細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇示范課件

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇1細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)活細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間、直接觀察、研究活細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和生命活動(dòng)可控制選擇特定的細(xì)胞種類、性質(zhì)、階段可控制調(diào)節(jié)條件物理、化學(xué)、生物等可采用各種研究技術(shù)、記錄方法樣品均一性來源于同一組織同一種細(xì)胞經(jīng)濟(jì)、規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)活細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間、直接觀察、研究活細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)2局限性人工模擬的條件和體內(nèi)實(shí)際情況仍不完全相同缺乏體內(nèi)的系統(tǒng)作用、失去神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)和細(xì)胞相互間的影響體外培養(yǎng)的細(xì)胞生活在缺乏動(dòng)態(tài)平衡的環(huán)境環(huán)境中，必然發(fā)生變化。局限性人工模擬的條件和體內(nèi)實(shí)際情況仍不完全相同3本章主要內(nèi)容細(xì)胞培養(yǎng)的基本操作技術(shù)原代培養(yǎng)(primaryculture)傳代培養(yǎng)(subculture)體外培養(yǎng)細(xì)胞的影響因素細(xì)胞培養(yǎng)污染及對(duì)策培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)測(cè)定方法細(xì)胞凍存和復(fù)蘇本章主要內(nèi)容細(xì)胞培養(yǎng)的基本操作技術(shù)4細(xì)胞培養(yǎng)中的常用術(shù)語組織培養(yǎng)(TissueCulture)指的是從體內(nèi)取出組織，模擬體內(nèi)生理環(huán)境，使之生存和生長(zhǎng)并維持其結(jié)構(gòu)和功能的方法。器官培養(yǎng)（OrganCulture）培養(yǎng)的是器官的原基、器官的一部分或整個(gè)器官，使之在體外生存、生長(zhǎng)和保持一定功能的方法。細(xì)胞培養(yǎng)(CellCulture)培養(yǎng)物是單個(gè)細(xì)胞和細(xì)胞群。細(xì)胞培養(yǎng)中的常用術(shù)語組織培養(yǎng)(TissueCulture)5細(xì)胞培養(yǎng)中的常用術(shù)語原代培養(yǎng)（primaryculture）從體內(nèi)取出細(xì)胞或組織的第一次培養(yǎng)。傳代（passage）也稱再培養(yǎng)。無論是否稀釋，將細(xì)胞從一個(gè)培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移或移植到另一個(gè)培養(yǎng)瓶即稱為傳代或傳代培養(yǎng)。也稱再培養(yǎng)。細(xì)胞系（cellline）原代培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代成功后即為細(xì)胞系細(xì)胞培養(yǎng)中的常用術(shù)語原代培養(yǎng)（primaryculture6細(xì)胞培養(yǎng)中的常用術(shù)語細(xì)胞株（cellstrain）通過選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中獲得的具有特殊性質(zhì)或標(biāo)志的培養(yǎng)物稱細(xì)胞株。匯合（confluent）細(xì)胞相互連接成片占據(jù)所有底物面積。接觸抑制（contactinhibition）細(xì)胞匯合相互接觸后失去運(yùn)動(dòng)的現(xiàn)象細(xì)胞培養(yǎng)中的常用術(shù)語細(xì)胞株（cellstrain）通過選擇7一、細(xì)胞培養(yǎng)基本操作技術(shù)由于體外培養(yǎng)的細(xì)胞沒有抗感染能力，因此防污染是決定培養(yǎng)成功的首要條件。一切操作需要保證無菌和有條不紊。一、細(xì)胞培養(yǎng)基本操作技術(shù)由于體外培養(yǎng)的8培養(yǎng)前準(zhǔn)備制定好實(shí)驗(yàn)計(jì)劃和操作程序有關(guān)數(shù)據(jù)的計(jì)算要事先做好。準(zhǔn)備各種所需器材和物品，清點(diǎn)無誤后將其放置在操作場(chǎng)所(培養(yǎng)室、超凈臺(tái))內(nèi)，然后開始消毒。避免開始實(shí)驗(yàn)后，因物品不全往返拿取而增加污染機(jī)會(huì)。培養(yǎng)前準(zhǔn)備制定好實(shí)驗(yàn)計(jì)劃和操作程序9消毒地面每天都要用0.2%的新潔爾滅拖洗地面—次(拖布要專用)，紫外線照射消毒3050min超凈工作臺(tái)臺(tái)面每次實(shí)驗(yàn)前要用75％酒精擦洗。然后紫外線消毒30min。消毒時(shí)工作臺(tái)面上用品布局合理，不要過多或重疊放置，否則會(huì)遮擋射線降低消毒效果。一些操作用具如移液器、廢液缸、污物盒、試管架等用75%酒精擦洗后置于臺(tái)內(nèi)同時(shí)紫外線消毒。消毒地面每天都要用0.2%的新潔爾滅拖洗地面—次(拖布要專用10洗手和著裝原則上和外科手術(shù)相同。僅做觀察不做培養(yǎng)操作時(shí)，可穿著細(xì)胞培養(yǎng)室內(nèi)紫外線照射30min的清潔工作服在利用超凈臺(tái)工作時(shí)，因整個(gè)前臂要伸入箱內(nèi)，應(yīng)著長(zhǎng)袖的清潔工作服，并于開始操作前要用75％酒精消毒手。進(jìn)入原代培養(yǎng)室需徹底洗手還要戴口罩、著消毒衣帽。專用鞋或帶鞋套洗手和著裝原則上和外科手術(shù)相同。11火焰消毒在無菌環(huán)境進(jìn)行培養(yǎng)或做其它無菌工作時(shí)，首先要點(diǎn)燃酒精燈。按裝吸管帽、打開或封閉瓶口等，都需在火焰近處并經(jīng)過燒灼進(jìn)行。如實(shí)驗(yàn)用品需火焰滅菌，冷卻后接觸培養(yǎng)細(xì)胞，以防燒死細(xì)胞。

火焰消毒在無菌環(huán)境進(jìn)行培養(yǎng)或做其它無菌工作時(shí)，首先要點(diǎn)燃酒精12操作進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，動(dòng)作要準(zhǔn)確敏捷不能太快，否則空氣流動(dòng)增加污染機(jī)會(huì)。不能用手觸及已消毒器皿，如已接觸，要用火焰燒灼消毒或取備品更換。操作進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，動(dòng)作要準(zhǔn)確敏捷13組織細(xì)胞取材及培養(yǎng)的基本要求取材的組織用培養(yǎng)液浸泡，4℃運(yùn)送，24h內(nèi)盡快培養(yǎng)。取材時(shí)應(yīng)嚴(yán)格無菌操作，避免對(duì)組織的機(jī)械損傷，盡量去除脂肪、神經(jīng)、結(jié)締、壞死組織，污染組織可用青鏈霉素和制霉菌素漂洗。原代培養(yǎng)，特別是正常細(xì)胞的培養(yǎng)，應(yīng)采用營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)液。一般來講,胚胎組織較成熟個(gè)體的組織容易培養(yǎng);分化低的較分化高的組織容易生長(zhǎng);腫瘤組織較正常組織容易培養(yǎng)。取材時(shí)應(yīng)盡量選用易培養(yǎng)的組織進(jìn)行培養(yǎng)。為了便于以后鑒別原代組織的來源和觀察細(xì)胞體外培養(yǎng)與原組織的差異性，原代取材同時(shí)保留組織學(xué)和電鏡標(biāo)本，對(duì)供體來源、部位及一般情況做記錄。組織細(xì)胞取材及培養(yǎng)的基本要求取材的組織用培養(yǎng)液浸泡，4℃運(yùn)送14組織材料的分離機(jī)械法適于較柔軟的組織，如腦、脾、淋巴結(jié)、胸腺等。剪切組織為1mm3碎塊后，置于組織勻漿器研磨或用注射器針芯擠壓后過不銹鋼篩網(wǎng)?；瘜W(xué)法胰蛋白酶、膠原酶、EDTA法細(xì)胞懸液的分離方法低速離心法、密度梯度離心法組織材料的分離機(jī)械法適于較柔軟的組織，如腦、脾、淋巴結(jié)、胸腺15組織樣本原代培養(yǎng)的污染多數(shù)來源于組織樣本；不同的細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基需求不同，當(dāng)前尚無一種培養(yǎng)基是萬能的，應(yīng)選擇相應(yīng)的培養(yǎng)基。然后紫外線消毒30min。如果細(xì)胞對(duì)冷凍保護(hù)劑特別敏感，那么，解凍后的細(xì)胞應(yīng)先通過離心去除冷凍保護(hù)劑，然后再接種到含完全生長(zhǎng)培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中。培養(yǎng)液混濁，液體內(nèi)漂菌絲或細(xì)胞菌。這種情況下，最好減少細(xì)胞接種數(shù)，延長(zhǎng)換液的時(shí)間。細(xì)胞培養(yǎng)(CellCulture)培養(yǎng)物是單個(gè)細(xì)胞和細(xì)胞群。適于分離密度不等的細(xì)胞。有的散在生長(zhǎng)，倒置顯微鏡下可見絲狀、管狀或樹枝狀的菌絲縱橫交錯(cuò)在細(xì)胞之間或培養(yǎng)基中，有的呈鏈狀排列，培養(yǎng)液一般不發(fā)生渾濁。細(xì)胞懸液的分離方法低速離心法、密度梯度離心法減少空氣流動(dòng)是防止污染的重要環(huán)節(jié)。[3H]TdR摻入法和BrdU摻入法吹打細(xì)胞時(shí)用力要適度，盡量減少氣泡如果細(xì)胞壓在格線上時(shí)，則只計(jì)上線，不計(jì)下線，只計(jì)左線，不計(jì)右線。神經(jīng)元胞體呈圓形或長(zhǎng)桿狀,核大而圓,核仁明顯.數(shù)細(xì)胞的原則是只數(shù)完整的細(xì)胞，若細(xì)胞聚集成團(tuán)時(shí)只按照一個(gè)細(xì)胞計(jì)算。支原體和病毒對(duì)細(xì)胞的形態(tài)和機(jī)能的影響是長(zhǎng)期的、緩慢的和潛在的常用介質(zhì)有Ficoll400，Percoll，泛影葡胺等。細(xì)胞質(zhì)回縮，胞質(zhì)呈圓球形對(duì)細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解，使細(xì)胞離散。細(xì)胞懸液的分離方法低速離心法血液和體液等細(xì)胞懸液5001000rpm離心510min。離心速度過大、時(shí)間過長(zhǎng)，會(huì)造成細(xì)胞損傷和死亡。密度梯度離心法用離心法將細(xì)胞分到不同密度的梯度介質(zhì)中，再分別吸出各層細(xì)胞。適于分離密度不等的細(xì)胞。常用介質(zhì)有Ficoll400，Percoll，泛影葡胺等。組織樣本原代培養(yǎng)的污染多數(shù)來源于組織樣本；細(xì)胞懸液的分離方法16胰蛋白酶（Trypsin）對(duì)細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解，使細(xì)胞離散。消化效果與PH值、溫度、酶濃度和組織塊大小與硬度有關(guān)。適于消化細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織，能有效地分離肝、腎、甲狀腺、羊膜、胚胎組織、上皮組織等。而對(duì)含結(jié)締組織較豐富的組織，如乳腺、滑膜、子宮、纖維肉瘤、腫瘤組織等無效．但若與膠原酶合用能增加其對(duì)組織的分離作用。鈣鎂離子和血清抑制其活性。常用劑量為0.25%，PH8，溫度37℃胰蛋白酶（Trypsin）對(duì)細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解，使細(xì)胞離散17膠原酶法（collagenase）水解結(jié)締組織中膠原蛋白成分，對(duì)上皮細(xì)胞影響不大。產(chǎn)品有ⅣⅦⅨ等型，分別適用于分離肝細(xì)胞、胰島、脂肪細(xì)胞及纖維組織。鈣鎂離子和血清不影響活性，PH6.57常用劑量為200U/ml膠原酶法（collagenase）水解結(jié)締組織中膠原蛋白成18細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇示范課件19EDTA法EDTA能與細(xì)胞上的鈣、鎂離子結(jié)合形成整合物，利用結(jié)合后的機(jī)械力使細(xì)胞變圓而分散細(xì)胞或使貼壁細(xì)胞從瓶壁上脫離。缺點(diǎn)是細(xì)胞易裂解或貼壁細(xì)胞從瓶壁上脫離時(shí)呈片狀，有團(tuán)塊，常不單獨(dú)使用，可與胰蛋白酶混合使用(11或21)，既利于細(xì)胞脫壁又利于細(xì)胞分散。可降低胰酶的用量和毒性作用。EDTA工作液的濃度為0.02％，用不含鈣、鎂PBS配制。EDTA法EDTA能與細(xì)胞上的鈣、鎂離子結(jié)合形成整合物，利用20二、原代培養(yǎng)(primaryculture)從直接取自生物體細(xì)胞、組織或器官開始的培養(yǎng)，即將動(dòng)物機(jī)體的各種組織從機(jī)體中取出，經(jīng)各種酶（常用胰蛋白酶）、螯合劑（常用EDTA）或機(jī)械方法處理，分散成單細(xì)胞，置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞得以生存、生長(zhǎng)和繁殖的過程。二、原代培養(yǎng)(primaryculture)從直接取自生物21原代培養(yǎng)細(xì)胞組織和細(xì)胞剛剛離體，生物學(xué)特性未發(fā)生很大變化，仍具有二倍體遺傳性，最接近和反映體內(nèi)生長(zhǎng)特性，是藥物測(cè)試、細(xì)胞分化等實(shí)驗(yàn)的很好對(duì)象；原代細(xì)胞培養(yǎng)也是建立各種細(xì)胞系（cellline)或細(xì)胞株（cellstrain）必須經(jīng)過的階段。原代細(xì)胞培養(yǎng)多由各種細(xì)胞成分組成，比較復(fù)雜，即使是經(jīng)過處理后的細(xì)胞，也仍具有異質(zhì)性（heterogeneous),主要表現(xiàn)在細(xì)胞形態(tài)和大小不一原代培養(yǎng)細(xì)胞組織和細(xì)胞剛剛離體，生物學(xué)特性未發(fā)生很大變化，仍22原代培養(yǎng)的方法懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法器官培養(yǎng)法組織塊培養(yǎng)法細(xì)胞培養(yǎng)法原代培養(yǎng)的方法懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法23懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法對(duì)于懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞．如白血病細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、胸水和腹水中的癌細(xì)胞和免疫細(xì)胞無須消化，可采用低速離心分離,直接培養(yǎng)。懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法對(duì)于懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞．如白血病細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、骨24器官培養(yǎng)(organculture)指組織、器官原基，以至整個(gè)器官或其一部分在體外的維持或生長(zhǎng)，它們可以分化與保持原來的結(jié)構(gòu)與功能。器官培養(yǎng)(organculture)指組織、器官原基，以至25細(xì)胞培養(yǎng)法方法與步驟1)動(dòng)物處死將出生2～3d乳鼠，用脫頸方法處死。用酒精棉球擦拭解剖部位。2)取材及剪切在無菌條件下將組織取出，置于無菌培養(yǎng)皿中，剪去多余的組織（脂肪等），用PBS液洗滌12次；放入另一培養(yǎng)皿中，將組織剪成1mm3大小的塊。細(xì)胞培養(yǎng)法方法與步驟1)動(dòng)物處死將出生2～3d乳鼠，26細(xì)胞培養(yǎng)法方法與步驟3)消化及分散組織塊將上述清洗過的組織放入無菌試管內(nèi)，加入5～6倍量的0.25％胰蛋白酶液（pH7.4～7.6），置37℃水浴中消化20～40min，每隔10min搖動(dòng)一次，直到組織塊變得疏松，粘稠，且顏色略變?yōu)榘咨珵橹埂Ｈ〕鲈嚬?，加?ml培養(yǎng)液，用吸管反復(fù)吹打組織塊，使其分散成細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液用兩層滅菌紗布過濾至另一燒杯中。細(xì)胞培養(yǎng)法方法與步驟3)消化及分散組織塊將上述清洗過的組織27細(xì)胞培養(yǎng)法方法與步驟4)計(jì)數(shù)與稀釋:從過濾的細(xì)胞懸液中取出適量滴于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，按白細(xì)胞計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)數(shù)；計(jì)數(shù)后用培養(yǎng)液稀釋，稀釋后的濃度一般以每毫升含3～5×105個(gè)細(xì)胞為宜。5)分裝與培養(yǎng)將稀釋好的細(xì)胞懸液分裝于細(xì)胞培養(yǎng)瓶or培養(yǎng)皿中，蓋好，做好標(biāo)記，置于37℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。6)觀察逐日檢查培養(yǎng)物是否污染，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。待細(xì)胞已基本長(zhǎng)成致密單層時(shí)，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)法方法與步驟4)計(jì)數(shù)與稀釋:從過濾的細(xì)胞懸液中取出適28對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間變化成倍增長(zhǎng)，活力最佳，最適合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。噻唑藍(lán)（MTT）比色法組織取出，置于無菌培養(yǎng)皿中，氫化可的松可促進(jìn)表皮細(xì)胞和乳腺上皮細(xì)胞生長(zhǎng)，并能提高膠質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的克隆形成率，用量為108～107mol/L。有價(jià)值的細(xì)胞被污染，并且污染程度較輕，可以通過及時(shí)排除污染物，挽救細(xì)胞恢復(fù)正常有關(guān)數(shù)據(jù)的計(jì)算要事先做好。匯合（confluent）細(xì)胞相互連接成片占據(jù)所有底物面積?？焖俳鈨鰞龃婕?xì)胞從液氮中取出后，應(yīng)立即放入37℃水浴中，輕輕搖動(dòng)冷凍管，使其在1分鐘內(nèi)全部融化（不要超過3分鐘）。另外隨著細(xì)胞種類增多．不同種細(xì)胞交叉污染也時(shí)有發(fā)生、從而造成細(xì)胞不純。數(shù)細(xì)胞的原則是只數(shù)完整的細(xì)胞，若細(xì)胞聚集成團(tuán)時(shí)只按照一個(gè)細(xì)胞計(jì)算。與抗生素聯(lián)合應(yīng)用效果更佳。[3H]TdR摻入法和BrdU摻入法培養(yǎng)細(xì)胞受細(xì)菌污染后，會(huì)出現(xiàn)培養(yǎng)液變混濁，pH改變。原代細(xì)胞培養(yǎng)多由各種細(xì)胞成分組成，比較復(fù)雜，即使是經(jīng)過處理后的細(xì)胞，也仍具有異質(zhì)性（heterogeneous),主要表現(xiàn)在細(xì)胞形態(tài)和大小不一傳代培養(yǎng)(subculture)然后紫外線消毒30min。由于體外培養(yǎng)的密度梯度離心法用離心法將細(xì)胞分到不同密度的梯度介質(zhì)中，再分別吸出各層細(xì)胞。如果細(xì)胞壓在格線上時(shí)，則只計(jì)上線，不計(jì)下線，只計(jì)左線，不計(jì)右線。不同的細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基需求不同，當(dāng)前尚無一種培養(yǎng)基是萬能的，應(yīng)選擇相應(yīng)的培養(yǎng)基。4)計(jì)數(shù)與稀釋:從過濾的細(xì)胞懸液中取出適量滴于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，按白細(xì)胞計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)數(shù)；細(xì)胞培養(yǎng)法注意事項(xiàng)取材的組織最好盡快培養(yǎng)，若不能及時(shí)培養(yǎng)，可將組織浸泡于培養(yǎng)液內(nèi)放置于冰浴或40C冰箱。若組織塊很大，應(yīng)先將其切成1cm2以下的小塊再低溫保存，但時(shí)間不能超過24小時(shí)，因放置時(shí)間長(zhǎng)或組織塊太大都易造成細(xì)胞的死亡；取材時(shí)嚴(yán)格無菌操作。用預(yù)先消毒好的器皿和帶有少量培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶進(jìn)行取材。所取組織要盡量避免紫外線照射或接觸任何化學(xué)試劑及有害藥物如碘、汞等。3.取材時(shí)要細(xì)心去除組織中的血液、結(jié)締組織、脂肪及壞死組織等。修剪和切碎過程中，為避免組織干燥，可將其浸泡于少量培養(yǎng)液中；對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間變化成倍增長(zhǎng)，活力最佳，最適合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)29組織塊培養(yǎng)法組織塊培養(yǎng)是常用、簡(jiǎn)便易行和成功率較高的原代培養(yǎng)方法，也是早期采用培養(yǎng)細(xì)胞的方法，故也被稱為組織培養(yǎng)(tissueculture)。組織塊培養(yǎng)法組織塊培養(yǎng)是常用、簡(jiǎn)便易行和成功率較高的原代培養(yǎng)30組織塊培養(yǎng)法(1)取材、修剪、組織剪或切成1mm3左右的小塊。(2)將剪切好的組織小塊用眼科鑷送入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。25ml培養(yǎng)瓶(底面積約為17.5cm2）以20一30小塊為宜。(3)放置2—4h待組織小塊貼附后．將培養(yǎng)瓶慢慢翻轉(zhuǎn)平放、靜止培養(yǎng)組織塊培養(yǎng)法(1)取材、修剪、組織剪或切成1mm3左右的小31注意事項(xiàng)組織塊接種后l3天，游出細(xì)胞數(shù)很少,組織塊的粘貼不牢固。觀察、移動(dòng)過程中要注意動(dòng)作輕巧。盡量不要引起液體的振蕩而產(chǎn)生對(duì)組織塊的沖擊力使其漂起。在原代培養(yǎng)的12d內(nèi)要持別注意觀察，是否有細(xì)菌、霉菌的污染。一旦發(fā)現(xiàn)，要及時(shí)清除，以防給培養(yǎng)箱內(nèi)的其它細(xì)胞帶來污染。原代培養(yǎng)35d需換液一次，去除漂浮的組織塊和殘留的血細(xì)胞，以免影響原代細(xì)胞的生長(zhǎng)。注意事項(xiàng)組織塊接種后l3天，游出細(xì)胞數(shù)很少,組織塊的粘貼不牢32幾種細(xì)胞的原代培養(yǎng)圖示1.細(xì)胞種類：人肺部成纖維細(xì)胞；2.培養(yǎng)的天數(shù)：2d->4d->7d;3.放大倍數(shù)：200倍；4.培養(yǎng)基種類：1640+10%胎牛血清；5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)述:細(xì)胞呈梭形，貼壁生長(zhǎng);幾種細(xì)胞的原代培養(yǎng)圖示1.細(xì)胞種類：人肺部成纖維細(xì)33幾種細(xì)胞的原代培養(yǎng)圖示1.細(xì)胞種類小鼠胚胎成纖維細(xì)胞2.培養(yǎng)的天數(shù)4d；3.放大倍數(shù)倒置顯微鏡；

4.培養(yǎng)基種類1640+10%X小牛血清；5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)述:細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，貼壁生長(zhǎng)幾種細(xì)胞的原代培養(yǎng)圖示1.細(xì)胞種類小鼠胚胎成纖維細(xì)34幾種細(xì)胞的原代培養(yǎng)圖示神經(jīng)元原代培養(yǎng):神經(jīng)元是高度分化的細(xì)胞,在體外培養(yǎng)條件下難以增殖.因此,目前神經(jīng)元的培養(yǎng)主要用于原代培養(yǎng).

神經(jīng)元胞體呈圓形或長(zhǎng)桿狀,核大而圓,核仁明顯.可見有細(xì)小突起從胞體長(zhǎng)出.

培養(yǎng)液中需加入高濃度的葡萄糖,以利于神經(jīng)元的生長(zhǎng).幾種細(xì)胞的原代培養(yǎng)圖示神經(jīng)元原代培養(yǎng):神經(jīng)元是高度分化的細(xì)胞35三、傳代培養(yǎng)(passageorsubculture)細(xì)胞在培養(yǎng)瓶長(zhǎng)成致密單層后，已基本上飽和，為使細(xì)胞能繼續(xù)生長(zhǎng)，同時(shí)也將細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)大，就必須進(jìn)行傳代（再培養(yǎng)）。不論是否稀釋，將細(xì)胞以一個(gè)培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移或移植到另一個(gè)培養(yǎng)瓶即稱為傳代或傳代培養(yǎng)(passage)。三、傳代培養(yǎng)(passageorsubculture)細(xì)36細(xì)胞的傳代培養(yǎng)根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)的特點(diǎn)，傳代方法有2種。懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代離心法傳代離心（1000rpm）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。直接傳代法懸浮細(xì)胞沉淀在瓶壁時(shí)，將上清培養(yǎng)液去除l／2～2／3，然后用吸管直接吹打形成細(xì)胞懸液再傳代。細(xì)胞的傳代培養(yǎng)根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)的特點(diǎn)，傳代方法有2種。37細(xì)胞的傳代培養(yǎng)貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代采用酶消化法傳代。在傳代時(shí)，需要用胰蛋白酶將細(xì)胞消化，使其從支持物上脫落，或用EDTA溶液與胰蛋白酶按11或21比例混合后聯(lián)合使用。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。細(xì)胞的傳代培養(yǎng)貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代38Optimalconfluencyformovingcellstoanewdishis7080%toolow,cellswillbeinlagphaseandwon’tproliferateToohighandcellsmayundergounfavorablechangesandwillbedifficulttoremovefromplateOptimalconfluencyformoving39吹打細(xì)胞時(shí)用力要適度，盡量減少氣泡細(xì)胞株（cellstrain）通過選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中獲得的具有特殊性質(zhì)或標(biāo)志的培養(yǎng)物稱細(xì)胞株。二、原代培養(yǎng)(primaryculture)25％胰蛋白酶液（pH7.支原體和病毒對(duì)細(xì)胞的形態(tài)和機(jī)能的影響是長(zhǎng)期的、緩慢的和潛在的在培養(yǎng)液中加入適量的抗菌素。原代細(xì)胞第1次換液時(shí)，切記不要把培養(yǎng)液全部倒掉。取材時(shí)應(yīng)盡量選用易培養(yǎng)的組織進(jìn)行培養(yǎng)。因此，除滿足營(yíng)養(yǎng)的要求外，還必須使細(xì)胞生存環(huán)境盡量接近活體的環(huán)境。剪去多余的組織（脂肪等），常用的排除微生物污染的方法有以下4種一些操作用具如移液器、廢液缸、污物盒、試管架等用75%酒精擦洗后置于臺(tái)內(nèi)同時(shí)紫外線消毒。細(xì)胞株（系）條件合適時(shí)生長(zhǎng)迅速，過夜就變黃，可進(jìn)行全量換液。為了便于以后鑒別原代組織的來源和觀察細(xì)胞體外培養(yǎng)與原組織的差異性，原代取材同時(shí)保留組織學(xué)和電鏡標(biāo)本，對(duì)供體來源、部位及一般情況做記錄。EDTA能與細(xì)胞上的鈣、鎂離子結(jié)合形成整合物，利用結(jié)合后的機(jī)械力使細(xì)胞變圓而分散細(xì)胞或使貼壁細(xì)胞從瓶壁上脫離。細(xì)胞附著于底物上，游離期結(jié)束。有關(guān)數(shù)據(jù)的計(jì)算要事先做好。幾種細(xì)胞的原代培養(yǎng)圖示貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代方法吹打細(xì)胞時(shí)用力要適度，盡量減少氣泡貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代方法40酶消化過程酶消化過程41酶消化過程酶消化過程42注意問題操作全過程注意無菌操作胰酶消化時(shí)間要適度吹打細(xì)胞時(shí)用力要適度，盡量減少氣泡注意問題操作全過程注意無菌操作43貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)過程游離期貼壁期潛伏期對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期停止期（平臺(tái)期）貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)過程游離期44游離期細(xì)胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)，也稱懸浮期細(xì)胞質(zhì)回縮，胞質(zhì)呈圓球形10分鐘4小時(shí)游離期細(xì)胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)，也稱懸浮期45貼壁期細(xì)胞附著于底物上，游離期結(jié)束。底物膠原、玻璃、塑料等細(xì)胞株平均在10分鐘4小時(shí)貼壁血清中有促使細(xì)胞貼壁的冷析球蛋白和纖粘素、膠原等糖蛋白。進(jìn)口塑料培養(yǎng)瓶涂有生長(zhǎng)基質(zhì)（化學(xué)合成的功能基團(tuán)）貼壁期細(xì)胞附著于底物上，游離期結(jié)束。46潛伏期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、停止期潛伏期細(xì)胞有生長(zhǎng)活動(dòng)，而無細(xì)胞分裂，細(xì)胞株潛伏期一般為624小時(shí)。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間變化成倍增長(zhǎng)，活力最佳，最適合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。停止期細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶壁，雖有活力但不再分裂，機(jī)制為接觸抑制、密度依賴性。潛伏期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、停止期潛伏期細(xì)胞有生長(zhǎng)活動(dòng)，而無細(xì)胞分裂47細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇示范課件48四、影響體外培養(yǎng)細(xì)胞的因素組織和細(xì)胞供體年齡培養(yǎng)條件細(xì)胞的粘附培養(yǎng)技術(shù)方法促生長(zhǎng)因子四、影響體外培養(yǎng)細(xì)胞的因素組織和細(xì)胞供體年齡49組織和細(xì)胞供體年齡幼年個(gè)體比老年者易于培養(yǎng)，所有動(dòng)物的胚胎組織都是最好的培養(yǎng)對(duì)象。來自同一個(gè)體的組織，分化低的比分化高的容易培養(yǎng)。組織和細(xì)胞供體年齡幼年個(gè)體比老年者易于培養(yǎng)，所有動(dòng)物的胚胎組50培養(yǎng)條件不同的細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基需求不同，當(dāng)前尚無一種培養(yǎng)基是萬能的，應(yīng)選擇相應(yīng)的培養(yǎng)基。應(yīng)了解所培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)性狀和特殊需求成分。細(xì)胞在體外進(jìn)行培養(yǎng)，失去了機(jī)體的調(diào)節(jié)和控制。因此，除滿足營(yíng)養(yǎng)的要求外，還必須使細(xì)胞生存環(huán)境盡量接近活體的環(huán)境。外環(huán)境的培養(yǎng)條件如溫度、滲透壓、氣體環(huán)境、PH值等均能影響細(xì)胞的生長(zhǎng)。培養(yǎng)條件不同的細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基需求不同，當(dāng)前尚無一種培養(yǎng)基是萬能51細(xì)胞貼附的過程細(xì)胞貼附的過程52影響細(xì)胞貼附的因素細(xì)胞類型(附著最強(qiáng))巨噬細(xì)胞一成纖維細(xì)胞——上皮細(xì)胞——血細(xì)胞(最弱)生物因素血清、培養(yǎng)液中的促附著因子機(jī)械，物理等其他因素離心促進(jìn)附著流動(dòng)培養(yǎng)液流動(dòng)可阻止細(xì)胞附著低溫可抑制附著影響細(xì)胞貼附的因素細(xì)胞類型53促生長(zhǎng)因子現(xiàn)已證明，很多激素如胰島素、氫化可的松等具有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)作用。胰島素能促進(jìn)細(xì)胞利用葡萄糖和氨基酸，用量為1～10U/ml。氫化可的松可促進(jìn)表皮細(xì)胞和乳腺上皮細(xì)胞生長(zhǎng)，并能提高膠質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的克隆形成率，用量為108～107mol/L。人表皮生長(zhǎng)因子（hEGF)對(duì)大鼠宮頸鱗狀上皮細(xì)胞(RCEC)有促進(jìn)增殖的作用。表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)等生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子都能促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。促生長(zhǎng)因子54五、細(xì)胞培養(yǎng)污染及對(duì)策培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況常規(guī)檢查培養(yǎng)液顏色與透明度的變化細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。細(xì)胞形態(tài)變化。微生物污染五、細(xì)胞培養(yǎng)污染及對(duì)策培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況常規(guī)檢查55培養(yǎng)液PH值（顏色變化）變黃，表示PH值下降，細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，代謝產(chǎn)生的酸性物不斷積累導(dǎo)致。變紅或紫紅色，表示PH值上升，細(xì)胞生長(zhǎng)停滯、死亡。一般生長(zhǎng)穩(wěn)定的細(xì)胞需要23天換液1次，生長(zhǎng)慢的細(xì)胞需要34天換液一次。培養(yǎng)液PH值（顏色變化）變黃，表示PH值下降，細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，56細(xì)胞換液原代細(xì)胞經(jīng)24小時(shí)培養(yǎng)，培養(yǎng)液顏色變淺，表示細(xì)胞代謝好。少量換液可刺激細(xì)胞生長(zhǎng)。通常每周兩次，每次換半量或1/51/3量。原代細(xì)胞第1次換液時(shí)，切記不要把培養(yǎng)液全部倒掉。細(xì)胞株（系）條件合適時(shí)生長(zhǎng)迅速，過夜就變黃，可進(jìn)行全量換液。這種情況下，最好減少細(xì)胞接種數(shù)，延長(zhǎng)換液的時(shí)間。細(xì)胞換液原代細(xì)胞經(jīng)24小時(shí)培養(yǎng)，培養(yǎng)液顏色變淺，表示細(xì)胞代謝57細(xì)胞生長(zhǎng)狀況常規(guī)應(yīng)特別注意細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖情況。原代細(xì)胞經(jīng)歷一個(gè)適應(yīng)或潛伏期。細(xì)胞系多為24小時(shí)以內(nèi)。細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底80%時(shí)應(yīng)及時(shí)傳代。細(xì)胞生長(zhǎng)狀況常規(guī)應(yīng)特別注意細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖情況。58細(xì)胞形態(tài)變化生長(zhǎng)良好細(xì)胞透明度大，折光性強(qiáng)，輪廓不清。生長(zhǎng)狀態(tài)不良時(shí)，細(xì)胞折光性變?nèi)?，輪廓增?qiáng)，胞質(zhì)中常出現(xiàn)空泡，脂滴，顆粒樣物質(zhì)，細(xì)胞之間空隙加大。細(xì)胞形態(tài)變化生長(zhǎng)良好細(xì)胞透明度大，折光性強(qiáng)，輪廓不清。59微生物污染培養(yǎng)液顏色與透明度培養(yǎng)液混濁，液體內(nèi)漂菌絲或細(xì)胞菌。支原體污染，沒有明顯癥狀，但細(xì)胞生長(zhǎng)卻明顯變緩。微生物污染培養(yǎng)液顏色與透明度60細(xì)胞培養(yǎng)污染的概念不僅僅指微生物，包括所有混入培養(yǎng)環(huán)境中對(duì)細(xì)胞生存有害的成份和造成細(xì)胞不純的異物，因此一般包括微生物(真菌、細(xì)菌、病毒和支原體)、化學(xué)物質(zhì)(影響細(xì)胞生存、非細(xì)胞所需的化學(xué)成份)及細(xì)胞(非同一種的其它細(xì)胞)。其中以微生物污染最多見。另外隨著細(xì)胞種類增多．不同種細(xì)胞交叉污染也時(shí)有發(fā)生、從而造成細(xì)胞不純。細(xì)胞培養(yǎng)污染的概念不僅僅指微生物，包括所有混入培養(yǎng)環(huán)境中對(duì)細(xì)61污染的途徑空氣空氣是微生物傳播的最主要途徑。凈化工作臺(tái)使用過久，濾器受塵埃阻塞，可使凈化工作不能正常進(jìn)行工作時(shí)不戴口罩或面對(duì)操作野大聲講話、咳嗽等使外界氣流過強(qiáng)減少空氣流動(dòng)是防止污染的重要環(huán)節(jié)。污染的途徑空氣空氣是微生物傳播的最主要途徑。62污染的途徑器材各種培養(yǎng)器皿及器械清洗消毒不徹底洗刷不干凈，污物殘留及培養(yǎng)用液等滅菌不徹底CO2溫箱．由于溫箱內(nèi)濕度大，溫度適宜，取存細(xì)胞時(shí)不慎將培養(yǎng)液漏出，易使細(xì)菌、霉菌孽生，而CO2溫箱內(nèi)是開放式培養(yǎng)．如不定期消毒,可形成污染.污染的途徑器材各種培養(yǎng)器皿及器械清洗消毒不徹底63污染的途徑操作無菌觀念不強(qiáng)、動(dòng)作不準(zhǔn)確、使用污染的器具或封瓶時(shí)不嚴(yán)培養(yǎng)兩種以上細(xì)胞時(shí)，操作不規(guī)范、交叉使用吸管或營(yíng)養(yǎng)液瓶等有可能導(dǎo)致細(xì)胞交叉污染。污染的途徑操作64污染的途徑血清有些血清在生產(chǎn)時(shí)就已被支原體或病毒等污染，即可成為污染的來源。組織樣本原代培養(yǎng)的污染多數(shù)來源于組織樣本；另一方面手術(shù)時(shí)使用碘酒消毒，這些混入組織中的碘可以影響細(xì)胞生長(zhǎng)。污染的途徑血清有些血清在生產(chǎn)時(shí)就已被支原體或病毒等污染，即可65污染對(duì)細(xì)胞的影響支原體和病毒對(duì)細(xì)胞的形態(tài)和機(jī)能的影響是長(zhǎng)期的、緩慢的和潛在的霉菌和細(xì)菌繁殖迅速，能在很短時(shí)間內(nèi)壓制細(xì)胞生長(zhǎng)或產(chǎn)生有毒物質(zhì)殺滅細(xì)胞?；瘜W(xué)物質(zhì)污染如重金屬或其它化學(xué)試劑混入培養(yǎng)液中后，有的毒性較小、如能及時(shí)排出，細(xì)胞仍可存活．但有些烴化物如多環(huán)芳烴等有致突變性，能導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化污染對(duì)細(xì)胞的影響支原體和病毒對(duì)細(xì)胞的形態(tài)和機(jī)能的影響是長(zhǎng)期的66細(xì)菌的污染和檢測(cè)細(xì)菌污染是實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞培養(yǎng)中常見的污染，即使在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入了抗菌素，也可能因?yàn)椴僮鞑簧鞫鹞廴尽Ｗ畛Ｒ姷挠懈锾m氏陽性菌，如枯草桿菌、白色葡萄球菌，以及大腸桿菌、假單胞菌等革蘭氏陰性菌。培養(yǎng)細(xì)胞受細(xì)菌污染后，會(huì)出現(xiàn)培養(yǎng)液變混濁，pH改變。污染后細(xì)胞發(fā)生病理改變，胞內(nèi)顆粒增多、增粗，最后變圓脫落死亡。細(xì)菌的污染和檢測(cè)細(xì)菌污染是實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞培養(yǎng)中常見的污染，即使在67細(xì)菌污染細(xì)菌污染68細(xì)菌污染的檢測(cè)肉眼直接觀察法培養(yǎng)檢查法顯微鏡觀察法PCR檢測(cè)細(xì)菌污染的檢測(cè)肉眼直接觀察法69真菌污染真菌污染是細(xì)胞培養(yǎng)過程中最常見的一種，最常見的真菌有煙曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。培養(yǎng)細(xì)胞受真菌污染后，可見培養(yǎng)液中漂浮著白色或淺黃色的小點(diǎn)，肉眼可見；有的散在生長(zhǎng)，倒置顯微鏡下可見絲狀、管狀或樹枝狀的菌絲縱橫交錯(cuò)在細(xì)胞之間或培養(yǎng)基中，有的呈鏈狀排列，培養(yǎng)液一般不發(fā)生渾濁。真菌污染后，細(xì)胞生長(zhǎng)變慢，但最后由于營(yíng)養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細(xì)胞脫落死亡真菌污染真菌污染是細(xì)胞培養(yǎng)過程中最常見的一種，最常見的真菌有70真菌污染真菌污染71支原體污染和檢測(cè)支原體是介于細(xì)菌與病毒之間能獨(dú)立生活的最小微生物，最小直徑0.2um，一般過濾除菌無法去除它，光鏡下難以看清它的形態(tài)結(jié)構(gòu)。開始不易發(fā)現(xiàn)，能在偏堿條件下生存，對(duì)青霉素有抗藥性。多吸附于細(xì)胞表面或散在于細(xì)胞之間。培養(yǎng)細(xì)胞受支原體污染后，部分敏感細(xì)胞可見細(xì)胞生長(zhǎng)增殖變慢，部分細(xì)胞變圓，從瓶壁脫落。但多數(shù)細(xì)胞污染后無明顯變化，或略有變化，若不及時(shí)處理，還會(huì)產(chǎn)生交叉污染。支原體污染和檢測(cè)支原體是介于細(xì)菌與病毒之間能獨(dú)立生活的最小微72掃描電鏡法顯示支原體，附于細(xì)胞表面眾多的圓形顆粒為支原體掃描電鏡法顯示支原體，附于細(xì)胞表面眾多的圓形顆粒為支原體73支原體污染的檢測(cè)相差顯微鏡觀察法Hayflick培養(yǎng)基直接培養(yǎng)法DNA熒光染色法（Hoechst33258）PCR方法（即用型細(xì)胞培養(yǎng)中支原體檢測(cè)PCR試劑盒）支原體污染的檢測(cè)相差顯微鏡觀察法74病毒的污染和檢測(cè)細(xì)胞的直接觀察動(dòng)物接種檢查電子顯微鏡觀察PCR技術(shù)病毒的污染和檢測(cè)細(xì)胞的直接觀察75污染的預(yù)防防止污染，預(yù)防是關(guān)鍵，預(yù)防措施應(yīng)貫穿于整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)的始終。器皿準(zhǔn)備—開始操作前—操作過程中—其他細(xì)節(jié)方面的預(yù)防在培養(yǎng)液中加入適量的抗菌素。常規(guī)加入青霉素和鏈霉素各100U/ml。必要時(shí)加入慶大霉素、卡那霉素或兩性霉素B等。培養(yǎng)箱內(nèi)應(yīng)經(jīng)常清潔消毒，放置含硫酸銅的消毒水。購(gòu)入的未滅活血清應(yīng)采取56℃水浴滅活30min的措施以使血清中的補(bǔ)體和支原體滅活。污染的預(yù)防防止污染，預(yù)防是關(guān)鍵，預(yù)防措施應(yīng)貫穿于整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)76支原體污染的預(yù)防小牛血清是造成支原體初級(jí)污染的主要來源次級(jí)污染源，即已污染支原體的細(xì)胞在污染的傳播中更為重要保證培養(yǎng)細(xì)胞的來源絕對(duì)干凈，同時(shí)應(yīng)做好檢測(cè)，一旦發(fā)現(xiàn)支原體污染就應(yīng)廢棄嚴(yán)禁已知污染了支原體的細(xì)胞進(jìn)入未污染的工作區(qū)域。嚴(yán)格無菌操作，杜絕人為污染。對(duì)每批小牛血清嚴(yán)格檢查，滅活、過濾有利于抑制支原體的污染。支原體污染的預(yù)防小牛血清是造成支原體初級(jí)污染的主要來源77污染的清除培養(yǎng)的細(xì)胞一旦污染應(yīng)及時(shí)處理，防止污染其他細(xì)胞。高壓滅菌被污染的細(xì)胞，然后棄掉。有價(jià)值的細(xì)胞被污染，并且污染程度較輕，可以通過及時(shí)排除污染物，挽救細(xì)胞恢復(fù)正常常用的排除微生物污染的方法有以下4種污染的清除培養(yǎng)的細(xì)胞一旦污染應(yīng)及時(shí)處理，防止污染其他細(xì)胞。78抗生素排除法

抗生素是細(xì)胞培養(yǎng)中殺滅細(xì)菌的主要手段。聯(lián)合應(yīng)用比單用效果好，預(yù)防性應(yīng)用比污染后應(yīng)用好有的抗生素對(duì)細(xì)菌僅有抑制作用，無殺滅效應(yīng)。反復(fù)使用抗生素還能使微生物產(chǎn)生耐藥性，而且對(duì)細(xì)胞本身也有一定影響盡量不用抗生素處理一些有價(jià)值的細(xì)胞被污染后，仍需要用抗生素挽救，在這種情況下，可采用5－10倍于常用量的沖擊法，加入高濃度抗生素后作用24－48小時(shí)，再換入常規(guī)的培養(yǎng)液，有時(shí)可以奏效抗生素排除法抗生素是細(xì)胞培養(yǎng)中殺滅細(xì)菌的主要手段。79加溫除菌根據(jù)支原體耐熱性能差的特點(diǎn)。有人將受支原體污染的細(xì)胞置于41度作用5－10小時(shí)（最長(zhǎng)可以達(dá)18小時(shí)）殺滅支原體但是41度對(duì)細(xì)胞本身應(yīng)有較大影響，故在處理前，應(yīng)先進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，確定最大限度殺傷支原體而對(duì)細(xì)胞影響較小的處理時(shí)間。加溫除菌根據(jù)支原體耐熱性能差的特點(diǎn)。有人將受支原體污染的細(xì)胞80動(dòng)物體內(nèi)接種受微生物污染的腫瘤細(xì)胞可以接種到同種動(dòng)物皮下或腹腔，借動(dòng)物體內(nèi)免疫系統(tǒng)消滅掉微生物，腫瘤細(xì)胞卻能在體內(nèi)生長(zhǎng)，待一定時(shí)間，從體內(nèi)取出再進(jìn)行培養(yǎng)繁殖。動(dòng)物體內(nèi)接種受微生物污染的腫瘤細(xì)胞可以接種到同種動(dòng)物皮下或腹81與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)在良好的體外培養(yǎng)條件下巨噬細(xì)胞可以存活7－10天，并可以分泌一些細(xì)胞因子支持其他細(xì)胞的克隆生長(zhǎng)。巨噬細(xì)胞在體外條件下仍然可以吞噬微生物并將其消化。利用96孔板將極少培養(yǎng)細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，可以在高度稀釋培養(yǎng)細(xì)胞、極大地降低微生物污染程度地同時(shí)，更有效地發(fā)揮巨噬細(xì)胞清除污染的效能。與抗生素聯(lián)合應(yīng)用效果更佳。與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)在良好的體外培養(yǎng)條件下巨噬細(xì)胞可以存活7－182六、培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的測(cè)定方法細(xì)胞計(jì)數(shù)法胎盤蘭染色法MTT比色法細(xì)胞生長(zhǎng)曲線法[3H]TdR([3H]胸腺嘧啶核苷）摻入法BrdU(5bromo2—deoxyuridine，5溴脫氧尿嘧啶核苷）摻入法六、培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的測(cè)定方法細(xì)胞計(jì)數(shù)法83細(xì)胞計(jì)數(shù)法細(xì)胞計(jì)數(shù)法是用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)目，以測(cè)定細(xì)胞增殖和調(diào)整細(xì)胞濃度。細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果以細(xì)胞數(shù)/毫升表示細(xì)胞計(jì)數(shù)法細(xì)胞計(jì)數(shù)法是用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)目84細(xì)胞計(jì)數(shù)板細(xì)胞計(jì)數(shù)板85細(xì)胞計(jì)數(shù)板細(xì)胞計(jì)數(shù)板86細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇示范課件87細(xì)胞計(jì)數(shù)操作步驟將血球計(jì)數(shù)板及蓋片用軟紗布擦試干凈，并將蓋片蓋在計(jì)數(shù)板上。將細(xì)胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計(jì)數(shù)板之間。靜置3分鐘。鏡下觀察，計(jì)算計(jì)數(shù)板四大格細(xì)胞總數(shù)，壓線細(xì)胞只計(jì)左側(cè)和上方的細(xì)胞計(jì)數(shù)操作步驟將血球計(jì)數(shù)板及蓋片用軟紗布擦試干凈，并將蓋片88細(xì)胞計(jì)數(shù)操作步驟按下式計(jì)算（細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)）/ml＝（四個(gè)大格子細(xì)胞數(shù)/4)×稀釋倍數(shù)×104/ml公式中除以4因?yàn)橛?jì)數(shù)了4個(gè)大格的細(xì)胞數(shù)。公式中乘以104因?yàn)橛?jì)數(shù)板中每一個(gè)大格的體積為1.0mm（長(zhǎng)）×1.0mm（寬）×0.1mm（高）＝0.1mm3而1ml＝1000mm3。細(xì)胞計(jì)數(shù)操作步驟按下式計(jì)算89細(xì)胞計(jì)數(shù)注意事項(xiàng)要求懸液中細(xì)胞數(shù)目不低于104個(gè)/ml，如果細(xì)胞數(shù)目很少要進(jìn)行離心再懸浮于少量培養(yǎng)液中。要求細(xì)胞懸液中的細(xì)胞分散良好，否則影響計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性。取樣計(jì)數(shù)前，應(yīng)充分混勻細(xì)胞懸液，尤其是多次取樣計(jì)數(shù)時(shí)更應(yīng)該每次取樣都要混勻，以求計(jì)數(shù)準(zhǔn)確。細(xì)胞計(jì)數(shù)注意事項(xiàng)要求懸液中細(xì)胞數(shù)目不低于104個(gè)/ml，如果90細(xì)胞計(jì)數(shù)注意事項(xiàng)數(shù)細(xì)胞的原則是只數(shù)完整的細(xì)胞，若細(xì)胞聚集成團(tuán)時(shí)只按照一個(gè)細(xì)胞計(jì)算。如果細(xì)胞壓在格線上時(shí)，則只計(jì)上線，不計(jì)下線，只計(jì)左線，不計(jì)右線。操作時(shí)，注意蓋片下不能有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中，否則要重新計(jì)數(shù)。細(xì)胞計(jì)數(shù)注意事項(xiàng)數(shù)細(xì)胞的原則是只數(shù)完整的細(xì)胞，若細(xì)胞聚集成團(tuán)91臺(tái)盼藍(lán)染色法在細(xì)胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細(xì)胞，活細(xì)胞所占總細(xì)胞中的百分比叫做細(xì)胞活力。由組織中分離細(xì)胞一般也要檢查活力，以了解分離的過程對(duì)細(xì)胞是否有損傷作用。復(fù)蘇后的細(xì)胞也要檢查活力，了解凍存和復(fù)蘇的效果。細(xì)胞死亡后，細(xì)胞膜通透性改變，臺(tái)盼藍(lán)大量進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)而不被排出呈藍(lán)色?；罴?xì)胞選擇性強(qiáng)，不易著色臺(tái)盼藍(lán)染色法在細(xì)胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細(xì)胞，活細(xì)92臺(tái)盼藍(lán)染色法0.5ml臺(tái)盼藍(lán)＋0.3ml培養(yǎng)液＋0.2ml細(xì)胞懸液染色5－15min

至少計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞中著色細(xì)胞數(shù)細(xì)胞活力=（總細(xì)胞數(shù)－著色細(xì)胞)/總細(xì)胞數(shù)×100％臺(tái)盼藍(lán)染色法0.5ml臺(tái)盼藍(lán)＋0.3ml培養(yǎng)液＋0.2ml細(xì)93噻唑藍(lán)（MTT）比色法原理活細(xì)胞線粒體中琥珀酸脫氫酶能將MTT黃色溶液還原成不溶于水的藍(lán)紫色產(chǎn)物顆粒（formazan)，并沉積在細(xì)胞中。二甲基亞砜（DMSO）或酸性異丙醇能溶解沉積在細(xì)胞中藍(lán)紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺（以O(shè)D值表示）與所含的formazan量成正比?？煞从郴罴?xì)胞的代謝水平。而死細(xì)胞沒有這種功能MTT法簡(jiǎn)單快速、準(zhǔn)確，廣泛應(yīng)用于新藥篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)、腫瘤放射敏感性實(shí)驗(yàn)等噻唑藍(lán)（MTT）比色法原理活細(xì)胞線粒體中琥珀酸脫氫酶能將M94噻唑藍(lán)（MTT）比色法加入培養(yǎng)液量10％的MTT(5g/L)，繼續(xù)3～4h培養(yǎng)吸去培養(yǎng)液，加入等量異丙醇或DMSO，振蕩10min

490/630nm測(cè)定OD值細(xì)胞存活率＝實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值×100％噻唑藍(lán)（MTT）比色法加入培養(yǎng)液量10％的MTT(5g/L95細(xì)胞生長(zhǎng)曲線法觀察同一代細(xì)胞的增殖過程，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線分析細(xì)胞的增殖速度，確定具體實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞傳代、細(xì)胞凍存的最佳時(shí)間細(xì)胞生長(zhǎng)曲線法觀察同一代細(xì)胞的增殖過程，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線分析96細(xì)胞生長(zhǎng)曲線法計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度，等量加入培養(yǎng)板各孔，培養(yǎng)7天以接種時(shí)間始，每隔24h計(jì)數(shù)3孔細(xì)胞數(shù)目，取均值

以橫坐標(biāo)為培養(yǎng)時(shí)間，縱坐標(biāo)為細(xì)胞濃度（×104/ml)注1、各孔消化時(shí)間應(yīng)一致。2、計(jì)數(shù)細(xì)胞前應(yīng)混勻。細(xì)胞生長(zhǎng)曲線法計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度，等量加入培養(yǎng)板各孔，培養(yǎng)7天97細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇示范課件98[3H]TdR摻入法和BrdU摻入法[3H]TdR摻入法是將用[3H]標(biāo)記的胸腺嘧啶脫氧核苷摻入到新合成的DNA中，通過測(cè)定[3H]放射性脈沖數(shù)比較不同細(xì)胞的增殖活性。溴脫氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine,BrdU）是DNA前體胸腺嘧啶核苷類似物,通過競(jìng)爭(zhēng)摻入S期細(xì)胞單鏈DNA核苷酸序列替代胸腺嘧啶。BrdU被摻入到DNA復(fù)制位點(diǎn)，這些復(fù)制位點(diǎn)可用熒光劑或酶偶聯(lián)的抗體檢測(cè)。[3H]TdR摻入法和BrdU摻入法[3H]TdR摻入法是將99七、細(xì)胞凍存和復(fù)蘇細(xì)胞低溫冷凍貯存是細(xì)胞室的常規(guī)工作。細(xì)胞凍存與細(xì)胞傳代保存相比可以減少入力、經(jīng)費(fèi)，減少污染，減少細(xì)胞生物學(xué)特性變化。七、細(xì)胞凍存和復(fù)蘇細(xì)胞低溫冷凍貯存是細(xì)胞室的常規(guī)工作。細(xì)胞100凍存和復(fù)蘇的原則慢凍快融當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反，結(jié)晶很大，大結(jié)晶會(huì)造成細(xì)胞膜、細(xì)胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。凍存和復(fù)蘇的原則慢凍快融當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化101低溫保護(hù)劑在細(xì)胞凍存時(shí)加入低溫保護(hù)劑，能大大提高凍存效果。常用的低溫保護(hù)劑是DMSO，它是一種滲透性保護(hù)劑，可迅速透入細(xì)胞，提高胞膜對(duì)水的通透性，降低冰點(diǎn)，延緩凍結(jié)過程，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷。低溫保護(hù)劑在細(xì)胞凍存時(shí)加入低溫保護(hù)劑，能大大提高凍存效果。102細(xì)胞凍存方法預(yù)先配制凍存液含10%DMSO、20%血清培養(yǎng)基取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，加入適量?jī)龃嬉?用吸管吹打制成細(xì)胞懸液（1×106～5×106細(xì)胞/ml)；加入1ml細(xì)胞于凍存管中，密封后標(biāo)記冷凍細(xì)胞名稱和冷凍日期。細(xì)胞凍存方法預(yù)先配制凍存液含10%DMSO、20%血清103一般程序冷凍過程要緩慢。4℃30－60分鐘→20℃30分鐘→80℃16－18小時(shí)（或過夜）→液氮長(zhǎng)期保存凍存細(xì)胞必須處在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，活力大于90％，無微生物污染。細(xì)胞濃度控制在1×107－5×107/ml。凍存管置于程序降溫盒中，超低溫冰箱過夜，液氮罐中長(zhǎng)期保存。一般程序冷凍過程要緩慢。4℃30－60分鐘→20℃30104注意事項(xiàng)細(xì)胞在冷凍過程中在20℃冰箱內(nèi)放置時(shí)間不可超過1小時(shí)，以防止冰晶過大而破壞細(xì)胞。也可跳過20℃這一步驟直接放入80℃冰箱中，但這樣做細(xì)胞存活率要低一些。DMSO稀釋時(shí)會(huì)釋放大量熱量。因此，DMSO不能直接加到細(xì)胞液中，必須事先配制。DMSO必須是細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)別的。如要過濾DMSO，必須選用耐DMSO的尼龍濾膜。注意事項(xiàng)細(xì)胞在冷凍過程中在20℃冰箱內(nèi)放置時(shí)間不可超過1小105細(xì)胞的復(fù)蘇在實(shí)際操作中，凍存細(xì)胞要進(jìn)行復(fù)蘇，再培養(yǎng)傳代。復(fù)蘇細(xì)胞一般采用快速融化法。以保證細(xì)胞外結(jié)晶快速融化，避免慢速融化水分滲入細(xì)胞內(nèi)，再次形成胞內(nèi)結(jié)晶損傷細(xì)胞。細(xì)胞的復(fù)蘇在實(shí)際操作中，凍存細(xì)胞要進(jìn)行復(fù)蘇，再培養(yǎng)傳代。復(fù)蘇106操作要點(diǎn)快速解凍凍存細(xì)胞從液氮中取出后，應(yīng)立即放入37℃水浴中，輕輕搖動(dòng)冷凍管，使其在1分鐘內(nèi)全部融化（不要超過3分鐘）。操作過程動(dòng)作要輕由于冷凍保存過的細(xì)胞變得非常脆弱，不僅解凍速度要快，而且動(dòng)作要輕。一般情況下，解凍后的細(xì)胞可直接接種到含完全生長(zhǎng)培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中直接進(jìn)行培養(yǎng)（1ml凍存細(xì)胞液加入到25－30ml新鮮完全培養(yǎng)液中），24小時(shí)后再用新鮮完全培養(yǎng)液替換舊培養(yǎng)液，以去除DMSO如果細(xì)胞對(duì)冷凍保護(hù)劑特別敏感，那么，解凍后的細(xì)胞應(yīng)先通過離心去除冷凍保護(hù)劑，然后再接種到含完全生長(zhǎng)培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中。操作要點(diǎn)快速解凍凍存細(xì)胞從液氮中取出后，應(yīng)立即放入37℃107注意事項(xiàng)解凍時(shí)務(wù)必注意安全，預(yù)防冷凍管爆裂。要帶手套，用鑷子將細(xì)胞冷凍管從液氮中取出，放入37℃水浴中。切不可直接用手，以免凍傷。冷凍管在水浴中解凍時(shí)，液面不可超過凍存管蓋面，否則，易發(fā)生污染。注意事項(xiàng)解凍時(shí)務(wù)必注意安全，預(yù)防冷凍管爆裂。要帶手套，用鑷子108細(xì)胞庫(kù)AmericanTypeCultureCollection(ATCC)中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)

中科院昆明細(xì)胞庫(kù)

中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（武漢大學(xué)保藏中心）細(xì)胞庫(kù)AmericanTypeCultureColle109細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇示范課件110細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇示范課件111細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇112細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)活細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間、直接觀察、研究活細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和生命活動(dòng)可控制選擇特定的細(xì)胞種類、性質(zhì)、階段可控制調(diào)節(jié)條件物理、化學(xué)、生物等可采用各種研究技術(shù)、記錄方法樣品均一性來源于同一組織同一種細(xì)胞經(jīng)濟(jì)、規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)活細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間、直接觀察、研究活細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)113局限性人工模擬的條件和體內(nèi)實(shí)際情況仍不完全相同缺乏體內(nèi)的系統(tǒng)作用、失去神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)和細(xì)胞相互間的影響體外培養(yǎng)的細(xì)胞生活在缺乏動(dòng)態(tài)平衡的環(huán)境環(huán)境中，必然發(fā)生變化。局限性人工模擬的條件和體內(nèi)實(shí)際情況仍不完全相同114本章主要內(nèi)容細(xì)胞培養(yǎng)的基本操作技術(shù)原代培養(yǎng)(primaryculture)傳代培養(yǎng)(subculture)體外培養(yǎng)細(xì)胞的影響因素細(xì)胞培養(yǎng)污染及對(duì)策培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)測(cè)定方法細(xì)胞凍存和復(fù)蘇本章主要內(nèi)容細(xì)胞培養(yǎng)的基本操作技術(shù)115細(xì)胞培養(yǎng)中的常用術(shù)語組織培養(yǎng)(TissueCulture)指的是從體內(nèi)取出組織，模擬體內(nèi)生理環(huán)境，使之生存和生長(zhǎng)并維持其結(jié)構(gòu)和功能的方法。器官培養(yǎng)（OrganCulture）培養(yǎng)的是器官的原基、器官的一部分或整個(gè)器官，使之在體外生存、生長(zhǎng)和保持一定功能的方法。細(xì)胞培養(yǎng)(CellCulture)培養(yǎng)物是單個(gè)細(xì)胞和細(xì)胞群。細(xì)胞培養(yǎng)中的常用術(shù)語組織培養(yǎng)(TissueCulture)116細(xì)胞培養(yǎng)中的常用術(shù)語原代培養(yǎng)（primaryculture）從體內(nèi)取出細(xì)胞或組織的第一次培養(yǎng)。傳代（passage）也稱再培養(yǎng)。無論是否稀釋，將細(xì)胞從一個(gè)培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移或移植到另一個(gè)培養(yǎng)瓶即稱為傳代或傳代培養(yǎng)。也稱再培養(yǎng)。細(xì)胞系（cellline）原代培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代成功后即為細(xì)胞系細(xì)胞培養(yǎng)中的常用術(shù)語原代培養(yǎng)（primaryculture117細(xì)胞培養(yǎng)中的常用術(shù)語細(xì)胞株（cellstrain）通過選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中獲得的具有特殊性質(zhì)或標(biāo)志的培養(yǎng)物稱細(xì)胞株。匯合（confluent）細(xì)胞相互連接成片占據(jù)所有底物面積。接觸抑制（contactinhibition）細(xì)胞匯合相互接觸后失去運(yùn)動(dòng)的現(xiàn)象細(xì)胞培養(yǎng)中的常用術(shù)語細(xì)胞株（cellstrain）通過選擇118一、細(xì)胞培養(yǎng)基本操作技術(shù)由于體外培養(yǎng)的細(xì)胞沒有抗感染能力，因此防污染是決定培養(yǎng)成功的首要條件。一切操作需要保證無菌和有條不紊。一、細(xì)胞培養(yǎng)基本操作技術(shù)由于體外培養(yǎng)的119培養(yǎng)前準(zhǔn)備制定好實(shí)驗(yàn)計(jì)劃和操作程序有關(guān)數(shù)據(jù)的計(jì)算要事先做好。準(zhǔn)備各種所需器材和物品，清點(diǎn)無誤后將其放置在操作場(chǎng)所(培養(yǎng)室、超凈臺(tái))內(nèi)，然后開始消毒。避免開始實(shí)驗(yàn)后，因物品不全往返拿取而增加污染機(jī)會(huì)。培養(yǎng)前準(zhǔn)備制定好實(shí)驗(yàn)計(jì)劃和操作程序120消毒地面每天都要用0.2%的新潔爾滅拖洗地面—次(拖布要專用)，紫外線照射消毒3050min超凈工作臺(tái)臺(tái)面每次實(shí)驗(yàn)前要用75％酒精擦洗。然后紫外線消毒30min。消毒時(shí)工作臺(tái)面上用品布局合理，不要過多或重疊放置，否則會(huì)遮擋射線降低消毒效果。一些操作用具如移液器、廢液缸、污物盒、試管架等用75%酒精擦洗后置于臺(tái)內(nèi)同時(shí)紫外線消毒。消毒地面每天都要用0.2%的新潔爾滅拖洗地面—次(拖布要專用121洗手和著裝原則上和外科手術(shù)相同。僅做觀察不做培養(yǎng)操作時(shí)，可穿著細(xì)胞培養(yǎng)室內(nèi)紫外線照射30min的清潔工作服在利用超凈臺(tái)工作時(shí)，因整個(gè)前臂要伸入箱內(nèi)，應(yīng)著長(zhǎng)袖的清潔工作服，并于開始操作前要用75％酒精消毒手。進(jìn)入原代培養(yǎng)室需徹底洗手還要戴口罩、著消毒衣帽。專用鞋或帶鞋套洗手和著裝原則上和外科手術(shù)相同。122火焰消毒在無菌環(huán)境進(jìn)行培養(yǎng)或做其它無菌工作時(shí)，首先要點(diǎn)燃酒精燈。按裝吸管帽、打開或封閉瓶口等，都需在火焰近處并經(jīng)過燒灼進(jìn)行。如實(shí)驗(yàn)用品需火焰滅菌，冷卻后接觸培養(yǎng)細(xì)胞，以防燒死細(xì)胞。

火焰消毒在無菌環(huán)境進(jìn)行培養(yǎng)或做其它無菌工作時(shí)，首先要點(diǎn)燃酒精123操作進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，動(dòng)作要準(zhǔn)確敏捷不能太快，否則空氣流動(dòng)增加污染機(jī)會(huì)。不能用手觸及已消毒器皿，如已接觸，要用火焰燒灼消毒或取備品更換。操作進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，動(dòng)作要準(zhǔn)確敏捷124組織細(xì)胞取材及培養(yǎng)的基本要求取材的組織用培養(yǎng)液浸泡，4℃運(yùn)送，24h內(nèi)盡快培養(yǎng)。取材時(shí)應(yīng)嚴(yán)格無菌操作，避免對(duì)組織的機(jī)械損傷，盡量去除脂肪、神經(jīng)、結(jié)締、壞死組織，污染組織可用青鏈霉素和制霉菌素漂洗。原代培養(yǎng)，特別是正常細(xì)胞的培養(yǎng)，應(yīng)采用營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)液。一般來講,胚胎組織較成熟個(gè)體的組織容易培養(yǎng);分化低的較分化高的組織容易生長(zhǎng);腫瘤組織較正常組織容易培養(yǎng)。取材時(shí)應(yīng)盡量選用易培養(yǎng)的組織進(jìn)行培養(yǎng)。為了便于以后鑒別原代組織的來源和觀察細(xì)胞體外培養(yǎng)與原組織的差異性，原代取材同時(shí)保留組織學(xué)和電鏡標(biāo)本，對(duì)供體來源、部位及一般情況做記錄。組織細(xì)胞取材及培養(yǎng)的基本要求取材的組織用培養(yǎng)液浸泡，4℃運(yùn)送125組織材料的分離機(jī)械法適于較柔軟的組織，如腦、脾、淋巴結(jié)、胸腺等。剪切組織為1mm3碎塊后，置于組織勻漿器研磨或用注射器針芯擠壓后過不銹鋼篩網(wǎng)?；瘜W(xué)法胰蛋白酶、膠原酶、EDTA法細(xì)胞懸液的分離方法低速離心法、密度梯度離心法組織材料的分離機(jī)械法適于較柔軟的組織，如腦、脾、淋巴結(jié)、胸腺126組織樣本原代培養(yǎng)的污染多數(shù)來源于組織樣本；不同的細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基需求不同，當(dāng)前尚無一種培養(yǎng)基是萬能的，應(yīng)選擇相應(yīng)的培養(yǎng)基。然后紫外線消毒30min。如果細(xì)胞對(duì)冷凍保護(hù)劑特別敏感，那么，解凍后的細(xì)胞應(yīng)先通過離心去除冷凍保護(hù)劑，然后再接種到含完全生長(zhǎng)培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中。培養(yǎng)液混濁，液體內(nèi)漂菌絲或細(xì)胞菌。這種情況下，最好減少細(xì)胞接種數(shù)，延長(zhǎng)換液的時(shí)間。細(xì)胞培養(yǎng)(CellCulture)培養(yǎng)物是單個(gè)細(xì)胞和細(xì)胞群。適于分離密度不等的細(xì)胞。有的散在生長(zhǎng)，倒置顯微鏡下可見絲狀、管狀或樹枝狀的菌絲縱橫交錯(cuò)在細(xì)胞之間或培養(yǎng)基中，有的呈鏈狀排列，培養(yǎng)液一般不發(fā)生渾濁。細(xì)胞懸液的分離方法低速離心法、密度梯度離心法減少空氣流動(dòng)是防止污染的重要環(huán)節(jié)。[3H]TdR摻入法和BrdU摻入法吹打細(xì)胞時(shí)用力要適度，盡量減少氣泡如果細(xì)胞壓在格線上時(shí)，則只計(jì)上線，不計(jì)下線，只計(jì)左線，不計(jì)右線。神經(jīng)元胞體呈圓形或長(zhǎng)桿狀,核大而圓,核仁明顯.數(shù)細(xì)胞的原則是只數(shù)完整的細(xì)胞，若細(xì)胞聚集成團(tuán)時(shí)只按照一個(gè)細(xì)胞計(jì)算。支原體和病毒對(duì)細(xì)胞的形態(tài)和機(jī)能的影響是長(zhǎng)期的、緩慢的和潛在的常用介質(zhì)有Ficoll400，Percoll，泛影葡胺等。細(xì)胞質(zhì)回縮，胞質(zhì)呈圓球形對(duì)細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解，使細(xì)胞離散。細(xì)胞懸液的分離方法低速離心法血液和體液等細(xì)胞懸液5001000rpm離心510min。離心速度過大、時(shí)間過長(zhǎng)，會(huì)造成細(xì)胞損傷和死亡。密度梯度離心法用離心法將細(xì)胞分到不同密度的梯度介質(zhì)中，再分別吸出各層細(xì)胞。適于分離密度不等的細(xì)胞。常用介質(zhì)有Ficoll400，Percoll，泛影葡胺等。組織樣本原代培養(yǎng)的污染多數(shù)來源于組織樣本；細(xì)胞懸液的分離方法127胰蛋白酶（Trypsin）對(duì)細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解，使細(xì)胞離散。消化效果與PH值、溫度、酶濃度和組織塊大小與硬度有關(guān)。適于消化細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織，能有效地分離肝、腎、甲狀腺、羊膜、胚胎組織、上皮組織等。而對(duì)含結(jié)締組織較豐富的組織，如乳腺、滑膜、子宮、纖維肉瘤、腫瘤組織等無效．但若與膠原酶合用能增加其對(duì)組織的分離作用。鈣鎂離子和血清抑制其活性。常用劑量為0.25%，PH8，溫度37℃胰蛋白酶（Trypsin）對(duì)細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解，使細(xì)胞離散128膠原酶法（collagenase）水解結(jié)締組織中膠原蛋白成分，對(duì)上皮細(xì)胞影響不大。產(chǎn)品有ⅣⅦⅨ等型，分別適用于分離肝細(xì)胞、胰島、脂肪細(xì)胞及纖維組織。鈣鎂離子和血清不影響活性，PH6.57常用劑量為200U/ml膠原酶法（collagenase）水解結(jié)締組織中膠原蛋白成129細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇示范課件130EDTA法EDTA能與細(xì)胞上的鈣、鎂離子結(jié)合形成整合物，利用結(jié)合后的機(jī)械力使細(xì)胞變圓而分散細(xì)胞或使貼壁細(xì)胞從瓶壁上脫離。缺點(diǎn)是細(xì)胞易裂解或貼壁細(xì)胞從瓶壁上脫離時(shí)呈片狀，有團(tuán)塊，常不單獨(dú)使用，可與胰蛋白酶混合使用(11或21)，既利于細(xì)胞脫壁又利于細(xì)胞分散?？山档鸵让傅挠昧亢投拘宰饔?。EDTA工作液的濃度為0.02％，用不含鈣、鎂PBS配制。EDTA法EDTA能與細(xì)胞上的鈣、鎂離子結(jié)合形成整合物，利用131二、原代培養(yǎng)(primaryculture)從直接取自生物體細(xì)胞、組織或器官開始的培養(yǎng)，即將動(dòng)物機(jī)體的各種組織從機(jī)體中取出，經(jīng)各種酶（常用胰蛋白酶）、螯合劑（常用EDTA）或機(jī)械方法處理，分散成單細(xì)胞，置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞得以生存、生長(zhǎng)和繁殖的過程。二、原代培養(yǎng)(primaryculture)從直接取自生物132原代培養(yǎng)細(xì)胞組織和細(xì)胞剛剛離體，生物學(xué)特性未發(fā)生很大變化，仍具有二倍體遺傳性，最接近和反映體內(nèi)生長(zhǎng)特性，是藥物測(cè)試、細(xì)胞分化等實(shí)驗(yàn)的很好對(duì)象；原代細(xì)胞培養(yǎng)也是建立各種細(xì)胞系（cellline)或細(xì)胞株（cellstrain）必須經(jīng)過的階段。原代細(xì)胞培養(yǎng)多由各種細(xì)胞成分組成，比較復(fù)雜，即使是經(jīng)過處理后的細(xì)胞，也仍具有異質(zhì)性（heterogeneous),主要表現(xiàn)在細(xì)胞形態(tài)和大小不一原代培養(yǎng)細(xì)胞組織和細(xì)胞剛剛離體，生物學(xué)特性未發(fā)生很大變化，仍133原代培養(yǎng)的方法懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法器官培養(yǎng)法組織塊培養(yǎng)法細(xì)胞培養(yǎng)法原代培養(yǎng)的方法懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法134懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法對(duì)于懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞．如白血病細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、胸水和腹水中的癌細(xì)胞和免疫細(xì)胞無須消化，可采用低速離心分離,直接培養(yǎng)。懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法對(duì)于懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞．如白血病細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、骨135器官培養(yǎng)(organculture)指組織、器官原基，以至整個(gè)器官或其一部分在體外的維持或生長(zhǎng)，它們可以分化與保持原來的結(jié)構(gòu)與功能。器官培養(yǎng)(organculture)指組織、器官原基，以至136細(xì)胞培養(yǎng)法方法與步驟1)動(dòng)物處死將出生2～3d乳鼠，用脫頸方法處死。用酒精棉球擦拭解剖部位。2)取材及剪切在無菌條件下將組織取出，置于無菌培養(yǎng)皿中，剪去多余的組織（脂肪等），用PBS液洗滌12次；放入另一培養(yǎng)皿中，將組織剪成1mm3大小的塊。細(xì)胞培養(yǎng)法方法與步驟1)動(dòng)物處死將出生2～3d乳鼠，137細(xì)胞培養(yǎng)法方法與步驟3)消化及分散組織塊將上述清洗過的組織放入無菌試管內(nèi)，加入5～6倍量的0.25％胰蛋白酶液（pH7.4～7.6），置37℃水浴中消化20～40min，每隔10min搖動(dòng)一次，直到組織塊變得疏松，粘稠，且顏色略變?yōu)榘咨珵橹?。取出試管，加?ml培養(yǎng)液，用吸管反復(fù)吹打組織塊，使其分散成細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液用兩層滅菌紗布過濾至另一燒杯中。細(xì)胞培養(yǎng)法方法與步驟3)消化及分散組織塊將上述清洗過的組織138細(xì)胞培養(yǎng)法方法與步驟4)計(jì)數(shù)與稀釋:從過濾的細(xì)胞懸液中取出適量滴于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，按白細(xì)胞計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)數(shù)；計(jì)數(shù)后用培養(yǎng)液稀釋，稀釋后的濃度一般以每毫升含3～5×105個(gè)細(xì)胞為宜。5)分裝與培養(yǎng)將稀釋好的細(xì)胞懸液分裝于細(xì)胞培養(yǎng)瓶or培養(yǎng)皿中，蓋好，做好標(biāo)記，置于37℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。6)觀察逐日檢查培養(yǎng)物是否污染，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。待細(xì)胞已基本長(zhǎng)成致密單層時(shí)，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)法方法與步驟4)計(jì)數(shù)與稀釋:從過濾的細(xì)胞懸液中取出適139對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間變化成倍增長(zhǎng)，活力最佳，最適合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。噻唑藍(lán)（MTT）比色法組織取出，置于無菌培養(yǎng)皿中，氫化可的松可促進(jìn)表皮細(xì)胞和乳腺上皮細(xì)胞生長(zhǎng)，并能提高膠質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的克隆形成率，用量為108～107mol/L。有價(jià)值的細(xì)胞被污染，并且污染程度較輕，可以通過及時(shí)排除污染物，挽救細(xì)胞恢復(fù)正常有關(guān)數(shù)據(jù)的計(jì)算要事先做好。匯合（confluent）細(xì)胞相互連接成片占據(jù)所有底物面積?？焖俳鈨鰞龃婕?xì)胞從液氮中取出后，應(yīng)立即放入37℃水浴中，輕輕搖動(dòng)冷凍管，使其在1分鐘內(nèi)全部融化（不要超過3分鐘）。另外隨著細(xì)胞種類增多．不同種細(xì)胞交叉污染也時(shí)有發(fā)生、從而造成細(xì)胞不純。數(shù)細(xì)胞的原則是只數(shù)完整的細(xì)胞，若細(xì)胞聚集成團(tuán)時(shí)只按照一個(gè)細(xì)胞計(jì)算。與抗生素聯(lián)合應(yīng)用效果更佳。[3H]TdR摻入法和BrdU摻入法培養(yǎng)細(xì)胞受細(xì)菌污染后，會(huì)出現(xiàn)培養(yǎng)液變混濁，pH改變。原代細(xì)胞培養(yǎng)多由各種細(xì)胞成分組成，比較復(fù)雜，即使是經(jīng)過處理后的細(xì)胞，也仍具有異質(zhì)性（heterogeneous),主要表現(xiàn)在細(xì)胞形態(tài)和大小不一傳代培養(yǎng)(subculture)然后紫外線消毒30min。由于體外培養(yǎng)的密度梯度離心法用離心法將細(xì)胞分到不同密度的梯度介質(zhì)中，再分別吸出各層細(xì)胞。如果細(xì)胞壓在格線上時(shí)，則只計(jì)上線，不計(jì)下線，只計(jì)左線，不計(jì)右線。不同的細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基需求不同，當(dāng)前尚無一種培養(yǎng)基是萬能的，應(yīng)選擇相應(yīng)的培養(yǎng)基。4)計(jì)數(shù)與稀釋:從過濾的細(xì)胞懸液中取出適量滴于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，按白細(xì)胞計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)數(shù)；細(xì)胞培養(yǎng)法注意事項(xiàng)取材的組織最好盡快培養(yǎng)，若不能及時(shí)培養(yǎng)，可將組織浸泡于培養(yǎng)液內(nèi)放置于冰浴或40C冰箱。若組織塊很大，應(yīng)先將其切成1cm2以下的小塊再低溫保存，但時(shí)間不能超過24小時(shí)，因放置時(shí)間長(zhǎng)或組織塊太大都易造成細(xì)胞的死亡；取材時(shí)嚴(yán)格無菌操作。用預(yù)先消毒好的器皿和帶有少量培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶進(jìn)行取材。所取組織要盡量避免紫外線照射或接觸任何化學(xué)試劑及有害藥物如碘、汞等。3.取材時(shí)要細(xì)心去除組織中的血液、結(jié)締組織、脂肪及壞死組織等。修剪和切碎過程中，為避免組織干燥，可將其浸泡于少量培養(yǎng)液中；對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間變化成倍增長(zhǎng)，活力最佳，最適合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)140組織塊培養(yǎng)法組織塊培養(yǎng)是常用、簡(jiǎn)便易行和成功率較高的原代培養(yǎng)方法，也是早期采用培養(yǎng)細(xì)胞的方法，故也被稱為組織培養(yǎng)(tissueculture)。組織塊培養(yǎng)法組織塊培養(yǎng)是常用、簡(jiǎn)便易行和成功率較高的原代培養(yǎng)141組織塊培養(yǎng)法(1)取材、修剪、組織剪或切成1mm3左右的小塊。(2)將剪切好的組織小塊用眼科鑷送入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。25ml培養(yǎng)瓶(底面積約為17.5cm2）以20一30小塊為宜。(3)放置2—4h待組織小塊貼附后．將培養(yǎng)瓶慢慢翻轉(zhuǎn)平放、靜止培養(yǎng)組織塊培養(yǎng)法(1)取材、修剪、組織剪或切成1mm3左右的小142注意事項(xiàng)組織塊接種后l3天，游出細(xì)胞數(shù)很少,組織塊的粘貼不牢固。觀察、移動(dòng)過程中要注意動(dòng)作輕巧。盡量不要引起液體的振蕩而產(chǎn)生對(duì)組織塊的沖擊力使其漂起。在原代培養(yǎng)的12d內(nèi)要持別注意觀察，是否有細(xì)菌、霉菌的污染。一旦發(fā)現(xiàn)，要及時(shí)清除，以防給培養(yǎng)箱內(nèi)的其它細(xì)胞帶來污染。原代培養(yǎng)35d需換液一次，去除漂浮的組織塊和殘留的血細(xì)胞，以免影響原代細(xì)胞的生長(zhǎng)。注意事項(xiàng)組織塊接種后l3天，游出細(xì)胞數(shù)很少,組織塊的粘貼不牢143幾種細(xì)胞的原代培養(yǎng)圖示1.細(xì)胞種類：人肺部成纖維細(xì)胞；2.培養(yǎng)的天數(shù)：2d->4d->7d;3.放大倍數(shù)：200倍；4.培養(yǎng)基種類：1640+10%胎牛血清；5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)述:細(xì)胞呈梭形，貼壁生長(zhǎng);幾種細(xì)胞的原代培養(yǎng)圖示1.細(xì)胞種類：人肺部成纖維細(xì)144幾種細(xì)胞的原代培養(yǎng)圖示1.細(xì)胞種類小鼠胚胎成纖維細(xì)胞2.培養(yǎng)的天數(shù)4d；3.放大倍數(shù)倒置顯微鏡；

4.培養(yǎng)基種類1640+10%X小牛血清；5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)述:細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，貼壁生長(zhǎng)幾種細(xì)胞的原代培養(yǎng)圖示1.細(xì)胞種類小鼠胚胎成纖維細(xì)145幾種細(xì)胞的原代培養(yǎng)圖示神經(jīng)元原代培養(yǎng):神經(jīng)元是高度分化的細(xì)胞,在體外培養(yǎng)條件下難以增殖.因此,目前神經(jīng)元的培養(yǎng)主要用于原代培養(yǎng).

神經(jīng)元胞體呈圓形或長(zhǎng)桿狀,核大而圓,核仁明顯.可見有細(xì)小突起從胞體長(zhǎng)出.

培養(yǎng)液中需加入高濃度的葡萄糖,以利于神經(jīng)元的生長(zhǎng).幾種細(xì)胞的原代培養(yǎng)圖示神經(jīng)元原代培養(yǎng):神經(jīng)元是高度分化的細(xì)胞146三、傳代培養(yǎng)(passageorsubculture)細(xì)胞在培養(yǎng)瓶長(zhǎng)成致密單層后，已基本上飽和，為使細(xì)胞能繼續(xù)生長(zhǎng)，同時(shí)也將細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)大，就必須進(jìn)行傳代（再培養(yǎng)）。不論是否稀釋，將細(xì)胞以一個(gè)培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移或移植到另一個(gè)培養(yǎng)瓶即稱為傳代或傳代培養(yǎng)(passage)。三、傳代培養(yǎng)(passageorsubculture)細(xì)147細(xì)胞的傳代培養(yǎng)根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)的特點(diǎn)，傳代方法有2種。懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代離心法傳代離心（1000rpm）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。直接傳代法懸浮細(xì)胞沉淀在瓶壁時(shí)，將上清培養(yǎng)液去除l／2～2／3，然后用吸管直接吹打形成細(xì)胞懸液再傳代。細(xì)胞的傳代培養(yǎng)根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)的特點(diǎn)，傳代方法有2種。148細(xì)胞的傳代培養(yǎng)貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代采用酶消化法傳代。在傳代時(shí)，需要用胰蛋白酶將細(xì)胞消化，使其從支持物上脫落，或用EDTA溶液與胰蛋白酶按11或21比例混合后聯(lián)合使用。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。細(xì)胞的傳代培養(yǎng)貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代149Optimalconfluencyformovingcellstoanewdishis7080%toolow,cellswillbeinlagphaseandwon’tproliferateToohighandcellsmayundergounfavorablechangesandwillbedifficulttoremovefromplateOptimalconfluencyformoving150吹打細(xì)胞時(shí)用力要適度，盡量減少氣泡細(xì)胞株（cellstrain）通過選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中獲得的具有特殊性質(zhì)或標(biāo)志的培養(yǎng)物稱細(xì)胞株。二、原代培養(yǎng)(primaryculture)25％胰蛋白酶液（pH7.支原體和病毒對(duì)細(xì)胞的形態(tài)和機(jī)能的影響是長(zhǎng)期的、緩慢的和潛在的在培養(yǎng)液中加入適量的抗菌素。原代細(xì)胞第1次換液時(shí)，切記不要把培養(yǎng)液全部倒掉。取材時(shí)應(yīng)盡量選用易培養(yǎng)的組織進(jìn)行培養(yǎng)。因此，除滿足營(yíng)養(yǎng)的要求外，還必須使細(xì)胞生存環(huán)境盡量接近活體的環(huán)境。剪去多余的組織（脂肪等），常用的排除微生物污染的方法有以下4種一些操作用具如移液器、廢液缸、污物盒、試管架等用75%酒精擦洗后置于臺(tái)內(nèi)同時(shí)紫外線消毒。細(xì)胞株（系）條件合適時(shí)生長(zhǎng)迅速，過夜就變黃，可進(jìn)行全量換液。為了便于以后鑒別原代組織的來源和觀察細(xì)胞體外培養(yǎng)與原組織的差異性，原代取材同時(shí)保留組織學(xué)和電鏡標(biāo)本，對(duì)供體來源、部位及一般情況做記錄。EDTA能與細(xì)胞上的鈣、鎂離子結(jié)合形成整合物，利用結(jié)合后的機(jī)械力使細(xì)胞變圓而分散細(xì)胞或使貼壁細(xì)胞從瓶壁上脫離。細(xì)胞附著于底物上，游離期結(jié)束。有關(guān)數(shù)據(jù)的計(jì)算要事先做好。幾種細(xì)胞的原代培養(yǎng)圖示貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代方法吹打細(xì)胞時(shí)用力要適度，盡量減少氣泡貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代方法151酶消化過程酶消化過程152酶消化過程酶消化過程153注意問題操作全過程注意無菌操作胰酶消化時(shí)間要適度吹打細(xì)胞時(shí)用力要適度，盡量減少氣泡注意問題操作全過程注意無菌操作154貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)過程游離期貼壁期潛伏期對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期停止期（平臺(tái)期）貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)過程游離期155游離期細(xì)胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)，也稱懸浮期細(xì)胞質(zhì)回縮，胞質(zhì)呈圓球形10分鐘4小時(shí)游離期細(xì)胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)，也稱懸浮期156貼壁期細(xì)胞附著于底物上，游離期結(jié)束。底物膠原、玻璃、塑料等細(xì)胞株平均在10分鐘4小時(shí)貼壁血清中有促使細(xì)胞貼壁的冷析球蛋白和纖粘素、膠原等糖蛋白。進(jìn)口塑料培養(yǎng)瓶涂有生長(zhǎng)基質(zhì)（化學(xué)合成的功能基團(tuán)）貼壁期細(xì)胞附著于底物上，游離期結(jié)束。157潛伏期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、停止期潛伏期細(xì)胞有生長(zhǎng)活動(dòng)，而無細(xì)胞分裂，細(xì)胞株潛伏期一般為624小時(shí)。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間變化成倍增長(zhǎng)，活力最佳，最適合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。停止期細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶壁，雖有活力但不再分裂，機(jī)制為接觸抑制、密度依賴性。潛伏期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、停止期潛伏期細(xì)胞有生長(zhǎng)活動(dòng)，而無細(xì)胞分裂158細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用篇示范課件159四、影響體外培養(yǎng)細(xì)胞的因素組織和細(xì)胞供體年齡培養(yǎng)條件細(xì)胞的粘附培養(yǎng)技術(shù)方法促生長(zhǎng)因子四、影響體外培養(yǎng)細(xì)胞的因素組織和細(xì)胞供體年齡160組織和細(xì)胞供體年齡幼年個(gè)體比老年者易于培養(yǎng)，所有動(dòng)物的胚胎組織都是最好的培養(yǎng)對(duì)象。來自同一個(gè)體的組織，分化低的比分化高的容易培養(yǎng)。組織和細(xì)胞供體年齡幼年個(gè)體比老年者易于培養(yǎng)，所有動(dòng)物的胚胎組161培養(yǎng)條件不同的細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基需求不同，當(dāng)前尚無一種培養(yǎng)基是萬能的，應(yīng)選擇相應(yīng)的培養(yǎng)基。應(yīng)了解所培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)性狀和特殊需求成分。細(xì)胞在體外進(jìn)行培養(yǎng)，失去了機(jī)體的調(diào)節(jié)和控制。因此，除滿足營(yíng)養(yǎng)的要求外，還必須使細(xì)胞生存環(huán)境盡量接近活體的環(huán)境。外環(huán)境的培養(yǎng)條件如溫度、滲透壓、氣體環(huán)境、PH值等均能影響細(xì)胞的生長(zhǎng)。培養(yǎng)條件不同的細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基需求不同，當(dāng)前尚無一種培養(yǎng)基是萬能162細(xì)胞貼附的過程細(xì)胞貼附的過程163影響細(xì)胞貼附的因素細(xì)胞類型(附著最強(qiáng))巨噬細(xì)胞一成纖維細(xì)胞——上皮細(xì)胞——血細(xì)胞(最弱)生物因素血清、培養(yǎng)液中的促附著因子機(jī)械，物理等其他因素離心促進(jìn)附著流動(dòng)培養(yǎng)液流動(dòng)可阻止細(xì)胞附著低溫可抑制附著影響細(xì)胞貼附的因素細(xì)胞類型164促生長(zhǎng)因子現(xiàn)已證明，很多激素如胰島素、氫化可的松等具有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)作用。胰島素能促進(jìn)細(xì)胞利用葡萄糖和氨基酸，用量為1～10U/ml。氫化可的松可促進(jìn)表皮細(xì)胞和乳腺上皮細(xì)胞生長(zhǎng)，并能提高膠質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的克隆形成率，用量為108～107mol/L。人表皮生長(zhǎng)因子（hEGF)對(duì)大鼠宮頸鱗狀上皮細(xì)胞(RCEC)有促進(jìn)增殖的作用。表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)等生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子都能促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。促生長(zhǎng)因子165五、細(xì)胞培養(yǎng)污染及對(duì)策培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況常規(guī)檢查培養(yǎng)液顏色與透明度的變化細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。細(xì)胞形態(tài)變化。微生物污染五、細(xì)胞培養(yǎng)污染及對(duì)策培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況常規(guī)檢查166培養(yǎng)液PH值（顏色變化）變黃，表示PH值下降，細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，代謝產(chǎn)生的酸性物不斷積累導(dǎo)致。變紅或紫紅色，表示PH值上升，細(xì)胞生長(zhǎng)停滯、死亡。一般生長(zhǎng)穩(wěn)定的細(xì)胞需要23天換液1次，生長(zhǎng)慢的細(xì)胞需要34天換液一次。培養(yǎng)液PH值（顏色