)基，固定化細(xì)胞制備培養(yǎng)時間為24ｈ．利用固定化細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酸速率是游離菌的３倍以上，對糖轉(zhuǎn)化率達(dá)77.70％，與理論轉(zhuǎn)化率相近。該固定化細(xì)胞應(yīng)用在反復(fù)間歇發(fā)酵中可穩(wěn)定10批次以上。固定化米根霉生產(chǎn)L-乳酸*-微生物學(xué)通報，1996.03，白

2.菌種選育--優(yōu)良菌種選育為工藝技術(shù)的核心

①自然選育—自然界是生產(chǎn)菌種的最大來源,從自然界中篩選乳酸生產(chǎn)菌種有著悠久的歷史.

Berry,1999;王軼雄,2005;李海軍,2007.培養(yǎng)條件對鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)產(chǎn)生乳酸的影響.

Carlson,1999.從玉米浸漬水分到耐酸(pH3.83)菌41號,產(chǎn)乳酸近100g/L.

Payot,1999.分離到能在52℃生長的TB/04.趙博,2005.篩選到在2L罐用葡萄糖發(fā)酵120h使L-乳酸濃度達(dá)到202g/L的高產(chǎn)乳桿菌,轉(zhuǎn)化率91.3%,L-乳酸占總酸的98%.

2.菌種選育--優(yōu)良菌種選育為工藝技術(shù)的核心

②菌種改良—經(jīng)典技術(shù)

Demirci,1992.處理德氏乳桿菌ATCC9649;

劉勇軍,2003.LB1;

鄭艷,2004.處理干酪乳桿菌R2;

Kadam,2006.德氏乳桿菌NCM2365;

仇俊鵬,2007.嗜熱乳桿菌ATCC8317.

菌種改良—現(xiàn)代技術(shù)

Picataggio,1997.把植物乳桿菌中能同化木質(zhì)纖維素構(gòu)造中木糖組分所需的木糖異構(gòu)酶和木酮糖激酶基因轉(zhuǎn)入能同型發(fā)酵L-阿拉伯糖和D-核糖為乳酸的一株乳桿菌中.②菌種改良—經(jīng)典技術(shù)Kyla-Nikkila,2000.瑞士乳桿菌CNRZ32的ldhD基因失活,構(gòu)建沒有D-LDH酶活力的工程菌,結(jié)果只產(chǎn)生單一L構(gòu)型的L-乳酸.

Dien,2001.構(gòu)建了能利用混合己糖和戊糖生產(chǎn)L-乳酸的重組大腸桿菌.Parro,1999.把牛的L-LDH的基因引入乳酸克魯維酵母中,工程酵母轉(zhuǎn)化率為1.19mol乳酸/mol削耗的葡萄糖.張黎,2005.克隆了牛鏈球菌L-LDH基因.Kyla-Nikkila,2000.瑞士乳桿菌C3.主要生產(chǎn)原料乳酸發(fā)酵是生長和發(fā)酵同步進(jìn)行的生長耦聯(lián)型,整個發(fā)酵過程貫穿著對營養(yǎng)物的要求,故氮源需求量大。以淀粉為主的培養(yǎng)基,氮源舉足輕重。

①未加工的粗原料

—玉米、木薯、大米;--非糧薯類:木薯、甘薯、馬鈴薯;--桔桿、玉米芯、廢舊報紙、木屑、乳清。

②淀粉—玉米、木薯、馬鈴薯的淀粉

③糖液—淀粉水解糖,優(yōu)點為發(fā)酵液潔凈,發(fā)酵結(jié)束后殘余物質(zhì)少,十分有利于乳酸的提取與精制.3.主要生產(chǎn)原料

4.營養(yǎng)物

乳酸細(xì)菌—專性異養(yǎng)微生物,自身不能合成必需的生長因子。含氮營養(yǎng)物常用酵母膏、蛋白胨等;酵母膏替代物是玉米漿;蛋白胨替代物是大豆粉的酶水解物—大豆蛋白胨。

5.乳酸發(fā)酵的常用工藝

①分批發(fā)酵工藝是目前或相當(dāng)一段時間內(nèi)發(fā)酵乳酸的最主要工藝.在歐洲一直使用分批發(fā)酵工藝生產(chǎn)乳酸;在美國已使用了60年之久;在國內(nèi)一直采用這一工藝。

細(xì)菌發(fā)酵工藝國內(nèi)均采用德氏乳桿菌生產(chǎn)DL-乳酸,其優(yōu)點是能大規(guī)模降低能耗。5.乳酸發(fā)酵的常用工藝玉米淀粉→高壓噴射液化與糖化,糖化液→板框過濾,清糖液→發(fā)酵罐→調(diào)糖10%,添10%米糠,冷至50℃→接種,接種量為10%→4h后,用石灰粉調(diào)pH4.8→加碳酸鈣,繼續(xù)發(fā)酵→整個過程控溫50℃,pH4.-5.5,每2h攪拌一次,每次5-10min→發(fā)酵周期55-75h,轉(zhuǎn)化率不低于90%.玉米淀粉→高壓噴射液化與糖化,糖化液→板框過濾,清糖液→發(fā)酵混合菌種工藝

大麥粉濃度180g/L,大麥芽0.8%(培養(yǎng)基不添加任何氮源、維生素和無機(jī)鹽等營養(yǎng))

→接種食淀粉乳桿菌和不產(chǎn)生淀粉酶的干酪乳桿菌混合發(fā)酵→37℃48h→乳酸濃度達(dá)36g/L,比單獨提高20%.若發(fā)酵的同時加入糖化酶,轉(zhuǎn)化率可提高1倍左右?；旌暇N工藝米根霉工藝

米根霉能把葡萄糖轉(zhuǎn)化為乳酸,亦能把淀粉轉(zhuǎn)化為乳酸。乳酸發(fā)酵的效率受菌絲體形狀的影響很大,近來,采用菌絲菌球體(pellets)進(jìn)行生產(chǎn),菌球體可反復(fù)使用;采用氣升式發(fā)酵罐。一個發(fā)酵周期結(jié)束,停止通氣,菌球體即沉淀,放掉發(fā)酵液,并加入新鮮培養(yǎng)基,即可進(jìn)行第二輪發(fā)酵.可連續(xù)進(jìn)行9個周期。米根霉工藝

②連續(xù)發(fā)酵工藝

連續(xù)攪拌罐反應(yīng)器;葡萄糖;德氏乳桿菌。在稀釋率D為0.35-0.4h-1,最大乳酸產(chǎn)率為8.93g/(L?h),最大生物量產(chǎn)率為1.40g/(L?h).

③半連續(xù)發(fā)酵工藝

分割出一部分發(fā)酵液作為下一批發(fā)酵的種子.在一定次數(shù)的周期中,接種量越大產(chǎn)率越高.40%-50%接種量,及5-9次發(fā)酵周期,乳酸的產(chǎn)率可達(dá)5g/(L?h).②連續(xù)發(fā)酵工藝6.工藝控制

①中和劑選擇和pH控制

pH宜取的范圍為5-7(降到4.5以下,細(xì)菌停止生長).目前,所用的中和劑主要是碳酸鈣,其次有液氨、氫氧化鈉、氧化鈣等。

乳酸鈣和硫酸進(jìn)行酸解反應(yīng),得到粗乳酸.這是最常用最經(jīng)濟(jì)的方法,缺點是生成大量硫酸鈣.

乳酸銨或乳酸鈉經(jīng)微濾膜過濾,再經(jīng)電滲析,離交樹脂和雙極電滲析膜分離出乳酸,缺點是生產(chǎn)成本高(電和膜)。6.工藝控制②發(fā)酵溫度控制

不同菌種發(fā)酵溫度不同.分常溫(35-37℃),中溫(40-45℃),高溫(大于50℃).選擇高溫發(fā)酵有利于降低能耗和在一定程度上降低雜菌污染.③通氣和攪拌

微氧乳酸發(fā)酵需少量通氣和攪拌,一定保證發(fā)酵罐內(nèi)菌體、物料、溫度、

pH、溶解氧的均勻分布.②發(fā)酵溫度控制④初糖濃度

在菌種能力范圍內(nèi),初糖濃度越高,產(chǎn)酸越高;補(bǔ)糖;SSF。⑤菌體生長的控制—生長耦聯(lián)型,邊生長邊產(chǎn)酸.把生長控制在合適的范圍內(nèi),有利于維持高產(chǎn)酸速率時間。④初糖濃度三.乳酸發(fā)酵的新工藝1.電滲析發(fā)酵法工藝（乳酸根被陽極吸引）電滲析發(fā)酵(electrodialysisfermentation,EDF)系統(tǒng):主要有發(fā)酵罐、電滲析裝置、pH控制裝置、直流電源、微孔過濾裝置、濃縮液儲存罐、循環(huán)泵等組成.發(fā)酵與電滲析分離耦合的工藝,優(yōu)點是:

⑴在線分離,有效消除產(chǎn)物抑制;⑵避免添加中和劑,使精制容易,縮短了發(fā)酵周期;⑶無污染,過程簡單,消耗工業(yè)原料少,易于實現(xiàn)自動化連續(xù)操作。三.乳酸發(fā)酵的新工藝1.電滲析發(fā)酵法工藝（乳酸根被陽極吸引）2.萃取發(fā)酵法是根據(jù)一種溶質(zhì)在兩種互不相溶的液相溶劑中的溶解度不同而進(jìn)行的分離方法。乳酸萃取發(fā)酵是利用有機(jī)溶劑（叔胺Alamine336和油醇混合物）在線連續(xù)移去發(fā)酵產(chǎn)物乳酸,以達(dá)到降低乳酸抑制作用的目的技術(shù)。萃取發(fā)酵能耗低,選擇性好。3.膜循環(huán)發(fā)酵法(membrancerecyclefermentation,MRF)工藝這是一種連續(xù)發(fā)酵工藝.把連續(xù)攪拌罐反應(yīng)器與細(xì)胞循環(huán)膜組件相耦合.通過膜組件除去發(fā)酵液中的乳酸,消除產(chǎn)物的抑制作用,提高乳酸產(chǎn)率.2.萃取發(fā)酵法

4.同時糖化發(fā)酵工藝同時糖化發(fā)酵(simultaneoussaccharificationfermentation,SSF)工藝簡化了單獨用糖化酶糖化淀粉的工序,把糖化與乳酸發(fā)酵結(jié)合起來,在液化后加糖化酶的同時就進(jìn)行乳酸發(fā)酵,從而節(jié)省整個工藝時間,節(jié)約了設(shè)備投資,降低了運(yùn)行成本。另一好處是避免了初糖濃度過高造成的對發(fā)酵的抑制作用。SSF還常用于廉價的纖維素原料。

米根霉、食淀粉乳桿菌本身產(chǎn)生糖化酶,能同時糖化發(fā)酵生產(chǎn)乳酸。4.同時糖化發(fā)酵工藝四.基因工程技術(shù)在改造菌株生產(chǎn)D-乳酸中

的研究進(jìn)展

隨著基因工程理論的不斷成熟發(fā)展，分子生物學(xué)技術(shù)在D一乳酸生產(chǎn)領(lǐng)域的應(yīng)用也逐漸受到關(guān)注，利用基因工程手段對菌株進(jìn)行定向改造，減少了工程菌篩選的時間，提高了篩選效率。目前研究的重點主要集中在乳酸生產(chǎn)菌的D-乳酸脫氫酶和L-乳酸脫氫酶的編碼基因(ldhD和ldhL)上。另外還有研究人員對丙酮酸甲酸裂解酶的編碼基因(pfl)和丙酮酸脫羧酶基因(pdc)進(jìn)行敲除，從而提高乳酸支路的通量。四.基因工程技術(shù)在改造菌株生產(chǎn)D-乳酸中

的研究進(jìn)展

應(yīng)用基因敲除技術(shù)敲除旁路代謝途徑中的關(guān)鍵酶基因，能夠有效地抑制副產(chǎn)物的出現(xiàn)，提高乳酸支路的通量，同時敲除ldhL，最終能夠得到高光學(xué)純度的D-乳酸工程菌。進(jìn)一步在基因敲除的基礎(chǔ)上，通過導(dǎo)入外源性基因，使菌株的生產(chǎn)原料由葡萄糖和果糖等單糖原料逐步向淀粉和纖維素等多糖原料轉(zhuǎn)變。當(dāng)前基因工程改造菌株產(chǎn)D一乳酸主要集中在乳酸菌、大腸桿菌、酵母菌中。應(yīng)用基因敲除技術(shù)敲除旁路代謝途徑中的關(guān)鍵酶基因4.1乳酸菌(Lactobacillaceae)的基因工程改造

在乳酸菌中，大部分丙酮酸都在乳酸脫氫酶的催化下形成其特有的代謝終產(chǎn)物—乳酸。但是，不同的乳酸菌在不同的外界條件下，還會把一部分丙酮酸作為新的起點，通過不同的生化反應(yīng)途徑產(chǎn)生各種代謝產(chǎn)物。通過對非主要代謝通路中關(guān)鍵酶基因的敲除，實現(xiàn)高光學(xué)純度D一乳酸的生產(chǎn)。植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)通過異構(gòu)酶L-(+)-乳酸脫氫酶和D-(-)-乳酸脫氫酶來催化丙酮酸分別生成L-乳酸和D-乳酸。

ThierryF等對LplantarumDG30進(jìn)行基因改造，首先過表達(dá)菌株中l(wèi)dhL，使L．plantarum中L-(+)乳酸脫氫酶的活性增長了13倍，但是這種方法并沒有使L.plantarum的乳酸產(chǎn)量帶來明顯提高。接著在此基礎(chǔ)上通過雙交換的方法敲除了ldhL，使得L．plantarum只產(chǎn)生D-乳酸，但最終的乳酸產(chǎn)量也沒有顯著提高。4.1乳酸菌(Lactobacillaceae)的基因工程改

D-乳酸生產(chǎn)高成本一個主要的原因就是原材料成本高，原材料的預(yù)處理成為高效生產(chǎn)的一個瓶頸問題，目前淀粉是最有望成為乳酸發(fā)酵中降低原料成本的物質(zhì)。大多數(shù)乳酸菌不具有直接利用淀粉類物質(zhì)的能力，所以一般情況下需要把淀粉預(yù)處理，比如用α-淀粉酶水解淀粉。2009年Okano等敲除了L.plantarumNCIMB8826的ldhL，并將Streptococcusbovis148(AmyA)α-淀粉酶基因?qū)氲骄曛?，改造后的L．plantarum

ΔIdhLl／pCUSαA菌株D-乳酸產(chǎn)量達(dá)到73.2g／L，得率為0.85g(乳酸)／g(淀粉)，并且光學(xué)純度達(dá)99.6％。2009年Lu等以小麥麩皮為氮源、酵母提取物為生長因子，利用糖化后糙米作為碳源，生產(chǎn)D-乳酸，D-乳酸的產(chǎn)量達(dá)90．8g／L，得率達(dá)0．73g(乳酸)／g(糙米)。這些研究使得從淀粉生產(chǎn)高光學(xué)純度的D一乳酸變得可行。D-乳酸生產(chǎn)高成本一個主要的原因就是原材料成本

纖維素與淀粉同樣為多糖，而且纖維素在世界上含量最為豐富，充分利用纖維素作碳源，可以大大降低菌株產(chǎn)D-乳酸的原料成本，使D-乳酸的生產(chǎn)具有更高的商業(yè)價值。2007年前沒有利用纖維素為碳源生產(chǎn)乳酸的報道，而要使D-乳酸生產(chǎn)菌能夠利用纖維素作為碳源，可以利用的方法是通過基因工程導(dǎo)入外源基因并成功表達(dá)，構(gòu)建完成的工程菌利用外源酶水解纖維素的產(chǎn)物為底物來生產(chǎn)D-乳酸。纖維素與淀粉同樣為多糖，而且纖維素在世界上含

2009年Okano等將Clostridiumthermocellum菌株的葡聚糖內(nèi)切酶(EG)基因?qū)氲揭呀?jīng)敲除ldhL的L.plantarum中并表達(dá)，達(dá)到了直接利用纖維五糖和纖維六糖生產(chǎn)D-乳酸的目的。D-乳酸的得率達(dá)0．63g(乳酸)／g(纖維五碳糖或六碳糖)。在已構(gòu)建的菌株基礎(chǔ)上將Aspergillusaculeatus中的葡聚糖外切酶(BGL)基因?qū)?，改造后的菌株L.pantarumAldhLl／pCU—CelA能夠利用β-葡聚糖生產(chǎn)D-乳酸，產(chǎn)量達(dá)1.47g／L。上面的研究實現(xiàn)了工程菌直接利用纖維素生產(chǎn)D-乳酸的目標(biāo)。2009年Okano等將Clostridium

在植物組織中，除纖維素外還有大量的半纖維素，能利用這些物質(zhì)成為基因改造乳酸菌的目標(biāo)。半纖維素降解后，大部分物質(zhì)為木糖和阿拉伯糖，乳酸菌是不能直接利用木糖和阿拉伯糖作為碳源的，因此有研究將催化木糖到5-磷酸酮糖與阿拉伯糖到5-磷酸酮糖的基因?qū)氲侥軌蜻M(jìn)行同型發(fā)酵的乳酸菌中生成D-乳酸。采用這種方法，lmol的5-磷酸木酮糖通過磷酸轉(zhuǎn)酮酶途徑轉(zhuǎn)化為1mol的乳酸，造成了碳源的浪費。為了解決這一問題，Okano等用來自于L.lactis1L1403的轉(zhuǎn)酮酶基因(tkt)替換了L.plantarum1ldhLl中的磷酸轉(zhuǎn)酮酶基因(xpkl)，構(gòu)建的菌株L．plantarumΔldhLl一xpk11：：tkt能夠利用阿拉伯糖生產(chǎn)D-乳酸，D-乳酸的產(chǎn)量達(dá)38．6g／L，對阿拉伯糖的得率為0．82，D-乳酸的光學(xué)純度為99．9％，并且發(fā)酵過程中乙酸的產(chǎn)量僅為0．4g／L，這一研究解決了利用阿拉伯糖作碳源時的同型乳酸發(fā)酵的問題。在植物組織中，除纖維素外還有大量的半纖維素，能利用這

為了解決利用木糖同型發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸的問題，Okano等將來自于菌株L．pentosusNRIC1069的木糖異構(gòu)酶基因(xyU)和木酮糖激酶基因(xylB)導(dǎo)人L．plantarum

ΔldhLl-xok1：：tkt菌株中，改造后的菌株D-乳酸產(chǎn)量達(dá)41．2g／L，轉(zhuǎn)化率達(dá)0．89，D-乳酸的光學(xué)純度達(dá)99．2％，這一研究實現(xiàn)了以木糖為原料進(jìn)行同型乳酸的發(fā)酵生產(chǎn)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有些乳酸菌能夠利用寡聚木糖作為碳源，將降解寡聚木糖的關(guān)鍵酶基因?qū)胪桶l(fā)酵的乳酸菌株中，可能會實現(xiàn)利用半纖維素為原料進(jìn)行同型乳酸發(fā)酵的愿望。為了解決利用木糖同型發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸的問題，Okan4.2大腸桿菌(Escherichiacoli)的基因工程改造

大腸桿菌能夠以相對簡單的原料實現(xiàn)D-乳酸的生產(chǎn)，并且其作為基因工程模式菌株相對于其他菌株來說具有易實現(xiàn)基因操作的優(yōu)點。但大腸桿菌的乳酸產(chǎn)量以及終產(chǎn)物中乳酸的量都不及乳酸菌，原因就在于大腸桿菌在發(fā)酵生產(chǎn)乳酸的同時產(chǎn)生的是有機(jī)酸混合物以及乙醇等非酸類物質(zhì)。通過基因工程可以改造大腸桿菌的代謝網(wǎng)絡(luò)，增加乳酸途徑中的代謝通量，抑制大腸桿菌中其余產(chǎn)酸、醇途徑，達(dá)到提高乳酸產(chǎn)量之目的。4.2大腸桿菌(Escherichiacoli)的基因工

先前的研究已經(jīng)表明，可以通過改造E．coli來生產(chǎn)L-乳酸和D-乳酸。文獻(xiàn)報道產(chǎn)乳酸最好的大腸桿菌菌株為JP203碳基培養(yǎng)葡萄糖轉(zhuǎn)化率為70％～80％。

Zhou等敲除了E．coliW3110中延胡索酸還原酶(frdABCD)和丙酮酸甲基裂解酶的基因(pflB)，抑制了丙酮酸代謝途徑中除產(chǎn)乳酸代謝以外的途徑，構(gòu)建了一菌株SZ58，改造后的菌株D-乳酸的產(chǎn)量達(dá)51.8g/L，光學(xué)純度和得率分別達(dá)99％和0.99。為了進(jìn)一步降低乙醇和乙酸等副產(chǎn)物的生成，該研究在此基礎(chǔ)上失活了乙酸激酶基因(ackA)和乙醇脫氫酶基因(adhE)，構(gòu)建了一株產(chǎn)純D-乳酸的菌株SZ63。先前的研究已經(jīng)表明，可以通過改造E．coli來生改造后的菌株不但消除了乙醇和乙酸的合成，而且將菌株的發(fā)酵時間縮短到168h，D-乳酸的產(chǎn)量達(dá)46.8g／L。大腸桿菌可直接利用己糖和戊糖作為碳源，這就免去了后續(xù)為利用戊糖而進(jìn)行的菌株改造，但是菌株對酸的耐受性差，生產(chǎn)率較乳酸菌低，致使大腸桿菌在實際應(yīng)用當(dāng)中受到限制。改造后的菌株不但消除了乙醇和乙酸的合成，而且將菌株的發(fā)酵時間4.3酵母菌(Saccharomycescerevisiae)的基因工

程改造

酵母菌對酸有很好的耐受性，使得通過酵母菌發(fā)酵產(chǎn)生乳酸成為可能。在厭氧發(fā)酵條件下，酵母菌中的丙酮酸脫羧酶以及乙醇脫氫酶催化大量丙酮酸生成了乙醇，通過基因工程方法，抑制酵母菌生成乙醇的代謝途徑，增加乳酸途徑通量，同時敲除ldhL來使酵母菌發(fā)酵產(chǎn)高純度D-乳酸，從而達(dá)到酵母菌高產(chǎn)D-乳酸的目的。已有研究表明，在釀酒酵母中存在pdcl、pdc5和pdc63個丙酮酸羧化酶基因，這3個基因的存在使得大量的丙酮酸通過乙醇途徑生成乙醇，因此若要完全的阻斷乙醇的合成途徑，必須使得這3個基因完全失活。4.3酵母菌(SaccharomycescerevisiIshida等通過同源重組的方法在S．cerevisiaeOC-2T中用ldhL替換了pdcl（丙酮酸羧化酶基因），ldhL轉(zhuǎn)錄時的啟動子為原pdcl啟動子。改造后的菌株YIBO-7A的乳酸脫氫酶活性比出發(fā)菌株高出5倍，在非中性環(huán)境中乳酸產(chǎn)量達(dá)50.6g／L，得率達(dá)0.65g(乳酸)／g(葡萄糖)。為了增加乳酸的產(chǎn)量，Saitoh進(jìn)一步將4個拷貝的ldhL整合到Y(jié)IBO-7A的基因組中，獲得了多拷貝數(shù)的基因，使L-乳酸的產(chǎn)量提高到68.0g／L。Ishida等通過同源重組的方法在S．cerevis這一方法同樣被應(yīng)用到D-乳酸的生產(chǎn)中，Ishida等將牛的ldhD導(dǎo)入到OC-2T菌株的基因組中，D-乳酸的產(chǎn)量達(dá)61.5g／L。

Ishida等的研究表明，pdcl、pdc5的雙基因失活和pdcl、pdc5,pdc6三基因的失活可以降低或消除乳酸生產(chǎn)過程中乙醇的生產(chǎn)，但同時實驗數(shù)據(jù)表明，在降低乙醇產(chǎn)量的同時也降低了菌體的生長速率，延長了乳酸生產(chǎn)的發(fā)酵時間，降低了乳酸的生產(chǎn)效率。這一方法同樣被應(yīng)用到D-乳酸的生產(chǎn)中，Ishida等為了克服這一缺點，2009年Tokuhiro等通過對酵母菌中的丙酮酸脫羧酶基因和乙醛脫氫酶基因的敲除，抑制了發(fā)酵過程中乙醇的產(chǎn)生，D一乳酸的產(chǎn)量達(dá)71.8g/L，得率達(dá)0.74，并且生產(chǎn)乳酸的發(fā)酵時間降低到了63h，與丙酮酸脫羧酶結(jié)構(gòu)基因的雙敲除和三敲除菌株相比，進(jìn)一步提高了乳酸的生產(chǎn)效率。為了克服這一缺點，2009年Tokuhiro等通過對纖維素降解后所生成的寡聚糖中主要成分是纖維二糖，纖維二糖作為葡聚糖外切酶的抑制劑，其濃度的積累會抑制纖維素的降解，然而S．cerevisiae自身不能利用纖維二糖，因此，快速同化纖維二糖成為開發(fā)纖維素利用型酵母的首要問題。2008年，To—kuhiro在S．cerevisiae中表達(dá)了來自A．a(chǎn)culeatus的萄糖苷酶基因(BGLI)，重組后的菌株能夠利用纖維二糖生產(chǎn)乳酸，乳酸的產(chǎn)量達(dá)95g／L，得率達(dá)0.7，而且，以纖維二糖為原料的乳酸生產(chǎn)效率只是略低于以葡萄糖為原料的乳酸生產(chǎn)效率。在酵母中，乳酸得率的提高與菌體的生長不存在明顯的對應(yīng)關(guān)系，當(dāng)乳酸得率升高時菌體的生長受到了相應(yīng)的抑制，這導(dǎo)致了生產(chǎn)效率的降低，因此，如何解決這一問題成為酵母菌中乳酸研究的關(guān)鍵。纖維素降解后所生成的寡聚糖中主要成分是纖維二糖，纖維小結(jié)乳酸是一種多用途的精細(xì)化學(xué)品,可廣范應(yīng)用于食品、制藥、化工、制革、環(huán)保、紡織和農(nóng)業(yè)中,其產(chǎn)品主要表現(xiàn)形式為酸味劑、調(diào)味劑、防腐劑、鞣制劑、植物生長調(diào)節(jié)劑、生物可降解材料和手性藥物等。特別是近幾年科學(xué)發(fā)現(xiàn)用乳酸可生產(chǎn)聚乳酸,以聚乳酸為材料可進(jìn)一步生產(chǎn)生物可降解塑料,這就為乳酸生產(chǎn)的研究與開發(fā)展現(xiàn)了更廣闊的前景。小結(jié)乳酸是一種多用途的精細(xì)化學(xué)品,可廣范應(yīng)用于食品、目前，全世界的乳酸產(chǎn)量已超過20萬噸，其中90%采用微生物法生產(chǎn)。由于乳酸產(chǎn)品顯示出廣泛的應(yīng)用范圍和巨大的市場潛力，尤其在生物可降解材料方面所顯示的優(yōu)越功能，已引世界各國相關(guān)研究生產(chǎn)機(jī)構(gòu)和應(yīng)用單位的濃厚興趣，生產(chǎn)企業(yè)紛紛競向生產(chǎn)和擴(kuò)大產(chǎn)量。據(jù)保守估計，乳酸的年需求量在10年內(nèi)就會突破100萬噸。

目前，全世界的乳酸產(chǎn)量已超過20萬噸，其中90%采用微發(fā)酵法生產(chǎn)乳酸技術(shù)進(jìn)展

發(fā)酵法生產(chǎn)乳酸技術(shù)進(jìn)展

一.概述

乳酸發(fā)酵:指糖經(jīng)無氧酵解而生成乳酸的發(fā)酵(lacticfermentation，fermentationoflacticacid)。與乙醇發(fā)酵同為生物體內(nèi)二種主要的發(fā)酵形式。在動物組織中，除特殊的內(nèi)臟外，幾乎所有的組織都具有進(jìn)行這種發(fā)酵的性質(zhì)，此過程稱為糖酵解。乳酸細(xì)菌能利用葡萄糖及其他相應(yīng)的可發(fā)酵性糖產(chǎn)生乳酸，稱為乳酸發(fā)酵。

乳酸是重要的天然有機(jī)酸,一元羧基酸（-羥基丙酸）.存在于酸牛奶而得名，產(chǎn)、銷量僅次于檸檬酸。

一.概述乳酸發(fā)酵:指糖經(jīng)無氧酵解而生成乳酸的發(fā)酵1780年瑞士化學(xué)家Scheele首先從酸乳中提煉得到乳酸;1857年P(guān)asteur在研究乳酸發(fā)酵過程中發(fā)現(xiàn)了乳酸菌;1878年J.Lister從酸敗的牛乳中分離了乳酸菌,命名為乳桿菌;自然發(fā)酵乳酸是1941年由Boutron和Fremy發(fā)現(xiàn)的;純種發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)乳酸是1981由美國CharlesEaveyy開始,荷蘭的Purac公司和美國的ADM公司是世界上較大的乳酸生產(chǎn)企業(yè)。中國有數(shù)十年乳酸生產(chǎn)歷史,安徽豐源生化公司(2002年建立)最大,設(shè)計年產(chǎn)3萬噸。

1780年瑞士化學(xué)家Scheele首先從酸乳中提煉得到乳酸;1.乳酸的理化性質(zhì)

HCH3-C-COOHOH

分子式C3H6O3,分子量為90.08，結(jié)構(gòu)中含有不對稱碳原子，具有旋光性.分子帶有(-OH)和羧基(-COOH)兩個官能團(tuán),是自然界中存在最廣泛的一種羥基羧酸。粘稠狀液體，無色，澄明，微具黃色，無嗅，味微酸，有較強(qiáng)吸濕性，可以與水、酒精和乙醚以任意比例混合。1.乳酸的理化性質(zhì)乳酸經(jīng)氧化可形成丙酮酸、乙醛、乙酸和二氧化碳.乳酸可被還原為丙酸,丙二醇(不飽和聚酯、環(huán)氧樹脂、聚氨酯樹脂的重要原料)乳酸縮合反應(yīng)生成線性聚脂-聚乳酸.乳酸酯化反應(yīng)為乳酸酯.乳酸脫水生成丙烯酸(400萬噸市場容量/a,絮凝劑,分散劑,復(fù)膜劑,油漆,皮革、造紙、紡織粘合劑等生產(chǎn)的重要工業(yè)原料,1.5萬元/噸)乳酸經(jīng)氧化可形成丙酮酸、乙醛、乙酸和二氧化碳.

2.乳酸的用途

①作為終端產(chǎn)品

食品飲料：酸味劑、調(diào)味劑、防腐劑;

現(xiàn)代醫(yī)藥：乳酸亞鐵鐵質(zhì)食品添加劑，容易被人體吸收，治療缺鐵性貧血;

日用化工:生產(chǎn)染料,可降解材料等等;

制革:鞣革劑;

農(nóng)業(yè):植物生長調(diào)節(jié)劑.

2.乳酸的用途乳酸鏈球菌素（Nisin）*乳酸鏈球菌素是由乳酸鏈球菌產(chǎn)生的一種多肽抗菌素類物質(zhì)，由34個氨基酸組成。它是一種高效、無毒的天然食品防腐劑。室溫下、酸性加熱條件下均很穩(wěn)定。如在pH2.0/121℃加熱30分鐘，產(chǎn)品仍很穩(wěn)定。乳酸鏈球菌的抗菌譜比較窄，它只能殺死或抑制革蘭氏陽性菌，特別是細(xì)菌孢子，對陰性菌、酵母菌均無作用。一般10-50ppm即有效。ADI0-33000IU/Kg(bw)(FAO/WHO,1994)乳酸鏈球菌是多肽，食用后在消化道中很快被蛋白水解酶分解成氨基酸，不會改變腸道內(nèi)正常菌群，以及引起常用其他抗菌素所出現(xiàn)的抗藥性，更不會與其它抗菌素出現(xiàn)交叉抗性。

乳酸鏈球菌素（Nisin）*乳酸鏈球菌素是由乳酸鏈球菌產(chǎn)生的2.乳酸的用途②化學(xué)工業(yè)中重要的平臺原料制成乳酸鹽,乳酸酯;催化生成乙醛,丙二醇,丙稀酸,戊二醛等;更為重要的是用于合成生物能夠降解的新型環(huán)保材料—聚乳酸(PLA).2.乳酸的用途聚乳酸*單個的乳酸分子中有一個羥基和一個羧基，多個乳酸分子在一起，-OH與別的分子的-COOH脫水縮合，-COOH與別的分子的-OH脫水縮合，就這樣，它們手拉手形成了聚合物，叫做聚乳酸。聚乳酸也稱為聚丙交酯，屬于聚酯家族。聚乳酸是以乳酸為主要原料聚合得到的聚合物，原料來源充分而且可以再生。聚乳酸的生產(chǎn)過程無污染，而且產(chǎn)品可以生物降解，實現(xiàn)在自然界中的循環(huán)，因此是理想的綠色高分子材料。

聚乳酸*單個的乳酸分子中有一個羥基和一個羧基，多個乳酸分子在二.乳酸發(fā)酵的工藝及控制—乳酸發(fā)酵是乳酸生產(chǎn)的關(guān)鍵步驟

1.菌種及產(chǎn)酸機(jī)理—菌種為發(fā)酵的基本要素目前乳酸生產(chǎn)菌種為細(xì)菌(乳桿菌為代表,Lactobacilusdelbrackii（德氏乳桿菌))和霉菌(以米根霉為代表,Rhizopusoryzae)乳制品、葡萄酒、酸泡菜、醬醪、醋醅中都可分離到乳酸菌.

二.乳酸發(fā)酵的工藝及控制—乳酸發(fā)酵是乳酸生產(chǎn)的關(guān)鍵步驟

1.同型乳酸發(fā)酵細(xì)菌發(fā)酵—乳球菌(Lactococcus),鏈球菌(Streptococcus).片球菌(Pediococcus)及乳桿菌(Lactobacilus)的部分。同型乳酸發(fā)酵同型乳酸發(fā)酵乳酸細(xì)菌→EMP→由1個葡萄糖分子產(chǎn)生2個乳酸分子(理論轉(zhuǎn)化率100%)優(yōu)勢:純度高;轉(zhuǎn)化率高;能耗低(需無菌空氣和攪拌動力都很低)。缺點:需在培養(yǎng)基中添加有機(jī)氮源,這樣增加了生產(chǎn)成本和分離純化難度。同型乳酸發(fā)酵乳酸細(xì)菌→EMP→由1個葡萄糖分子產(chǎn)生2個乳酸同型乳酸發(fā)酵同型乳酸發(fā)酵異型乳酸發(fā)酵異型乳酸發(fā)酵異型乳酸發(fā)酵細(xì)菌發(fā)酵—腸膜明串株菌（Leuconostocmesenteroides）、葡聚糖明串珠菌（L.dextranicum）、雙歧桿菌（Bifidobacteriumbifidum）等異型乳酸發(fā)酵細(xì)菌發(fā)酵—腸膜明串株菌（Leuconostoc異型乳酸發(fā)酵6-磷酸葡萄糖酸的途徑（磷酸酮解途徑）:異型乳酸發(fā)酵6-磷酸葡萄糖酸的途徑（磷酸酮解途徑）:總反應(yīng)式:C6H12O6+ADP+Pi→

CH3CHOHCHOH+CH3COOH+CO2+ATP通過磷酸戊糖途徑（HMP）,1mol己糖生成1mol乙醇、lmol二氧化碳和1mol乳酸。乳酸對糖轉(zhuǎn)化率50％。總反應(yīng)式:C6H12O6+ADP+Pi→CH3C雙歧途徑（磷酸酮糖途徑）雙歧發(fā)酵是雙歧桿菌發(fā)酵葡萄糖的一條途徑。經(jīng)HK途徑—磷酸己糖解酮酶途徑。發(fā)酵總應(yīng)式為：2C6H12O6

→2CH3CHOHCOOH+3CH3COOH此發(fā)酵過程中，2mol的葡萄糖生成2mol乳酸和3mol的乙酸，乳酸轉(zhuǎn)化率理論為50%。雙歧途徑（磷酸酮糖途徑）

米根霉(Rhizopusoryzae)是中國藥和酒曲中的重要霉菌之一。在土壤、空氣及其他物質(zhì)上亦常見。菌落疏松或稠密，最初白色后變?yōu)榛液种梁诤稚?，匍匐枝爬行，無色。假根發(fā)達(dá)，指狀或根狀分枝。囊托楔形，菌絲形成厚垣孢子，接合孢子未見。發(fā)育溫度30～35℃，最適溫度37℃，41℃亦能生長。能糖化淀粉、轉(zhuǎn)化蔗糖，產(chǎn)生乳酸、反丁烯二酸及微量酒精。產(chǎn)L(+)乳酸能力強(qiáng)，達(dá)70%左右。

米根霉發(fā)酵

米根霉(Rhizopusoryzae)是中國藥和酒曲發(fā)酵總應(yīng)式為：

2C6H12O6

→3CH3CHOHCOOH+C2H5OH+CO2

由2個葡萄糖分子產(chǎn)生3個乳酸分子(理論轉(zhuǎn)化率75%)缺點:好氧發(fā)酵,能耗大;傳遞限制,反應(yīng)效率低;轉(zhuǎn)化率低,雜酸難去除.優(yōu)點:有淀粉酶,能直接利用淀粉;培養(yǎng)基簡單,無機(jī)氮;單一的光學(xué)異構(gòu)體,L-乳酸.發(fā)酵總應(yīng)式為：2C6H12O6→3CH3CHOHCOOGLU：葡萄糖，PYR：丙酮酸，LAC：乳酸，MAL：蘋果酸，F(xiàn)UM：富馬酸，Ac-COA：乙酰輔酶ATCA：三羧酸循環(huán)，EMP：糖酵解途徑，a：乳酸脫氫酶，b：丙酮酸脫氫酶、乙醇脫氫酶，c：丙酮酸脫氫酶，d：丙酮酸激酶GLU：葡萄糖，PYR：丙酮酸，LAC：乳酸，MAL：蘋果酸固定化米根霉生產(chǎn)L-乳酸*-微生物學(xué)通報，1996.03，白姝，天津大學(xué)生物技術(shù)中心利用聚氨酯泡沫為載體固定化米根霉生產(chǎn)Ｌ－乳酸的新工藝。確定了固定化細(xì)胞發(fā)酵條件：葡萄糖濃度為50g／l，載體立方體邊長為４～８mm，載體量為20cm３／70ml培養(yǎng)基，固定化細(xì)胞制備培養(yǎng)時間為24ｈ．利用固定化細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酸速率是游離菌的３倍以上，對糖轉(zhuǎn)化率達(dá)77.70％，與理論轉(zhuǎn)化率相近。該固定化細(xì)胞應(yīng)用在反復(fù)間歇發(fā)酵中可穩(wěn)定10批次以上。固定化米根霉生產(chǎn)L-乳酸*-微生物學(xué)通報，1996.03，白

2.菌種選育--優(yōu)良菌種選育為工藝技術(shù)的核心

①自然選育—自然界是生產(chǎn)菌種的最大來源,從自然界中篩選乳酸生產(chǎn)菌種有著悠久的歷史.

Berry,1999;王軼雄,2005;李海軍,2007.培養(yǎng)條件對鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)產(chǎn)生乳酸的影響.

Carlson,1999.從玉米浸漬水分到耐酸(pH3.83)菌41號,產(chǎn)乳酸近100g/L.

Payot,1999.分離到能在52℃生長的TB/04.趙博,2005.篩選到在2L罐用葡萄糖發(fā)酵120h使L-乳酸濃度達(dá)到202g/L的高產(chǎn)乳桿菌,轉(zhuǎn)化率91.3%,L-乳酸占總酸的98%.

2.菌種選育--優(yōu)良菌種選育為工藝技術(shù)的核心

②菌種改良—經(jīng)典技術(shù)

Demirci,1992.處理德氏乳桿菌ATCC9649;

劉勇軍,2003.LB1;

鄭艷,2004.處理干酪乳桿菌R2;

Kadam,2006.德氏乳桿菌NCM2365;

仇俊鵬,2007.嗜熱乳桿菌ATCC8317.

菌種改良—現(xiàn)代技術(shù)

Picataggio,1997.把植物乳桿菌中能同化木質(zhì)纖維素構(gòu)造中木糖組分所需的木糖異構(gòu)酶和木酮糖激酶基因轉(zhuǎn)入能同型發(fā)酵L-阿拉伯糖和D-核糖為乳酸的一株乳桿菌中.②菌種改良—經(jīng)典技術(shù)Kyla-Nikkila,2000.瑞士乳桿菌CNRZ32的ldhD基因失活,構(gòu)建沒有D-LDH酶活力的工程菌,結(jié)果只產(chǎn)生單一L構(gòu)型的L-乳酸.

Dien,2001.構(gòu)建了能利用混合己糖和戊糖生產(chǎn)L-乳酸的重組大腸桿菌.Parro,1999.把牛的L-LDH的基因引入乳酸克魯維酵母中,工程酵母轉(zhuǎn)化率為1.19mol乳酸/mol削耗的葡萄糖.張黎,2005.克隆了牛鏈球菌L-LDH基因.Kyla-Nikkila,2000.瑞士乳桿菌C3.主要生產(chǎn)原料乳酸發(fā)酵是生長和發(fā)酵同步進(jìn)行的生長耦聯(lián)型,整個發(fā)酵過程貫穿著對營養(yǎng)物的要求,故氮源需求量大。以淀粉為主的培養(yǎng)基,氮源舉足輕重。

①未加工的粗原料

—玉米、木薯、大米;--非糧薯類:木薯、甘薯、馬鈴薯;--桔桿、玉米芯、廢舊報紙、木屑、乳清。

②淀粉—玉米、木薯、馬鈴薯的淀粉

③糖液—淀粉水解糖,優(yōu)點為發(fā)酵液潔凈,發(fā)酵結(jié)束后殘余物質(zhì)少,十分有利于乳酸的提取與精制.3.主要生產(chǎn)原料

4.營養(yǎng)物

乳酸細(xì)菌—專性異養(yǎng)微生物,自身不能合成必需的生長因子。含氮營養(yǎng)物常用酵母膏、蛋白胨等;酵母膏替代物是玉米漿;蛋白胨替代物是大豆粉的酶水解物—大豆蛋白胨。

5.乳酸發(fā)酵的常用工藝

①分批發(fā)酵工藝是目前或相當(dāng)一段時間內(nèi)發(fā)酵乳酸的最主要工藝.在歐洲一直使用分批發(fā)酵工藝生產(chǎn)乳酸;在美國已使用了60年之久;在國內(nèi)一直采用這一工藝。

細(xì)菌發(fā)酵工藝國內(nèi)均采用德氏乳桿菌生產(chǎn)DL-乳酸,其優(yōu)點是能大規(guī)模降低能耗。5.乳酸發(fā)酵的常用工藝玉米淀粉→高壓噴射液化與糖化,糖化液→板框過濾,清糖液→發(fā)酵罐→調(diào)糖10%,添10%米糠,冷至50℃→接種,接種量為10%→4h后,用石灰粉調(diào)pH4.8→加碳酸鈣,繼續(xù)發(fā)酵→整個過程控溫50℃,pH4.-5.5,每2h攪拌一次,每次5-10min→發(fā)酵周期55-75h,轉(zhuǎn)化率不低于90%.玉米淀粉→高壓噴射液化與糖化,糖化液→板框過濾,清糖液→發(fā)酵混合菌種工藝

大麥粉濃度180g/L,大麥芽0.8%(培養(yǎng)基不添加任何氮源、維生素和無機(jī)鹽等營養(yǎng))

→接種食淀粉乳桿菌和不產(chǎn)生淀粉酶的干酪乳桿菌混合發(fā)酵→37℃48h→乳酸濃度達(dá)36g/L,比單獨提高20%.若發(fā)酵的同時加入糖化酶,轉(zhuǎn)化率可提高1倍左右?；旌暇N工藝米根霉工藝

米根霉能把葡萄糖轉(zhuǎn)化為乳酸,亦能把淀粉轉(zhuǎn)化為乳酸。乳酸發(fā)酵的效率受菌絲體形狀的影響很大,近來,采用菌絲菌球體(pellets)進(jìn)行生產(chǎn),菌球體可反復(fù)使用;采用氣升式發(fā)酵罐。一個發(fā)酵周期結(jié)束,停止通氣,菌球體即沉淀,放掉發(fā)酵液,并加入新鮮培養(yǎng)基,即可進(jìn)行第二輪發(fā)酵.可連續(xù)進(jìn)行9個周期。米根霉工藝

②連續(xù)發(fā)酵工藝

連續(xù)攪拌罐反應(yīng)器;葡萄糖;德氏乳桿菌。在稀釋率D為0.35-0.4h-1,最大乳酸產(chǎn)率為8.93g/(L?h),最大生物量產(chǎn)率為1.40g/(L?h).

③半連續(xù)發(fā)酵工藝

分割出一部分發(fā)酵液作為下一批發(fā)酵的種子.在一定次數(shù)的周期中,接種量越大產(chǎn)率越高.40%-50%接種量,及5-9次發(fā)酵周期,乳酸的產(chǎn)率可達(dá)5g/(L?h).②連續(xù)發(fā)酵工藝6.工藝控制

①中和劑選擇和pH控制

pH宜取的范圍為5-7(降到4.5以下,細(xì)菌停止生長).目前,所用的中和劑主要是碳酸鈣,其次有液氨、氫氧化鈉、氧化鈣等。

乳酸鈣和硫酸進(jìn)行酸解反應(yīng),得到粗乳酸.這是最常用最經(jīng)濟(jì)的方法,缺點是生成大量硫酸鈣.

乳酸銨或乳酸鈉經(jīng)微濾膜過濾,再經(jīng)電滲析,離交樹脂和雙極電滲析膜分離出乳酸,缺點是生產(chǎn)成本高(電和膜)。6.工藝控制②發(fā)酵溫度控制

不同菌種發(fā)酵溫度不同.分常溫(35-37℃),中溫(40-45℃),高溫(大于50℃).選擇高溫發(fā)酵有利于降低能耗和在一定程度上降低雜菌污染.③通氣和攪拌

微氧乳酸發(fā)酵需少量通氣和攪拌,一定保證發(fā)酵罐內(nèi)菌體、物料、溫度、

pH、溶解氧的均勻分布.②發(fā)酵溫度控制④初糖濃度

在菌種能力范圍內(nèi),初糖濃度越高,產(chǎn)酸越高;補(bǔ)糖;SSF。⑤菌體生長的控制—生長耦聯(lián)型,邊生長邊產(chǎn)酸.把生長控制在合適的范圍內(nèi),有利于維持高產(chǎn)酸速率時間。④初糖濃度三.乳酸發(fā)酵的新工藝1.電滲析發(fā)酵法工藝（乳酸根被陽極吸引）電滲析發(fā)酵(electrodialysisfermentation,EDF)系統(tǒng):主要有發(fā)酵罐、電滲析裝置、pH控制裝置、直流電源、微孔過濾裝置、濃縮液儲存罐、循環(huán)泵等組成.發(fā)酵與電滲析分離耦合的工藝,優(yōu)點是:

⑴在線分離,有效消除產(chǎn)物抑制;⑵避免添加中和劑,使精制容易,縮短了發(fā)酵周期;⑶無污染,過程簡單,消耗工業(yè)原料少,易于實現(xiàn)自動化連續(xù)操作。三.乳酸發(fā)酵的新工藝1.電滲析發(fā)酵法工藝（乳酸根被陽極吸引）2.萃取發(fā)酵法是根據(jù)一種溶質(zhì)在兩種互不相溶的液相溶劑中的溶解度不同而進(jìn)行的分離方法。乳酸萃取發(fā)酵是利用有機(jī)溶劑（叔胺Alamine336和油醇混合物）在線連續(xù)移去發(fā)酵產(chǎn)物乳酸,以達(dá)到降低乳酸抑制作用的目的技術(shù)。萃取發(fā)酵能耗低,選擇性好。3.膜循環(huán)發(fā)酵法(membrancerecyclefermentation,MRF)工藝這是一種連續(xù)發(fā)酵工藝.把連續(xù)攪拌罐反應(yīng)器與細(xì)胞循環(huán)膜組件相耦合.通過膜組件除去發(fā)酵液中的乳酸,消除產(chǎn)物的抑制作用,提高乳酸產(chǎn)率.2.萃取發(fā)酵法

4.同時糖化發(fā)酵工藝同時糖化發(fā)酵(simultaneoussaccharificationfermentation,SSF)工藝簡化了單獨用糖化酶糖化淀粉的工序,把糖化與乳酸發(fā)酵結(jié)合起來,在液化后加糖化酶的同時就進(jìn)行乳酸發(fā)酵,從而節(jié)省整個工藝時間,節(jié)約了設(shè)備投資,降低了運(yùn)行成本。另一好處是避免了初糖濃度過高造成的對發(fā)酵的抑制作用。SSF還常用于廉價的纖維素原料。

米根霉、食淀粉乳桿菌本身產(chǎn)生糖化酶,能同時糖化發(fā)酵生產(chǎn)乳酸。4.同時糖化發(fā)酵工藝四.基因工程技術(shù)在改造菌株生產(chǎn)D-乳酸中

的研究進(jìn)展

隨著基因工程理論的不斷成熟發(fā)展，分子生物學(xué)技術(shù)在D一乳酸生產(chǎn)領(lǐng)域的應(yīng)用也逐漸受到關(guān)注，利用基因工程手段對菌株進(jìn)行定向改造，減少了工程菌篩選的時間，提高了篩選效率。目前研究的重點主要集中在乳酸生產(chǎn)菌的D-乳酸脫氫酶和L-乳酸脫氫酶的編碼基因(ldhD和ldhL)上。另外還有研究人員對丙酮酸甲酸裂解酶的編碼基因(pfl)和丙酮酸脫羧酶基因(pdc)進(jìn)行敲除，從而提高乳酸支路的通量。四.基因工程技術(shù)在改造菌株生產(chǎn)D-乳酸中

的研究進(jìn)展

應(yīng)用基因敲除技術(shù)敲除旁路代謝途徑中的關(guān)鍵酶基因，能夠有效地抑制副產(chǎn)物的出現(xiàn)，提高乳酸支路的通量，同時敲除ldhL，最終能夠得到高光學(xué)純度的D-乳酸工程菌。進(jìn)一步在基因敲除的基礎(chǔ)上，通過導(dǎo)入外源性基因，使菌株的生產(chǎn)原料由葡萄糖和果糖等單糖原料逐步向淀粉和纖維素等多糖原料轉(zhuǎn)變。當(dāng)前基因工程改造菌株產(chǎn)D一乳酸主要集中在乳酸菌、大腸桿菌、酵母菌中。應(yīng)用基因敲除技術(shù)敲除旁路代謝途徑中的關(guān)鍵酶基因4.1乳酸菌(Lactobacillaceae)的基因工程改造

在乳酸菌中，大部分丙酮酸都在乳酸脫氫酶的催化下形成其特有的代謝終產(chǎn)物—乳酸。但是，不同的乳酸菌在不同的外界條件下，還會把一部分丙酮酸作為新的起點，通過不同的生化反應(yīng)途徑產(chǎn)生各種代謝產(chǎn)物。通過對非主要代謝通路中關(guān)鍵酶基因的敲除，實現(xiàn)高光學(xué)純度D一乳酸的生產(chǎn)。植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)通過異構(gòu)酶L-(+)-乳酸脫氫酶和D-(-)-乳酸脫氫酶來催化丙酮酸分別生成L-乳酸和D-乳酸。

ThierryF等對LplantarumDG30進(jìn)行基因改造，首先過表達(dá)菌株中l(wèi)dhL，使L．plantarum中L-(+)乳酸脫氫酶的活性增長了13倍，但是這種方法并沒有使L.plantarum的乳酸產(chǎn)量帶來明顯提高。接著在此基礎(chǔ)上通過雙交換的方法敲除了ldhL，使得L．plantarum只產(chǎn)生D-乳酸，但最終的乳酸產(chǎn)量也沒有顯著提高。4.1乳酸菌(Lactobacillaceae)的基因工程改

D-乳酸生產(chǎn)高成本一個主要的原因就是原材料成本高，原材料的預(yù)處理成為高效生產(chǎn)的一個瓶頸問題，目前淀粉是最有望成為乳酸發(fā)酵中降低原料成本的物質(zhì)。大多數(shù)乳酸菌不具有直接利用淀粉類物質(zhì)的能力，所以一般情況下需要把淀粉預(yù)處理，比如用α-淀粉酶水解淀粉。2009年Okano等敲除了L.plantarumNCIMB8826的ldhL，并將Streptococcusbovis148(AmyA)α-淀粉酶基因?qū)氲骄曛?，改造后的L．plantarum

ΔIdhLl／pCUSαA菌株D-乳酸產(chǎn)量達(dá)到73.2g／L，得率為0.85g(乳酸)／g(淀粉)，并且光學(xué)純度達(dá)99.6％。2009年Lu等以小麥麩皮為氮源、酵母提取物為生長因子，利用糖化后糙米作為碳源，生產(chǎn)D-乳酸，D-乳酸的產(chǎn)量達(dá)90．8g／L，得率達(dá)0．73g(乳酸)／g(糙米)。這些研究使得從淀粉生產(chǎn)高光學(xué)純度的D一乳酸變得可行。D-乳酸生產(chǎn)高成本一個主要的原因就是原材料成本

纖維素與淀粉同樣為多糖，而且纖維素在世界上含量最為豐富，充分利用纖維素作碳源，可以大大降低菌株產(chǎn)D-乳酸的原料成本，使D-乳酸的生產(chǎn)具有更高的商業(yè)價值。2007年前沒有利用纖維素為碳源生產(chǎn)乳酸的報道，而要使D-乳酸生產(chǎn)菌能夠利用纖維素作為碳源，可以利用的方法是通過基因工程導(dǎo)入外源基因并成功表達(dá)，構(gòu)建完成的工程菌利用外源酶水解纖維素的產(chǎn)物為底物來生產(chǎn)D-乳酸。纖維素與淀粉同樣為多糖，而且纖維素在世界上含

2009年Okano等將Clostridiumthermocellum菌株的葡聚糖內(nèi)切酶(EG)基因?qū)氲揭呀?jīng)敲除ldhL的L.plantarum中并表達(dá)，達(dá)到了直接利用纖維五糖和纖維六糖生產(chǎn)D-乳酸的目的。D-乳酸的得率達(dá)0．63g(乳酸)／g(纖維五碳糖或六碳糖)。在已構(gòu)建的菌株基礎(chǔ)上將Aspergillusaculeatus中的葡聚糖外切酶(BGL)基因?qū)?，改造后的菌株L.pantarumAldhLl／pCU—CelA能夠利用β-葡聚糖生產(chǎn)D-乳酸，產(chǎn)量達(dá)1.47g／L。上面的研究實現(xiàn)了工程菌直接利用纖維素生產(chǎn)D-乳酸的目標(biāo)。2009年Okano等將Clostridium

在植物組織中，除纖維素外還有大量的半纖維素，能利用這些物質(zhì)成為基因改造乳酸菌的目標(biāo)。半纖維素降解后，大部分物質(zhì)為木糖和阿拉伯糖，乳酸菌是不能直接利用木糖和阿拉伯糖作為碳源的，因此有研究將催化木糖到5-磷酸酮糖與阿拉伯糖到5-磷酸酮糖的基因?qū)氲侥軌蜻M(jìn)行同型發(fā)酵的乳酸菌中生成D-乳酸。采用這種方法，lmol的5-磷酸木酮糖通過磷酸轉(zhuǎn)酮酶途徑轉(zhuǎn)化為1mol的乳酸，造成了碳源的浪費。為了解決這一問題，Okano等用來自于L.lactis1L1403的轉(zhuǎn)酮酶基因(tkt)替換了L.plantarum1ldhLl中的磷酸轉(zhuǎn)酮酶基因(xpkl)，構(gòu)建的菌株L．plantarumΔldhLl一xpk11：：tkt能夠利用阿拉伯糖生產(chǎn)D-乳酸，D-乳酸的產(chǎn)量達(dá)38．6g／L，對阿拉伯糖的得率為0．82，D-乳酸的光學(xué)純度為99．9％，并且發(fā)酵過程中乙酸的產(chǎn)量僅為0．4g／L，這一研究解決了利用阿拉伯糖作碳源時的同型乳酸發(fā)酵的問題。在植物組織中，除纖維素外還有大量的半纖維素，能利用這

為了解決利用木糖同型發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸的問題，Okano等將來自于菌株L．pentosusNRIC1069的木糖異構(gòu)酶基因(xyU)和木酮糖激酶基因(xylB)導(dǎo)人L．plantarum

ΔldhLl-xok1：：tkt菌株中，改造后的菌株D-乳酸產(chǎn)量達(dá)41．2g／L，轉(zhuǎn)化率達(dá)0．89，D-乳酸的光學(xué)純度達(dá)99．2％，這一研究實現(xiàn)了以木糖為原料進(jìn)行同型乳酸的發(fā)酵生產(chǎn)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有些乳酸菌能夠利用寡聚木糖作為碳源，將降解寡聚木糖的關(guān)鍵酶基因?qū)胪桶l(fā)酵的乳酸菌株中，可能會實現(xiàn)利用半纖維素為原料進(jìn)行同型乳酸發(fā)酵的愿望。為了解決利用木糖同型發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸的問題，Okan4.2大腸桿菌(Escherichiacoli)的基因工程改造

大腸桿菌能夠以相對簡單的原料實現(xiàn)D-乳酸的生產(chǎn)，并且其作為基因工程模式菌株相對于其他菌株來說具有易實現(xiàn)基因操作的優(yōu)點。但大