NR2B在小鼠骨癌痛中的作用及機(jī)制研究課件

NR2B在小鼠骨癌痛中的作用及機(jī)制研究

中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院黃東教授

NR2B在小鼠骨癌痛中的作用及機(jī)制研究課件

※目前，全球癌癥患者的數(shù)量呈＊骨癌痛的具體機(jī)制※癌性疼痛成為影響癌癥病人生活質(zhì)量的一個(gè)嚴(yán)重問(wèn)題。※在癌痛中又以骨癌痛最為嚴(yán)重和最難以控制。?研究背景※目前，全球癌癥患者的數(shù)量呈＊骨癌痛的具體機(jī)制癌痛的特點(diǎn):臨床上，癌痛表現(xiàn)為進(jìn)行性加重，常伴隨有爆發(fā)痛；癌痛與炎性痛和神經(jīng)病理性痛存在著不同的外周和中樞機(jī)制[1]

。如癌痛：膠質(zhì)細(xì)胞增生肥大；GFAP

[1]:

HonoreP.Neuroscience,2000,98:585–598.癌痛的特點(diǎn):臨床上，癌痛表現(xiàn)為進(jìn)行性加重，常伴隨有爆發(fā)痛；★

NMDA受體活化是反復(fù)傷害性刺激誘發(fā)中樞敏化的基礎(chǔ)，是持續(xù)性疼痛產(chǎn)生和維持的關(guān)鍵[2]

。★大量研究證實(shí)：NMDA受體的亞基NR2B在炎性痛、神經(jīng)病理痛中參與了傷害性信息傳遞，在疼痛調(diào)制及痛覺(jué)敏化的形成和維持中發(fā)揮重要作用[3]

。疼痛研究進(jìn)展[2]:

Petrenko.AnesthAnalg.2003,97(4):1108-1116.[3]:NagyGG.EurJNeurosci,2004,20(12):3301-3312.（一）★NMDA受體活化是反復(fù)傷害性刺激誘發(fā)中樞敏化疼痛研究進(jìn)展★

研究顯示，MAPK信號(hào)通路在神經(jīng)可塑性和炎癥反應(yīng)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中起重要作用[4]

。★增生肥大的星形膠質(zhì)細(xì)胞能釋放大量膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP），骨癌痛的產(chǎn)生和維持與脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的變化密切相關(guān)[1]

。[4]:

DeLeoJA.Pain,2006,122(122):17221.

疼痛研究進(jìn)展（二）★研究顯示，MAPK信號(hào)通路在神經(jīng)可塑性和炎癥[4]:研究癌痛的確切機(jī)制，需要適當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型，現(xiàn)有動(dòng)物模型仍顯不足。小鼠骨癌痛模型的優(yōu)勢(shì)■肺癌是臨床骨轉(zhuǎn)移較多見(jiàn)的一種腫瘤，且小鼠在腫瘤學(xué)及神經(jīng)系統(tǒng)研究方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)?！鲂∈笞鳛閷?shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停^經(jīng)濟(jì)適用■本實(shí)驗(yàn)參照Schwei等的方法，將Lewis肺癌細(xì)胞接種于C57BL/6小鼠股骨骨髓腔，建立一個(gè)全新的骨癌痛模型。研究癌痛的確切機(jī)制，需要適當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型，現(xiàn)有動(dòng)物模型仍顯不足我們從如下四個(gè)方面加以研究：1、建立一個(gè)小鼠骨癌痛新模型2、NR2B在骨癌痛小鼠前扣帶回和脊髓中的分布與表達(dá)3、脊髓NR2B基因沉默對(duì)小鼠骨癌痛的影響4、MAPK信號(hào)通路介導(dǎo)的NR2B在小鼠骨癌痛中的作用機(jī)制NR2B是否也參與骨癌痛的發(fā)生機(jī)制呢？我們從如下四個(gè)方面加以研究：NR2B是否也參與骨癌痛的發(fā)生機(jī)實(shí)施方案：◆檢測(cè)癌痛小鼠脊髓和前扣帶回NR2B的表達(dá)和分布，分析小鼠NR2B的表達(dá)和小鼠疼痛行為學(xué)關(guān)系?！魬?yīng)用RNA干擾技術(shù)，沉默骨癌痛小鼠NR2B基因；通過(guò)對(duì)比干擾組小鼠與癌痛組小鼠NR2B的表達(dá)以及兩組小鼠疼痛行為學(xué)，從而闡明NR2B是否在癌痛的發(fā)生與維持中起重要作用。實(shí)施方案：◆對(duì)比骨癌痛小鼠NR2B基因沉默前后，MAPK信號(hào)通路及其介導(dǎo)的下游信號(hào)分子表達(dá)的相應(yīng)改變；◆研究MAPK信號(hào)通路中信號(hào)分子表達(dá)的相應(yīng)改變與GFAP的關(guān)聯(lián)性；▲探索MAPK信號(hào)通路在小鼠骨癌痛中的可能作用機(jī)制。NR2B是怎樣參與骨癌痛的發(fā)生機(jī)制呢？◆對(duì)比骨癌痛小鼠NR2B基因沉默前后，MAPK信號(hào)通路及其選用清潔級(jí)雄性C57BL/6小鼠模型組一般情況觀察行為學(xué)測(cè)定內(nèi)容1技術(shù)路線熱滅活組PBS組正常對(duì)照組放射學(xué)檢查組織學(xué)檢測(cè)自發(fā)痛行為觀察機(jī)械性觸誘發(fā)痛選用清潔級(jí)雄性C57BL/6小鼠模型組一般情況觀察行為學(xué)測(cè)定選用清潔級(jí)雄性C57BL/6小鼠癌痛組一般情況觀察行為學(xué)測(cè)定內(nèi)容2技術(shù)路線假手術(shù)組正常對(duì)照組實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)NR2B的表達(dá)免疫組化檢測(cè)NR2B的表達(dá)及分布自發(fā)痛行為觀察機(jī)械性觸誘發(fā)痛WesternBlot檢測(cè)NR2B的表達(dá)選用清潔級(jí)雄性C57BL/6小鼠癌痛組一般情況觀察行為學(xué)測(cè)定選用清潔級(jí)雄性C57BL/6小鼠癌痛組一般情況觀察行為學(xué)測(cè)定內(nèi)容3技術(shù)路線干擾組干擾對(duì)照組實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)NR2B的表達(dá)自發(fā)痛行為觀察機(jī)械性觸誘發(fā)痛WesternBlot檢測(cè)NR2B的表達(dá)選用清潔級(jí)雄性C57BL/6小鼠癌痛組一般情況觀察行為學(xué)測(cè)定選用清潔級(jí)雄性C57BL/6小鼠正常組一般情況觀察行為學(xué)測(cè)定內(nèi)容4技術(shù)路線干擾組干擾對(duì)照組實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)NR2B、SP、c-fos和GFAP基因的表達(dá)自發(fā)痛行為觀察機(jī)械性觸誘發(fā)痛WesternBlot檢測(cè)NR2B，p-ERK，p-p38和GFAP的表達(dá)癌痛組選用清潔級(jí)雄性C57BL/6小鼠正常組一般情況觀察行為學(xué)測(cè)定結(jié)果結(jié)果體重和一般狀況

圖1：觀察期內(nèi)各組小鼠體重的變化體重和一般狀況圖1：觀察期內(nèi)各組小2.行為學(xué)測(cè)試

圖2：自發(fā)痛行為觀察圖3：機(jī)械性觸誘發(fā)痛測(cè)定2.行為學(xué)測(cè)試圖2：自發(fā)痛行為觀察

3.放射學(xué)檢測(cè)圖4：模型組小鼠不同時(shí)間段術(shù)側(cè)股骨X片結(jié)果:A為腫瘤細(xì)胞接種前攝片；B為接種后第7天；

C為接種后第15天；D為接種后第23天。3.放射學(xué)檢測(cè)圖4：模型組小鼠不同時(shí)間段術(shù)側(cè)股骨X片結(jié)組織學(xué)觀察

骨髓腔內(nèi)可見(jiàn)較多腫瘤細(xì)胞骨髓腔內(nèi)大量腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)且骨小梁破壞腫瘤細(xì)胞侵犯周圍肌肉骨髓腔破壞，腫瘤細(xì)胞穿破骨組織A:接種第7天模型組小鼠股骨切片B:接種第15天模型組小鼠股骨切片C:1接種第23天模型組小鼠股骨切片C2:接種第23天模型組小鼠股骨周圍肌肉組織病檢結(jié)果圖6：模型組小鼠術(shù)側(cè)股骨下段不同時(shí)間段的HE染色（HE×400）組織學(xué)觀察骨髓腔內(nèi)可見(jiàn)較多腫瘤細(xì)胞骨髓腔內(nèi)大量腫瘤細(xì)▽行為學(xué)、放射學(xué)、組織學(xué)三方面證實(shí)：C57BL/6小鼠股骨骨髓腔接種Lewis肺癌細(xì)胞，能成功制備小鼠骨癌痛模型，且此模型穩(wěn)定、重復(fù)性好，與人類骨癌痛高度相似。▽本研究我們首次選用來(lái)源廣泛、致瘤作用強(qiáng)的Lewis肺癌細(xì)胞，接種于C57BL/6小鼠股骨骨髓腔，建立了一個(gè)新的小鼠骨癌痛模型。▽行為學(xué)、放射學(xué)、組織學(xué)三方面證實(shí)：▽本研究我們首次選用來(lái)5、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)前扣帶回和脊髓NR2B的表達(dá)前扣帶回NR2B的表達(dá)前腦扣帶回NR2BmRNA相對(duì)表達(dá)量5、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)前扣帶回和脊髓NR2B的表達(dá)前扣帶脊髓NR2B的表達(dá)圖5：脊髓NR2BmRNA相對(duì)表達(dá)量脊髓NR2B的表達(dá)圖5：脊髓NR2BmRNA相對(duì)表達(dá)量第14天前扣帶回NR2B的表達(dá)

A癌痛組前扣帶回100倍；B癌痛組前扣帶回區(qū)域200倍

C正常組前扣帶回100倍；D正常組前扣帶回區(qū)域200倍

E假手術(shù)組前扣帶回100倍；F假手術(shù)組前扣帶回區(qū)域200倍6、免疫組化檢測(cè)前扣帶回和脊髓NR2B的表達(dá)前腦扣帶回NR2B的表達(dá)第14天前扣帶回NR2B的表達(dá)6、免疫組化檢測(cè)前扣帶回和脊L4-L6脊髓NR2B的表達(dá)L4-L6脊髓NR2B的表達(dá)（200倍）術(shù)后第14天，L4-L6脊髓NR2B的表達(dá)術(shù)后第18天，L4-L6脊髓NR2B的表達(dá)癌痛組假手術(shù)組正常組癌痛組假手術(shù)組正常組L4-L6脊髓NR2B的表達(dá)L4-L6脊髓NR2B的表達(dá)（L4-L6脊髓NR2B的分布

癌痛組正常組假手術(shù)組

L4-L6脊髓NR2B的分布（接種后14天）脊髓各層NR2B表達(dá)量在中央導(dǎo)水管、背角淺層、前角依次增多L4-L6脊髓NR2B的分布L4-L6脊髓7、WesternBlot檢測(cè)L4-6段脊髓NR2B的表達(dá)*

術(shù)后第14天各組小鼠脊髓NR2B術(shù)后第18天各組小鼠脊髓NR2B的表達(dá)，A:癌痛組B:假手術(shù)組C:正常組的表達(dá)，A:癌痛組B:假手術(shù)組C:正常組*7、WesternBlot檢測(cè)L4-6段脊髓NR2B的表達(dá)

1、癌痛組小鼠脊髓和前扣帶回中NR2B表達(dá)均明顯增加，脊髓各層表達(dá)量由大到小依次為前角、背角淺層、中央導(dǎo)水管周圍；且癌痛組NR2B表達(dá)上調(diào)的同時(shí)，疼痛行為學(xué)也有相應(yīng)的改變。初步表明脊髓和前扣帶回中的NR2B表達(dá)增加與小鼠骨癌痛產(chǎn)生和維持存在一定相關(guān)性。

2、同一癌痛模型中觀察到NR2B在脊髓和前扣帶回同時(shí)高表達(dá)，提示在癌痛的產(chǎn)生和維持中不僅激活了脊髓低位中樞，而且有腦部中樞的參與。

3、本研究初次發(fā)現(xiàn)NR2B在脊髓前角細(xì)胞表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性，為下一步研究提供了新的思路。1、癌痛組小鼠脊髓和前扣帶回中NR2B表達(dá)均明圖3：癌痛組、干擾組和干擾對(duì)照組小鼠脊髓NR2BmRNA的相對(duì)表達(dá)量8、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)小鼠脊髓L4-6節(jié)段NR2B的表達(dá)圖3：癌痛組、干擾組和干擾對(duì)照組小鼠脊髓NR2BmRNA的相9、WesternBlot檢測(cè)小鼠脊髓L4-6節(jié)段NR2B的表達(dá)

WesternBlot檢測(cè)接種術(shù)后第14天小鼠脊髓L4-6節(jié)段NR2B的表達(dá)

A:干擾組；B:干擾對(duì)照組；C:癌痛組NR2BGAPDHABC*

WesternBlot檢測(cè)接種術(shù)后第18天小鼠脊髓L4-6節(jié)段NR2B的表達(dá)

A:干擾組；B:干擾對(duì)照組；C:癌痛組NR2BGAPDH*9、WesternBlot檢測(cè)小鼠脊髓L4-6節(jié)段NR2B1、PEI/NR2B-siRNA復(fù)合物鞘內(nèi)注射后能使骨癌痛小鼠脊髓中NR2B的表達(dá)下調(diào)；2、骨癌痛小鼠脊髓中NR2B的表達(dá)下調(diào)與小鼠疼痛行為學(xué)減輕相一致，進(jìn)一步證明NR2B在癌痛發(fā)生過(guò)程中起重要作用，可能是癌痛治療的有效靶點(diǎn)。1、PEI/NR2B-siRNA復(fù)合物鞘內(nèi)注射后能使骨癌痛10、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)小鼠脊髓NR2B、SP、

c-fos和GFAP基因的表達(dá)接種術(shù)后第14天，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組小鼠脊髓NR2B、SP、GFAP、c-fos的相對(duì)表達(dá)量注：圖示中NR2B組放大100倍，c-fos放大10倍10、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)小鼠脊髓NR2B、SP、接種術(shù)后11、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)小鼠脊髓NR2B、SP、

c-fos和GFAP基因的表達(dá)接種術(shù)后第18天，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組小鼠脊髓NR2B、SP、GFAP、c-fos的相對(duì)表達(dá)量注：圖示中NR2B和c-fos組均放大100倍11、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)小鼠脊髓NR2B、SP、接種術(shù)后

圖5：WesternBlot檢測(cè)接種術(shù)后第18天小鼠脊髓NR2B的表達(dá)

A:正常組；B:癌痛組；C:干擾組；D:干擾對(duì)照組*圖6：WesternBlot檢測(cè)接種術(shù)后第14天小鼠脊髓p-ERK的表達(dá)A:正常組；B:癌痛組；C:干擾組；D:干擾對(duì)照組3.1接種術(shù)后第14天，檢測(cè)NR2B和p-ERK蛋白表達(dá)

NR2B

GAPDHp-ERKGAPDH*12、WesternBlot檢測(cè)接種術(shù)后第14天小鼠脊髓的NR2B，p-ERK，p-p38和GFAP蛋白表達(dá)圖5：WesternBlot檢測(cè)接種術(shù)

WesternBlot檢測(cè)接種術(shù)后第14天小鼠脊髓p-p38的表達(dá)

A:正常組；B:癌痛組；C:干擾組；D:干擾對(duì)照組*WesternBlot檢測(cè)接種術(shù)后第14天小鼠脊髓GFAP的表達(dá)A:正常組；B:癌痛組；C:干擾組；D:干擾對(duì)照組*13、接種術(shù)后第14天，檢測(cè)p-p38和GFAP蛋白表達(dá)GAPDHGFAP

GAPDHWesternBlot檢測(cè)接種術(shù)后第14天*WWesternBlot檢測(cè)接種術(shù)后第18天小鼠脊髓NR2B的表達(dá)

A:正常組；B:癌痛組；C:干擾組；D:干擾對(duì)照組WesternBlot檢測(cè)接種術(shù)后第18天小鼠脊髓p-ERK的表達(dá)A:正常組；B:癌痛組；C:干擾組；D:干擾對(duì)照組

接種術(shù)后第18天，檢測(cè)NR2B和p-ERK蛋白表達(dá)14、WesternBlot檢測(cè)接種術(shù)后第18天小鼠脊髓的NR2B，p-ERK，p-p38和GFAP蛋白表達(dá)NR2BGAPDH

p-ERK

GAPDH**WesternBlot檢測(cè)接種術(shù)后第18天WesternWesternBlot檢測(cè)接種術(shù)后第18天小鼠脊髓p-p38的表達(dá)

A:正常組；B:癌痛組；C:干擾組；D:干擾對(duì)照組WesternBlot檢測(cè)接種術(shù)后第18天小鼠脊髓GFAP的表達(dá)A:正常組；B:癌痛組；C:干擾組；D:干擾對(duì)照組接種術(shù)后第18天，檢測(cè)p-p38和GFAP蛋白表達(dá)

p-p38

GAPDH

GFAP

GAPDH**WesternBlot檢測(cè)接種術(shù)后第18天Western1）癌痛小鼠的MAPK通路中相應(yīng)信號(hào)分子p-ERK、p-p38、c-fos表達(dá)明顯上調(diào)；而NR2B的沉默可以下調(diào)MAPK通路中相應(yīng)信號(hào)分子p-ERK、p-p38、c-fos表達(dá)；2）GFAP在癌痛小鼠中高表達(dá)，同時(shí)NR2B的調(diào)控可以影響GFAP的表達(dá)；1）癌痛小鼠的MAPK通路中相應(yīng)信號(hào)分子p-ERK、p-p3解除Mg2+對(duì)NMDA受體離子通道的阻斷作用結(jié)合到突觸后膜上配體門(mén)控離子型谷氨酸受體—AMPA受體，Na+內(nèi)流NMDA受體激活，Ca2+內(nèi)流增加激活ERK，p38c-fos轉(zhuǎn)錄因子激活NR2B表達(dá)傷害性信號(hào)傳入脊髓背角，釋放大量谷氨酸SP表達(dá)神經(jīng)元下游相關(guān)基因表達(dá)變化神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞GFAP表達(dá)結(jié)合到膠質(zhì)細(xì)胞上AMPA受體激活ERK，p38直接導(dǎo)致膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的GFAP大量表達(dá)導(dǎo)致癌痛我們推測(cè)癌痛產(chǎn)生的可能機(jī)制因此，解除Mg2+對(duì)NMDA受體離子通道的阻斷作用結(jié)合到突觸后膜NR2B在小鼠骨癌痛中的作用及機(jī)制研究課件結(jié)論1.C57BL/6小鼠股骨骨髓腔接種Lewis肺癌細(xì)胞能成功制備小鼠骨癌痛新模型，此模型與人類骨癌痛具有相似性；2.NR2B在小鼠骨癌痛模型中呈高表達(dá)，且同一癌痛模型中觀察到NR2B在L4-L6段脊髓和前扣帶回同時(shí)高表達(dá)，提示在癌痛的產(chǎn)生和維持中不僅激活了脊髓低位中樞，而且有腦部中樞參與；3.本研究初次發(fā)現(xiàn)NR2B在癌痛模型的L4-6段脊髓前角細(xì)胞表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性，為下一步研究提供了新的思路；結(jié)論1.C57BL/6小鼠股骨骨髓腔接種Lewis肺癌細(xì)結(jié)論4.PEI/NR2B-siRNA復(fù)合物能特異性的使骨癌痛小鼠脊髓NR2B的表達(dá)明顯下調(diào)；其表達(dá)下調(diào)與小鼠疼痛行為學(xué)減輕相一致，進(jìn)一步證明NR2B在骨癌痛發(fā)生過(guò)程中起重要作用；5.MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路（ERK通路和p38通路）在骨癌痛小鼠模型中被激活；NR2B參與了MAPK信號(hào)通路介導(dǎo)的骨癌痛的中樞敏化；6.NR2B參與介導(dǎo)的骨癌痛可能與GFAP的過(guò)表達(dá)相關(guān)，其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。結(jié)論4.PEI/NR2B-siRNA復(fù)合物能特異性的使骨

NR2B在小鼠骨癌痛中的作用及機(jī)制研究

中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院黃東教授

NR2B在小鼠骨癌痛中的作用及機(jī)制研究課件

※目前，全球癌癥患者的數(shù)量呈＊骨癌痛的具體機(jī)制※癌性疼痛成為影響癌癥病人生活質(zhì)量的一個(gè)嚴(yán)重問(wèn)題。※在癌痛中又以骨癌痛最為嚴(yán)重和最難以控制。?研究背景※目前，全球癌癥患者的數(shù)量呈＊骨癌痛的具體機(jī)制癌痛的特點(diǎn):臨床上，癌痛表現(xiàn)為進(jìn)行性加重，常伴隨有爆發(fā)痛；癌痛與炎性痛和神經(jīng)病理性痛存在著不同的外周和中樞機(jī)制[1]

。如癌痛：膠質(zhì)細(xì)胞增生肥大；GFAP

[1]:

HonoreP.Neuroscience,2000,98:585–598.癌痛的特點(diǎn):臨床上，癌痛表現(xiàn)為進(jìn)行性加重，常伴隨有爆發(fā)痛；★

NMDA受體活化是反復(fù)傷害性刺激誘發(fā)中樞敏化的基礎(chǔ)，是持續(xù)性疼痛產(chǎn)生和維持的關(guān)鍵[2]

?！锎罅垦芯孔C實(shí)：NMDA受體的亞基NR2B在炎性痛、神經(jīng)病理痛中參與了傷害性信息傳遞，在疼痛調(diào)制及痛覺(jué)敏化的形成和維持中發(fā)揮重要作用[3]

。疼痛研究進(jìn)展[2]:

Petrenko.AnesthAnalg.2003,97(4):1108-1116.[3]:NagyGG.EurJNeurosci,2004,20(12):3301-3312.（一）★NMDA受體活化是反復(fù)傷害性刺激誘發(fā)中樞敏化疼痛研究進(jìn)展★

研究顯示，MAPK信號(hào)通路在神經(jīng)可塑性和炎癥反應(yīng)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中起重要作用[4]

?！镌錾蚀蟮男切文z質(zhì)細(xì)胞能釋放大量膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP），骨癌痛的產(chǎn)生和維持與脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的變化密切相關(guān)[1]

。[4]:

DeLeoJA.Pain,2006,122(122):17221.

疼痛研究進(jìn)展（二）★研究顯示，MAPK信號(hào)通路在神經(jīng)可塑性和炎癥[4]:研究癌痛的確切機(jī)制，需要適當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型，現(xiàn)有動(dòng)物模型仍顯不足。小鼠骨癌痛模型的優(yōu)勢(shì)■肺癌是臨床骨轉(zhuǎn)移較多見(jiàn)的一種腫瘤，且小鼠在腫瘤學(xué)及神經(jīng)系統(tǒng)研究方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)?！鲂∈笞鳛閷?shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，較經(jīng)濟(jì)適用■本實(shí)驗(yàn)參照Schwei等的方法，將Lewis肺癌細(xì)胞接種于C57BL/6小鼠股骨骨髓腔，建立一個(gè)全新的骨癌痛模型。研究癌痛的確切機(jī)制，需要適當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型，現(xiàn)有動(dòng)物模型仍顯不足我們從如下四個(gè)方面加以研究：1、建立一個(gè)小鼠骨癌痛新模型2、NR2B在骨癌痛小鼠前扣帶回和脊髓中的分布與表達(dá)3、脊髓NR2B基因沉默對(duì)小鼠骨癌痛的影響4、MAPK信號(hào)通路介導(dǎo)的NR2B在小鼠骨癌痛中的作用機(jī)制NR2B是否也參與骨癌痛的發(fā)生機(jī)制呢？我們從如下四個(gè)方面加以研究：NR2B是否也參與骨癌痛的發(fā)生機(jī)實(shí)施方案：◆檢測(cè)癌痛小鼠脊髓和前扣帶回NR2B的表達(dá)和分布，分析小鼠NR2B的表達(dá)和小鼠疼痛行為學(xué)關(guān)系。◆應(yīng)用RNA干擾技術(shù)，沉默骨癌痛小鼠NR2B基因；通過(guò)對(duì)比干擾組小鼠與癌痛組小鼠NR2B的表達(dá)以及兩組小鼠疼痛行為學(xué)，從而闡明NR2B是否在癌痛的發(fā)生與維持中起重要作用。實(shí)施方案：◆對(duì)比骨癌痛小鼠NR2B基因沉默前后，MAPK信號(hào)通路及其介導(dǎo)的下游信號(hào)分子表達(dá)的相應(yīng)改變；◆研究MAPK信號(hào)通路中信號(hào)分子表達(dá)的相應(yīng)改變與GFAP的關(guān)聯(lián)性；▲探索MAPK信號(hào)通路在小鼠骨癌痛中的可能作用機(jī)制。NR2B是怎樣參與骨癌痛的發(fā)生機(jī)制呢？◆對(duì)比骨癌痛小鼠NR2B基因沉默前后，MAPK信號(hào)通路及其選用清潔級(jí)雄性C57BL/6小鼠模型組一般情況觀察行為學(xué)測(cè)定內(nèi)容1技術(shù)路線熱滅活組PBS組正常對(duì)照組放射學(xué)檢查組織學(xué)檢測(cè)自發(fā)痛行為觀察機(jī)械性觸誘發(fā)痛選用清潔級(jí)雄性C57BL/6小鼠模型組一般情況觀察行為學(xué)測(cè)定選用清潔級(jí)雄性C57BL/6小鼠癌痛組一般情況觀察行為學(xué)測(cè)定內(nèi)容2技術(shù)路線假手術(shù)組正常對(duì)照組實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)NR2B的表達(dá)免疫組化檢測(cè)NR2B的表達(dá)及分布自發(fā)痛行為觀察機(jī)械性觸誘發(fā)痛WesternBlot檢測(cè)NR2B的表達(dá)選用清潔級(jí)雄性C57BL/6小鼠癌痛組一般情況觀察行為學(xué)測(cè)定選用清潔級(jí)雄性C57BL/6小鼠癌痛組一般情況觀察行為學(xué)測(cè)定內(nèi)容3技術(shù)路線干擾組干擾對(duì)照組實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)NR2B的表達(dá)自發(fā)痛行為觀察機(jī)械性觸誘發(fā)痛WesternBlot檢測(cè)NR2B的表達(dá)選用清潔級(jí)雄性C57BL/6小鼠癌痛組一般情況觀察行為學(xué)測(cè)定選用清潔級(jí)雄性C57BL/6小鼠正常組一般情況觀察行為學(xué)測(cè)定內(nèi)容4技術(shù)路線干擾組干擾對(duì)照組實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)NR2B、SP、c-fos和GFAP基因的表達(dá)自發(fā)痛行為觀察機(jī)械性觸誘發(fā)痛WesternBlot檢測(cè)NR2B，p-ERK，p-p38和GFAP的表達(dá)癌痛組選用清潔級(jí)雄性C57BL/6小鼠正常組一般情況觀察行為學(xué)測(cè)定結(jié)果結(jié)果體重和一般狀況

圖1：觀察期內(nèi)各組小鼠體重的變化體重和一般狀況圖1：觀察期內(nèi)各組小2.行為學(xué)測(cè)試

圖2：自發(fā)痛行為觀察圖3：機(jī)械性觸誘發(fā)痛測(cè)定2.行為學(xué)測(cè)試圖2：自發(fā)痛行為觀察

3.放射學(xué)檢測(cè)圖4：模型組小鼠不同時(shí)間段術(shù)側(cè)股骨X片結(jié)果:A為腫瘤細(xì)胞接種前攝片；B為接種后第7天；

C為接種后第15天；D為接種后第23天。3.放射學(xué)檢測(cè)圖4：模型組小鼠不同時(shí)間段術(shù)側(cè)股骨X片結(jié)組織學(xué)觀察

骨髓腔內(nèi)可見(jiàn)較多腫瘤細(xì)胞骨髓腔內(nèi)大量腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)且骨小梁破壞腫瘤細(xì)胞侵犯周圍肌肉骨髓腔破壞，腫瘤細(xì)胞穿破骨組織A:接種第7天模型組小鼠股骨切片B:接種第15天模型組小鼠股骨切片C:1接種第23天模型組小鼠股骨切片C2:接種第23天模型組小鼠股骨周圍肌肉組織病檢結(jié)果圖6：模型組小鼠術(shù)側(cè)股骨下段不同時(shí)間段的HE染色（HE×400）組織學(xué)觀察骨髓腔內(nèi)可見(jiàn)較多腫瘤細(xì)胞骨髓腔內(nèi)大量腫瘤細(xì)▽行為學(xué)、放射學(xué)、組織學(xué)三方面證實(shí)：C57BL/6小鼠股骨骨髓腔接種Lewis肺癌細(xì)胞，能成功制備小鼠骨癌痛模型，且此模型穩(wěn)定、重復(fù)性好，與人類骨癌痛高度相似。▽本研究我們首次選用來(lái)源廣泛、致瘤作用強(qiáng)的Lewis肺癌細(xì)胞，接種于C57BL/6小鼠股骨骨髓腔，建立了一個(gè)新的小鼠骨癌痛模型。▽行為學(xué)、放射學(xué)、組織學(xué)三方面證實(shí)：▽本研究我們首次選用來(lái)5、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)前扣帶回和脊髓NR2B的表達(dá)前扣帶回NR2B的表達(dá)前腦扣帶回NR2BmRNA相對(duì)表達(dá)量5、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)前扣帶回和脊髓NR2B的表達(dá)前扣帶脊髓NR2B的表達(dá)圖5：脊髓NR2BmRNA相對(duì)表達(dá)量脊髓NR2B的表達(dá)圖5：脊髓NR2BmRNA相對(duì)表達(dá)量第14天前扣帶回NR2B的表達(dá)

A癌痛組前扣帶回100倍；B癌痛組前扣帶回區(qū)域200倍

C正常組前扣帶回100倍；D正常組前扣帶回區(qū)域200倍

E假手術(shù)組前扣帶回100倍；F假手術(shù)組前扣帶回區(qū)域200倍6、免疫組化檢測(cè)前扣帶回和脊髓NR2B的表達(dá)前腦扣帶回NR2B的表達(dá)第14天前扣帶回NR2B的表達(dá)6、免疫組化檢測(cè)前扣帶回和脊L4-L6脊髓NR2B的表達(dá)L4-L6脊髓NR2B的表達(dá)（200倍）術(shù)后第14天，L4-L6脊髓NR2B的表達(dá)術(shù)后第18天，L4-L6脊髓NR2B的表達(dá)癌痛組假手術(shù)組正常組癌痛組假手術(shù)組正常組L4-L6脊髓NR2B的表達(dá)L4-L6脊髓NR2B的表達(dá)（L4-L6脊髓NR2B的分布

癌痛組正常組假手術(shù)組

L4-L6脊髓NR2B的分布（接種后14天）脊髓各層NR2B表達(dá)量在中央導(dǎo)水管、背角淺層、前角依次增多L4-L6脊髓NR2B的分布L4-L6脊髓7、WesternBlot檢測(cè)L4-6段脊髓NR2B的表達(dá)*

術(shù)后第14天各組小鼠脊髓NR2B術(shù)后第18天各組小鼠脊髓NR2B的表達(dá)，A:癌痛組B:假手術(shù)組C:正常組的表達(dá)，A:癌痛組B:假手術(shù)組C:正常組*7、WesternBlot檢測(cè)L4-6段脊髓NR2B的表達(dá)

1、癌痛組小鼠脊髓和前扣帶回中NR2B表達(dá)均明顯增加，脊髓各層表達(dá)量由大到小依次為前角、背角淺層、中央導(dǎo)水管周圍；且癌痛組NR2B表達(dá)上調(diào)的同時(shí)，疼痛行為學(xué)也有相應(yīng)的改變。初步表明脊髓和前扣帶回中的NR2B表達(dá)增加與小鼠骨癌痛產(chǎn)生和維持存在一定相關(guān)性。

2、同一癌痛模型中觀察到NR2B在脊髓和前扣帶回同時(shí)高表達(dá)，提示在癌痛的產(chǎn)生和維持中不僅激活了脊髓低位中樞，而且有腦部中樞的參與。

3、本研究初次發(fā)現(xiàn)NR2B在脊髓前角細(xì)胞表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性，為下一步研究提供了新的思路。1、癌痛組小鼠脊髓和前扣帶回中NR2B表達(dá)均明圖3：癌痛組、干擾組和干擾對(duì)照組小鼠脊髓NR2BmRNA的相對(duì)表達(dá)量8、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)小鼠脊髓L4-6節(jié)段NR2B的表達(dá)圖3：癌痛組、干擾組和干擾對(duì)照組小鼠脊髓NR2BmRNA的相9、WesternBlot檢測(cè)小鼠脊髓L4-6節(jié)段NR2B的表達(dá)

WesternBlot檢測(cè)接種術(shù)后第14天小鼠脊髓L4-6節(jié)段NR2B的表達(dá)

A:干擾組；B:干擾對(duì)照組；C:癌痛組NR2BGAPDHABC*

WesternBlot檢測(cè)接種術(shù)后第18天小鼠脊髓L4-6節(jié)段NR2B的表達(dá)

A:干擾組；B:干擾對(duì)照組；C:癌痛組NR2BGAPDH*9、WesternBlot檢測(cè)小鼠脊髓L4-6節(jié)段NR2B1、PEI/NR2B-siRNA復(fù)合物鞘內(nèi)注射后能使骨癌痛小鼠脊髓中NR2B的表達(dá)下調(diào)；2、骨癌痛小鼠脊髓中NR2B的表達(dá)下調(diào)與小鼠疼痛行為學(xué)減輕相一致，進(jìn)一步證明NR2B在癌痛發(fā)生過(guò)程中起重要作用，可能是癌痛治療的有效靶點(diǎn)。1、PEI/NR2B-siRNA復(fù)合物鞘內(nèi)注射后能使骨癌痛10、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)小鼠脊髓NR2B、SP、

c-fos和GFAP基因的表達(dá)接種術(shù)后第14天，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組小鼠脊髓NR2B、SP、GFAP、c-fos的相對(duì)表達(dá)量注：圖示中NR2B組放大100倍，c-fos放大10倍10、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)小鼠脊髓NR2B、SP、接種術(shù)后11、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)小鼠脊髓NR2B、SP、

c-fos和GFAP基因的表達(dá)接種術(shù)后第18天，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組小鼠脊髓NR2B、SP、GFAP、c-fos的相對(duì)表達(dá)量注：圖示中NR2B和c-fos組均放大100倍11、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)小鼠脊髓NR2B、SP、接種術(shù)后

圖5：WesternBlot檢測(cè)接種術(shù)后第18天小鼠脊髓NR2B的表達(dá)

A:正常組；B:癌痛組；C:干擾組；D:干擾對(duì)照組*圖6：WesternBlot檢測(cè)接種術(shù)后第14天小鼠脊髓p-ERK的表達(dá)A:正常組；B:癌痛組；C:干擾組；D:干擾對(duì)照組3.1接種術(shù)后第14天，檢測(cè)NR2B和p-ERK蛋白表達(dá)

NR2B

GAPDHp-ERKGAPDH*12、WesternBlot檢測(cè)接種術(shù)后第14天小鼠脊髓的NR2B，p-ERK，p-p38和GFAP蛋白表達(dá)圖5：WesternBlot檢測(cè)接種術(shù)

WesternBlot檢測(cè)接種術(shù)后第14天小鼠脊髓p-p38的表達(dá)

A:正常組；B:癌痛組；C:干擾組；D:干擾對(duì)照組*WesternBlot檢測(cè)接種術(shù)后第14天小鼠脊髓GFAP的表達(dá)A:正常組；B:癌痛組；C:干擾組；D:干擾對(duì)照組*13、接種術(shù)后第14天，檢測(cè)p-p38和GFAP蛋白表達(dá)GAPDHGFAP

GAPDHWesternBlot檢測(cè)接種術(shù)后第14天*WWesternBlot檢測(cè)接種術(shù)后第18天小鼠脊髓NR2B的表達(dá)

A:正常組；B:癌痛組；C:干擾組；D