實(shí)驗(yàn)二蛋白質(zhì)等電點(diǎn)及含量測定

1實(shí)驗(yàn)二蛋白質(zhì)等電點(diǎn)及含量測定1臺可見光分光光度計(jì)配套4個(gè)玻璃比色杯，用完務(wù)必立即洗凈、晾干。切忌用試管刷或粗糙布(紙)擦拭。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，務(wù)必將使用過的玻璃器皿洗凈、晾干、放回原處。【溫馨提示】P40/P51實(shí)驗(yàn)二蛋白質(zhì)等電點(diǎn)及含量測定共19頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第1頁!2學(xué)習(xí)蛋白質(zhì)的兩性解離性質(zhì)，掌握pH值法測定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的一般原理和操作方法。學(xué)習(xí)和掌握雙縮脲法測定蛋白質(zhì)濃度的原理和操作方法?！緦?shí)驗(yàn)?zāi)康摹繉?shí)驗(yàn)二蛋白質(zhì)等電點(diǎn)及含量測定共19頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第2頁!01蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測定實(shí)驗(yàn)二蛋白質(zhì)等電點(diǎn)及含量測定共19頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第3頁!4【實(shí)驗(yàn)原理】——pH值沉淀法測定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，在溶液中存在如下平衡：實(shí)驗(yàn)二蛋白質(zhì)等電點(diǎn)及含量測定共19頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第4頁!5實(shí)驗(yàn)儀器4支15mL玻璃試管、移液管、吸耳球、移液槍（200uL）、槍頭（200uL）等。實(shí)驗(yàn)材料和試劑蒸餾水、1M醋酸、0.1M醋酸、0.01M醋酸、酪蛋白溶液?！緝x器試劑耗材】

——pH值沉淀法測定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)實(shí)驗(yàn)二蛋白質(zhì)等電點(diǎn)及含量測定共19頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第5頁!6【實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析】

——pH值沉淀法測定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)觀察各管中清澈度變化，記錄結(jié)果（用+，++，+++，表示渾濁度）并解釋現(xiàn)象。確定酪蛋白的等電點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)二蛋白質(zhì)等電點(diǎn)及含量測定共19頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第6頁!02蛋白質(zhì)含量的測定雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量實(shí)驗(yàn)二蛋白質(zhì)等電點(diǎn)及含量測定共19頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第7頁!8【實(shí)驗(yàn)原理】——雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量紫紅色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無關(guān)，顏色深淺可在540nm比色測定，故可用此法來測定蛋白質(zhì)含量。測定的蛋白質(zhì)濃度范圍為1-10mg/mL。此法的優(yōu)點(diǎn)是較快速，不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近，以及干擾物質(zhì)少。主要缺點(diǎn)是靈敏度差。因此雙縮脲法常用于需要快速，但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)測定。實(shí)驗(yàn)二蛋白質(zhì)等電點(diǎn)及含量測定共19頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第8頁!9【操作步驟】——雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。（全班繪制1份即可）取6支15mL試管，編號0-5，按下表順序加入各試劑。試劑/mL試管012345標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白0.00.40.81.21.62.0蒸餾水2.01.61.20.80.40.0雙縮脲試劑4.04.04.04.04.04.0蛋白質(zhì)含量mg/mL0.02.04.06.08.010.0實(shí)驗(yàn)二蛋白質(zhì)等電點(diǎn)及含量測定共19頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第9頁!10【操作步驟】——雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量2.蛋白質(zhì)樣品測定

（每小組做1份）

1.另取2支試管，分別加1mL未知濃度的酪蛋白蛋白質(zhì)樣品液（注意樣品濃度不要超過10mg/mL），加1mL蒸餾水，加4mL雙縮脲試劑，混勻，室溫放置30min。

2.2支樣品溶液于540nm處比色測定吸光值。

3.取兩組樣品測定的吸光值平均值，根據(jù)回歸方程計(jì)算出相應(yīng)蛋白質(zhì)的濃度。

4.按下列公式計(jì)算出樣品蛋白質(zhì)的含量：樣品蛋白質(zhì)含量（mg/100mL）=Y×N×100/V式中，Y為標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的蛋白質(zhì)的量（mg），N為稀釋倍數(shù)，V為樣品所取的體積（mL）。y=0.042x-0.0004實(shí)驗(yàn)二蛋白質(zhì)等電點(diǎn)及含量測定共19頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第10頁!11【思考題】影響標(biāo)準(zhǔn)曲線的因素有哪些？蛋白質(zhì)含量測定中需要注意什么問題？實(shí)驗(yàn)二蛋白質(zhì)等電點(diǎn)及含量測定共19頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第11頁!12蛋白質(zhì)分子所帶凈電荷為零時(shí)的pH值稱為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（pI）。在等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)分子在電場中不向任何一極移動(dòng)，而且分子與分子間因碰撞而引起聚沉的傾向增加，所以這時(shí)可以使蛋白質(zhì)溶液的粘度、滲透壓均減到最低，且溶液變混濁。牛乳中的酪蛋白的等電點(diǎn)是4.7-4.8。本實(shí)驗(yàn)采用蛋白質(zhì)在不同pH溶液中形成的混濁度來確定，即混濁度最大時(shí)的pH值即為該種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)值?！緦?shí)驗(yàn)原理】——pH值沉淀法測定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)實(shí)驗(yàn)二蛋白質(zhì)等電點(diǎn)及含量測定共19頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第12頁!13【操作步驟】——pH值沉淀法測定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)每小組取4支15mL玻璃試管，按下表順序分別精確地加入各試劑，加入后立即混勻，加一管，搖勻一管。管號H2O/mL0.01MHAC/mL0.1MHAC/mL1MHAC/mLpH酪蛋白溶液/mL觀察現(xiàn)象（min）0102018.400.6--5.91

28.7-0.3-5.31

38.00-1.00-4.71

47.40--1.603.51

靜置，觀察各管在不同時(shí)間的混濁度。最混濁的一管pH即為酪蛋白的等電點(diǎn)。觀察時(shí)可用+，++，+++，表示渾濁度。實(shí)驗(yàn)二蛋白質(zhì)等電點(diǎn)及含量測定共19頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第13頁!蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)沉淀的原因是什么？影響該實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的因素有哪些？【思考題】實(shí)驗(yàn)二蛋白質(zhì)等電點(diǎn)及含量測定共19頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第14頁!15【實(shí)驗(yàn)原理】——雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量雙縮脲（NH3CONHCONH3）是兩分子尿素經(jīng)180℃左右加熱，放出1個(gè)分子氨后得到的產(chǎn)物。在強(qiáng)堿性溶液中，雙縮脲能與Cu形成紫紅色絡(luò)合物，稱為雙縮脲反應(yīng)。凡具有兩個(gè)酰胺基或兩個(gè)直接連接的肽鍵，或能過1個(gè)中間碳原子相連的肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反應(yīng)。蛋白質(zhì)含有多個(gè)肽鍵，可發(fā)生雙縮脲反應(yīng)。2+實(shí)驗(yàn)二蛋白質(zhì)等電點(diǎn)及含量測定共19頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第15頁!16實(shí)驗(yàn)儀器6支15mL玻璃試管、移液管、吸耳球、移液槍（200uL）、槍頭（200uL）、可見光分光光度計(jì)等。（繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線）2支15mL玻璃試管、移液管、吸耳球、移液槍（200uL）、槍頭（200uL）、可見光分光光度計(jì)等。（樣品測定）實(shí)驗(yàn)材料和試劑雙縮脲試劑、標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白、蒸餾水、待測樣品（可以用酪蛋白溶液，也可用牛乳中提取的酪蛋白）?！緝x器試劑耗材】——雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量實(shí)驗(yàn)二蛋白質(zhì)等電點(diǎn)及含量測定共19頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第16頁!17【操作步驟】——雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量上述試劑加完后，充分混勻，室溫放置30min。以0號管為對照管，于540nm處比色測定吸光值，記下各管吸光度。以每管蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)，對應(yīng)吸光度為縱坐標(biāo)，作吸光度-蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線。（見電腦桌面Excel表格“標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制”）實(shí)驗(yàn)二蛋白質(zhì)等電點(diǎn)及含量測定共19頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第17頁!18【實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析】

——雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量樣品蛋白質(zhì)含量（mg/100mL）=Y×N×100/V2.計(jì)算樣品蛋白質(zhì)的含量式中，Y為標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的蛋白質(zhì)的量（mg），N為稀釋倍數(shù)，V為樣品所取的體積（mL）。1.繪制蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)驗(yàn)二蛋白質(zhì)等電點(diǎn)及含量測定共19頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第18頁!19【注意事項(xiàng)】等電點(diǎn)測定的實(shí)驗(yàn)要求各種試劑的濃度和加入量必須非常準(zhǔn)確。標(biāo)準(zhǔn)曲線選擇不能只看R，還應(yīng)該看曲線斜率和截