廣泛耐藥肺炎克雷伯菌耐藥表型分析及耐藥機(jī)制研究

廣泛耐藥肺炎克雷伯菌耐藥表型分析及耐藥機(jī)制研究肺炎克雷伯菌是臨床常見(jiàn)的機(jī)會(huì)致病菌，在免疫抑制及住院患者中，引發(fā)多種感染性疾病，包括呼吸系統(tǒng)感染、泌尿系統(tǒng)感染、血流感染等，繼而延長(zhǎng)住院時(shí)間，增加死亡率和醫(yī)療開(kāi)支［1,

2］。碳青霉烯類藥物是治療這類感染的重要抗菌藥物，但近年來(lái)，碳青霉烯耐藥肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistant

Klebsiellapneumoniae，CRKP）分離率逐漸上升，已占臨床碳青霉烯耐藥腸桿菌感染的70%~90%［3］。CRKP對(duì)大部分β內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥，但部分CRKP同時(shí)也對(duì)其他多種非β內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥，如喹諾酮類和氨基糖苷類［4］。這種對(duì)多類抗菌藥物耐藥，僅對(duì)一兩類抗菌藥物敏感的肺炎克雷伯菌被稱為廣泛耐藥肺炎克雷伯菌（extensivelydrug-resistant

Klebsiellapneumoniae，XDRKP）［5,

6］。XDRKP耐藥譜多變，極大地限制了抗菌藥物選擇。細(xì)菌耐藥表型的產(chǎn)生有多種原因，包括抗菌藥物水解酶或抗菌藥物耐藥相關(guān)蛋白表達(dá)、抗菌藥物作用靶位改變、細(xì)胞膜通透性降低、細(xì)菌外排泵激活等［7］。抗菌藥物水解酶及抗菌藥物耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá)是導(dǎo)致細(xì)菌耐藥最主要且最常見(jiàn)的原因［7］。本研究收集山西白求恩醫(yī)院2018年1月至2020年12月分離自臨床樣本的116株廣泛耐藥肺炎克雷伯菌，通過(guò)耐藥表型篩選、藥敏結(jié)果分析、PCR擴(kuò)增相關(guān)耐藥基因，研究本地區(qū)XDRKP耐藥特點(diǎn)和耐藥基因的排列組合規(guī)律，以期為耐藥基因流行趨勢(shì)及相關(guān)耐藥機(jī)制研究提供參考。材料與方法一、材料1.菌株來(lái)源：收集山西白求恩醫(yī)院2018年1月至2020年12月分離的3201株肺炎克雷伯菌，結(jié)合臨床資料綜合判斷各菌株是否為感染性疾病病原菌。判斷標(biāo)準(zhǔn)為：有感染性癥狀（如發(fā)熱、寒戰(zhàn)、肌肉酸痛等）、存在明確的感染病灶或影像學(xué)改變、炎癥標(biāo)志物較平常升高2倍以上；按照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute，CLSI）2020版［8］和歐洲藥敏試驗(yàn)委員會(huì)［9］判讀標(biāo)準(zhǔn)對(duì)各菌株已有藥敏結(jié)果進(jìn)行重新判讀，篩選廣泛耐藥肺炎克雷伯菌116株納入研究。同一患者不同部位分離的XDRKP同時(shí)保留；同一患者同一部位多次分離的XDRKP，僅保留最后1株。分離自痰標(biāo)本的菌株須保證標(biāo)本合格（顯微鏡檢：上皮細(xì)胞<10>25/每低倍視野）。所有研究對(duì)象均簽署科研倫理知情同意書(shū)，本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（YXLL-2019-76）。

2.儀器與試劑：哥倫比亞血瓊脂購(gòu)自鄭州AUTOBIO股份有限公司；M-H瓊脂購(gòu)自天津市金章科技發(fā)展有限公司；ASTGN16藥敏卡購(gòu)自法國(guó)Biomerieux有限公司；K-B法藥敏紙片購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司、替加環(huán)素微量肉湯稀釋法藥敏試劑購(gòu)自溫州康泰生物有限公司；各耐藥基因PCR引物、2XSanTaqPCRMix預(yù)混液、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（100~2000bp）、50XTAEBUFFER均由生工生物工程（上海）股份有限公司提供；其他為常用試劑。微生物藥敏分析儀（VITEK-compact2）、濃度比濁儀購(gòu)自法國(guó)Biomerieux公司；基質(zhì)輔助激光解析串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtimeofflightmassspectrometry,MALDI-TOFMS）微生物快速鑒定系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)BrukerDaltonics；PCR擴(kuò)增儀購(gòu)自德國(guó)艾本德有限公司；水平電泳裝置購(gòu)自美國(guó)Majorscience公司；凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自珠海賽樂(lè)奇生物技術(shù)有限公司。二、方法1.菌株鑒定和及藥敏試驗(yàn)：入選菌株復(fù)蘇后接種于哥倫比亞血瓊脂，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，挑取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌落進(jìn)行細(xì)菌鑒定及藥敏試驗(yàn)。細(xì)菌鑒定使用MALDI-TOFMS和VITEK-compact2完成。藥敏試驗(yàn)使用VITEK-compact2并ASTGN16藥敏卡完成，藥敏結(jié)果K-B法或微量肉湯稀釋法復(fù)核。結(jié)果判讀參考CLSI標(biāo)準(zhǔn)，替加環(huán)素判讀參考?xì)W洲藥敏試驗(yàn)委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)。質(zhì)控菌株ATCC25922、ATCC1705及ATCC1706由山西省臨檢中心提供。

2.碳青霉烯酶表型篩選試驗(yàn)：根據(jù)CLSIM100-S28［8］文件推薦方法，采用mCIM聯(lián)合eCIM檢測(cè)XDRKP碳青霉烯酶表型，并與碳青霉烯酶基因擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。

3.耐藥基因檢測(cè)：加熱煮沸法提取細(xì)菌DNA作為模板，PCR擴(kuò)增各耐藥基因：碳青霉烯酶基因：blaKPC、blaNDM、blaVIM、blaIMP和blaOXA；氨基糖苷耐藥基因：16SrRNA甲基化酶基因：rmtA、rmtC、rmtD、rmtG、rmtH、armA、npmA、rmtB、rmtE和rmtF，氨基聚糖苷修飾酶變體：aac（6′）-Ib-cr；喹諾酮耐藥基因：DNA解旋酶保護(hù)蛋白qnr家族：qnrA、qnrB、qnrC、qnrD和qnrS，外排泵蛋白：oqxAB、qepA，氨基聚糖苷修飾酶變體：aac（6′）-Ib-cr；替加環(huán)素耐藥Tet蛋白基因：外排泵蛋白：tet（A）和tet（L），核糖體保護(hù)蛋白：tet（M），替加環(huán)素修飾酶：tet（X）。各耐藥基因具體引物序列及擴(kuò)增條件見(jiàn)參考文獻(xiàn)［10,

11,

12,

13,

14,

15,

16,

17］。對(duì)擴(kuò)增后樣本行瓊脂糖凝膠電泳（1.0%瓊脂糖、100V、80A、30min）檢測(cè)，根據(jù)條帶位置初步判斷有無(wú)陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物及產(chǎn)物大小。將疑似陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物送至北京賽默飛公司進(jìn)行基因測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與BLAST程序內(nèi)序列進(jìn)行比對(duì)，對(duì)陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行最終確認(rèn)。

4.耐藥表型與耐藥基因型比對(duì)：將各菌株的耐藥表型與基因型一一進(jìn)行比對(duì)，分析各菌株耐藥表型產(chǎn)生的可能原因。結(jié)果一、XDRKP基本臨床信息2018—2020年共分離XDRKP116株，總分離率3.62%（116/3201），其中113株分離自住院患者標(biāo)本，占97.41%（113/116），3株分離自急診科。耐藥菌株主要分離于神經(jīng)外科、重癥監(jiān)護(hù)室（ICU）和普通外科，分離率分別為：18.10%（21/116）、16.38%（19/116）、12.93%（15/116）。痰液及肺泡灌洗液、尿液、血液標(biāo)本的XDRKP分離率分別為41.38%（48/116）、24.14%（28/116）、10.34%（12/116），其他標(biāo)本類型XDRKP分離率均低于10%。二、XDRKP藥敏試驗(yàn)結(jié)果116株XDRKP中，頭孢菌素和喹諾酮類抗菌藥物耐藥率均為100%（116/116）。碳青霉烯類抗菌藥物耐藥率99.14%（115/116）、氨基糖苷類抗菌藥物中慶大霉素耐藥率96.55%（112/116）、妥布霉素耐藥率94.83%（110/116），阿米卡星耐藥率88.79%（103/116）。磺胺類抗菌藥物復(fù)方磺胺甲唑耐藥率37.93%（44/116）。替加環(huán)素耐藥率2.59%（3/116）。具體結(jié)果見(jiàn)表1。三、碳青霉烯酶表型篩選試驗(yàn)116株XDRKP中115株為CRKP。mCIM聯(lián)合eCIM檢測(cè)碳青霉烯酶表型，結(jié)果顯示絲氨酸酶陽(yáng)性108株，檢出率93.91%；金屬酶陽(yáng)性7株，陽(yáng)性率為6.09%。與PCR結(jié)果比對(duì)：5株XDRKP同時(shí)攜帶blaKPC和blaNDM，此5株菌碳青霉烯酶表型為絲氨酸酶陽(yáng)性金屬酶陰性。另有3株XDRKP碳青霉烯酶表型為絲氨酸酶陽(yáng)性金屬酶陰性，但碳青霉烯酶耐藥基因未檢出。碳青霉烯酶表型篩選試驗(yàn)與碳青霉烯酶耐藥基因擴(kuò)增結(jié)果一致率為93.04%（107/115）。四、耐藥基因檢測(cè)碳青霉烯耐藥基因blaKPC陽(yáng)性率86.21%（100/116），blaNDM陽(yáng)性率6.03%（7/116）。5株XDRKP同時(shí)攜帶blaKPC和blaNDM，4株XDRKP未檢出任何碳青霉烯酶基因。所有菌株未檢出blaVIM、blaIMP、blaOXA；氨基糖苷耐藥基因rmtB陽(yáng)性率78.45%（91/116），armA陽(yáng)性率0.86%（1/116）、aac（6′）-Ib-cr陽(yáng)性率2.59%（3/116）。2株XDRKP同時(shí)攜帶armA和aac（6′）-Ib-cr，4株XDRKP同時(shí)攜帶rmtB和aac（6′）-Ib-cr，15株XDRKP未檢出任何氨基糖苷類耐藥基因。所有菌株未檢出rmtA、rmtC、rmtD、rmtG、rmtH、npmA、rmtE、rmtF；喹諾酮耐藥基因oqxAB陽(yáng)性率52.59%（61/116），qnrS陽(yáng)性率5.17%（6/116），未檢出單獨(dú)攜帶qnrB及aac（6′）-Ib-cr的XDRKP。16株XDRKP攜帶2~4種喹諾酮類耐藥基因，33株XDRKP未檢出喹諾酮耐藥基因。所有菌株未檢出qnrA、qnrC、qnrS和qepA；替加環(huán)素耐藥Tet蛋白基因tet（A）陽(yáng)性率21.55%（25/116），所有菌株未檢出tet（L）、tet（M）和tet（X）。

與其他3類抗菌藥物耐藥基因組合相比，喹諾酮耐藥基因組合更加復(fù)雜且存在多種組合方式。qnrS+oxqAB（6/116）與qnrB+oxqAB+aac（6′）-Ib-cr（4/116）是最常見(jiàn)的多基因組合方式。所有XDRKP未檢出單獨(dú)攜帶qnrB或aac（6′）-Ib-cr，提示這兩種基因可能與其他耐藥基因共同存在介導(dǎo)喹諾酮耐藥。基因擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)表2，部分基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖見(jiàn)圖1,

2,

3。

圖1

瓊脂糖凝膠電泳分離各耐藥基因擴(kuò)增產(chǎn)物

圖2

瓊脂糖凝膠電泳分離喹諾酮類各耐藥基因

圖3

瓊脂糖凝膠電泳分離替加環(huán)素耐藥基因tet（A）擴(kuò)增產(chǎn)物五、耐藥表型與耐藥基因型比對(duì)對(duì)116株XDRKP藥敏結(jié)果與耐藥基因攜帶情況進(jìn)行匹配，嘗試性分析各XDRKP耐藥表型的產(chǎn)生與相應(yīng)耐藥基因攜帶之間的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，耐藥表型與耐藥基因型間匹配度為43.97%（51/116），即51株XDRKP抗菌藥物耐藥表型可以用攜帶有相應(yīng)耐藥基因來(lái)進(jìn)行初步解釋。同時(shí)發(fā)現(xiàn)以下兩種現(xiàn)象：（1）有45株XDRKP表現(xiàn)為某一類抗菌藥物耐藥但未檢出相應(yīng)耐藥基因。（2）有21株XDRKP檢出某類抗菌藥物耐藥基因但未表現(xiàn)為相應(yīng)門(mén)類抗菌藥物耐藥。具體情況見(jiàn)表3。討論116株XDRKP中113株來(lái)自住院患者，表明除考慮送檢率外，醫(yī)院環(huán)境與XDRKP檢出具有相關(guān)性。神經(jīng)外科和重癥監(jiān)護(hù)室是XDRKP分離的主要科室，也說(shuō)明XDRKP的產(chǎn)生與醫(yī)院中普遍的抗菌藥物使用有關(guān)。115株XDRKP表現(xiàn)為碳青霉烯類聯(lián)合其他多種抗菌藥物耐藥，這與Avgoulea等［4］的觀點(diǎn)一致，即CRKP中存在同時(shí)對(duì)其他多種抗菌藥物耐藥的菌株，碳青霉烯耐藥也是引發(fā)其他抗菌藥物耐藥的潛在危險(xiǎn)因素。從各類抗菌藥物耐藥情況來(lái)看，XDRKP對(duì)多種抗菌藥物的耐藥率均高于90%，耐藥形勢(shì)嚴(yán)峻。而復(fù)方磺胺甲唑與替加環(huán)素敏感性相對(duì)較高，可以作為備選藥物治療XDRKP。CLSI推薦使用mCIM聯(lián)合eCIM檢測(cè)CRKP碳青霉烯酶表型。與PCR結(jié)果相比，mCIM聯(lián)合eCIM一致性高（93.04%）。當(dāng)菌株同時(shí)表達(dá)絲氨酸酶和金屬酶時(shí)，絲氨酸酶陽(yáng)性會(huì)掩蓋eCIM對(duì)金屬酶的檢測(cè)，這也是該試驗(yàn)出現(xiàn)偏差的主要原因。部分XDRKP碳青霉烯酶表型篩選試驗(yàn)陽(yáng)性但耐藥基因擴(kuò)增結(jié)果陰性，表明此類分離菌株碳青霉烯耐藥表型與其他耐藥機(jī)制相關(guān)，如ampC酶高表達(dá)、細(xì)菌膜通透性降低、外排泵激活等。氨基糖苷類抗菌藥物耐藥，主要與16SrRNA甲基化酶及氨基聚糖苷修飾酶的產(chǎn)生有關(guān)［18］。PCR擴(kuò)增得到rmtB、armA及aac（6′）-Ib-cr3種陽(yáng)性產(chǎn)物，其中rmtB陽(yáng)性率為78.45%，表明rmtB是本地區(qū)主要流行的16SrRNA甲基化酶基因，少量XDRKP攜帶有armA甲基化酶基因。有3株XDRKP僅攜帶有aac（6′）-Ib-cr氨基糖苷修飾酶，通過(guò)對(duì)藥物的修飾作用介導(dǎo)細(xì)菌耐藥。值得注意的是，有6株XDRKP耐藥表型陽(yáng)性而未檢測(cè)出耐藥基因，提示存在其他耐藥機(jī)制導(dǎo)致耐藥表型的產(chǎn)生，如抗菌藥物作用靶位改變、外排泵的激活等。同時(shí)還有4株XDRKP攜帶有氨基糖苷類耐藥基因但對(duì)這類抗菌藥物未表現(xiàn)出耐藥，可能是由于耐藥基因未表達(dá)或低表達(dá)所致。喹諾酮類抗菌藥物通過(guò)與解旋酶及拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ結(jié)合，阻斷細(xì)菌DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過(guò)程而發(fā)揮作用［19］。本研究中，65.52%的XDRKP攜帶有oqxAB外排泵基因（單獨(dú)攜帶或與其他耐藥基因共存），表明oqxAB為本地區(qū)最常見(jiàn)喹諾酮類抗菌藥物耐藥基因。另外還檢出少量qnrB、qnrS及aac（6′）-Ib-cr耐藥基因，提示XDRKP可以通過(guò)多種耐藥基因介導(dǎo)耐藥表型的產(chǎn)生。有趣的是，有33株XDRKP未檢出任何喹諾酮耐藥基因而耐藥表型陽(yáng)性，提示存在其他耐藥機(jī)制，如作用靶位基因突變、抗菌藥物攝入減少等。在耐藥基因組合模式方面，喹諾酮耐藥基因存在明顯差異性：oqxAB、qnrS可以單獨(dú)存在并介導(dǎo)XDRKP對(duì)于喹諾酮類抗菌藥物的耐藥，未發(fā)現(xiàn)單獨(dú)攜帶qnrB、aac（6′）-Ib-cr的XDRKP，兩種耐藥基因通常與oqxAB同時(shí)存在。這一發(fā)現(xiàn)也與Robicsek等［20］的報(bào)道相似，即aac（6′）-Ib-cr通常僅能降低環(huán)丙沙星的活性，而對(duì)莫西沙星與左氧氟沙星無(wú)效，細(xì)菌