細(xì)胞工程第一章2014課件

細(xì)胞工程

第一章細(xì)胞培養(yǎng)的設(shè)施與基本條件1.1動(dòng)物細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室的設(shè)置1.無(wú)菌操作室2.培養(yǎng)與觀察室3.制備室4.儲(chǔ)藏室5.清洗與滅菌室1、無(wú)菌實(shí)驗(yàn)室無(wú)菌實(shí)驗(yàn)室或操作室的設(shè)計(jì)原則是，有防止微生物污染和有害因素的影響措施，要求工作環(huán)境清潔、空氣清新、干燥和無(wú)煙塵。無(wú)菌實(shí)驗(yàn)室最好能單獨(dú)設(shè)置。如果條件有限，只能限制在一個(gè)大實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，應(yīng)劃分不同的功能區(qū)或用鋁合金隔板隔開(kāi)，將無(wú)菌操作室與清洗、消毒滅菌區(qū)、制備、儲(chǔ)藏和孵育區(qū)分開(kāi)。根據(jù)體外培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)特點(diǎn)和條件，擁有一個(gè)無(wú)菌實(shí)驗(yàn)室、一臺(tái)超凈工作臺(tái)和一個(gè)恒溫培養(yǎng)箱是細(xì)胞培養(yǎng)的三大必備設(shè)施。如果條件有限，僅做一般要求的細(xì)胞培養(yǎng)，在相對(duì)狹小的空間內(nèi)，只設(shè)置凈化臺(tái)而不設(shè)操作室。但要注意季節(jié)氣候環(huán)境的影響和注意無(wú)菌操作環(huán)節(jié)。做要求較高的細(xì)胞培養(yǎng)，最好設(shè)置無(wú)菌操作室，有條件的應(yīng)設(shè)凈化工作室，以避免季節(jié)影響和杜絕污染。墻壁應(yīng)光滑無(wú)死角，以便清洗和消毒。工作臺(tái)不應(yīng)緊靠墻壁放置，臺(tái)面漆成白色或灰色，以利于解剖組織及酚紅顯示pH的觀察。若能購(gòu)置超凈工作臺(tái)則更好。無(wú)菌操作間應(yīng)為密閉式，設(shè)置空氣消毒用的紫外線燈、空氣過(guò)濾凈化器和恒溫裝置。

目前大多數(shù)從事細(xì)胞培養(yǎng)工作的實(shí)驗(yàn)室都已裝備了超凈工作臺(tái)。這種工作臺(tái)占據(jù)空間小，安裝方便，操作簡(jiǎn)單，投資少，效果不比無(wú)菌操作室差，即使不設(shè)置單獨(dú)的無(wú)菌實(shí)驗(yàn)室，只要購(gòu)置安裝了超凈工作臺(tái)，也能進(jìn)行簡(jiǎn)單的細(xì)胞培養(yǎng)工作。2、超凈工作臺(tái)它們的基本工作原理大同小異：內(nèi)設(shè)鼓風(fēng)機(jī)，驅(qū)動(dòng)空氣通過(guò)高效濾器過(guò)濾凈化后，讓凈化空氣徐徐通過(guò)臺(tái)面空間，使操作區(qū)構(gòu)成無(wú)菌環(huán)境。超凈工作臺(tái)種類繁多，但主要有三大類：一類是側(cè)流式；第二類為直流式；第三類為外流式，或稱為水平層流式。這三類工作臺(tái)各有利弊。側(cè)流式和直流式能形成氣流屏而保持操作臺(tái)無(wú)菌，但在凈化氣流和外界氣體交界處可因氣流的流動(dòng)形成負(fù)壓，使少許未凈化氣體混入，有可能發(fā)生污染，尤其在多雨季節(jié)的南方，會(huì)增加污染機(jī)會(huì)。它們的區(qū)別在于氣流的方向不同，側(cè)流式即凈化后氣流由左側(cè)或右側(cè)通過(guò)臺(tái)面流向?qū)?cè)；直流式為氣流從上向下或從下向上流動(dòng)；外流式為氣流向操作者方向吹來(lái)。

（2）久未使用的工作臺(tái)在使用前應(yīng)進(jìn)行徹底清洗、消毒滅菌。用1:1000的來(lái)蘇兒或75%的酒精擦洗臺(tái)面，濾器械的灰塵可用真空吸塵器清除。停止使用時(shí)最好用作防塵布或塑料布套好，避免灰塵積聚。超凈工作臺(tái)作為一種設(shè)備也需要維護(hù)和保養(yǎng)，才能延長(zhǎng)其使用壽命。一般應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：（1）超凈工作臺(tái)一般宜安裝在避免日光直射、清潔無(wú)塵的房間內(nèi)。若能放在無(wú)菌操作區(qū)內(nèi)則更佳，不僅效果好，而且濾器（料）的使用壽命長(zhǎng)。用于細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)箱分變通電熱恒溫培養(yǎng)箱和CO2培養(yǎng)箱。溫控變化一般不超過(guò)±0.5℃,最適溫度為37℃。因此要求培養(yǎng)箱具有較高的靈敏度?？販匮b置的優(yōu)劣是電熱恒溫箱質(zhì)量的關(guān)鍵，選購(gòu)時(shí)一定要注意。一般選購(gòu)隔水式或晶體管式控溫培養(yǎng)箱，適用于封閉式的培養(yǎng)。3、恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)除了上述三大設(shè)備外，還需配備電熱干燥箱、冰箱、水純化裝置、普通光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡、細(xì)胞液氮儲(chǔ)存器、離心機(jī)、消毒器、抽濾裝置等。4、其他設(shè)備冰箱：一般用雙門冰箱，既有4℃左右的冷藏區(qū)，又有-20℃以下的冷凍區(qū)。如條件許可，應(yīng)有一臺(tái)普通冷藏冰箱和一臺(tái)低溫冰箱（<-70℃）。前者主要用于儲(chǔ)存培養(yǎng)液、生理鹽水、Hanks液、試劑等培養(yǎng)用的物品和短期保存的組織標(biāo)本。后者用于保存需較長(zhǎng)時(shí)間存放的制劑，如酶、血清和組織標(biāo)本等。冰箱應(yīng)保持清潔，防止污染。禁止存放有毒、易燃、易揮發(fā)物品。1.電熱干燥箱：主要用于烘干熱消毒玻璃器皿，也可用于干熱消毒。在用于干熱消毒時(shí)，溫度一般要求達(dá)到160℃(滅菌)或180℃(去除熱原)，消毒時(shí)間須在2h以上。細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室常用的干燥箱為鼓風(fēng)式電熱干燥箱（規(guī)格為5605mm×500mm×500mm），雖然升溫較慢，但溫度均勻，效果較好。鼓風(fēng)與升溫同時(shí)開(kāi)始，待溫度達(dá)100℃后再打開(kāi)，以避免玻璃器皿突然遇冷而炸裂損壞。金屬解剖器械、塑料制品、橡膠制品等不能放在干燥箱內(nèi)滅菌。2.水純化裝置：這也是細(xì)胞培養(yǎng)不可缺少的設(shè)備。因?yàn)轶w外培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)水的要求較高，無(wú)論是細(xì)胞培養(yǎng)液還是配試劑等都應(yīng)使用兩次以上蒸餾的雙蒸水。離子交換裝置處理的水因?yàn)椴荒芡耆コ袡C(jī)物而極少應(yīng)用。外售蒸餾水常用金屬器蒸餾，易混入金屬離子，須用玻璃蒸餾器重新蒸餾一次后才能使用。目前國(guó)內(nèi)普通使用的是自動(dòng)雙重純水蒸餾器(碳管加熱)，較為安全、方便、蒸餾速度也較快，但不宜直接用自來(lái)水蒸餾。配制培養(yǎng)液的水應(yīng)用配液前蒸餾的新鮮三蒸水。顯微鏡：應(yīng)有一臺(tái)普通顯微鏡和一臺(tái)倒置顯微鏡。前者用于細(xì)胞計(jì)數(shù)和一般觀察，后者用于觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況和有無(wú)污染。若條件許可，應(yīng)配置照相系統(tǒng)和熒光顯微鏡。離心機(jī)：一般應(yīng)配有普通離心機(jī)，最好應(yīng)配置高速冷凍離心機(jī)。普通離心機(jī)轉(zhuǎn)速在4000r/min以下，臺(tái)式的就可滿足要求。用于制備細(xì)胞懸液、漂洗、分離細(xì)胞。若開(kāi)展細(xì)胞脫核、DNA和RNA抽提、組織勻漿等研究，需使用高速、大容量和能進(jìn)行調(diào)溫的離心機(jī)。3.細(xì)胞冷凍貯存器：主要是液氮容器。國(guó)產(chǎn)的能滿足要求。容積大小根據(jù)實(shí)驗(yàn)室需求選購(gòu)。一般小實(shí)驗(yàn)室用35L3的，大實(shí)驗(yàn)室，多可購(gòu)50L的。窄頸瓶維持液氮時(shí)間長(zhǎng)（1月左右），但存取不方便。寬頸瓶存取方便，但維持液氮時(shí)間短（7-10天）。定期加液氮的時(shí)間可據(jù)此來(lái)確定。由于液氮溫度達(dá)-196℃，使用時(shí)要防止凍傷手。4.抽濾裝置：有Zeiss濾器、玻璃濾器和金屬濾器。濾器中的濾膜一般用0.2～0.3μm孔徑的微孔濾膜。凡在高溫或射線下易發(fā)生變性或失去功能的物質(zhì)，如人工合成培養(yǎng)液、血清、消化用胰酶等都須用濾器過(guò)濾除菌。5.清毒器：一般常用小型手提式高壓蒸氣消毒器。它可用于無(wú)法干熱高溫烘烤消毒的各種塑料培養(yǎng)用品、橡膠制品等的消毒。常用的玻璃器材有各種規(guī)格的玻璃瓶、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、吸管、離心管等。無(wú)論是初次使用還是培養(yǎng)后重復(fù)使用的玻璃器材均需要進(jìn)行消毒處理。首次使用的玻璃器材應(yīng)先用自來(lái)水初步刷洗，然后用稀鹽酸溶液（1%）浸泡過(guò)夜，再用自來(lái)水沖洗，最后處理方法與重復(fù)使用的器皿的處理。1、玻璃器材（2）清潔液處理。將刷洗晾干后的玻璃器皿放入硫酸-重鉻鉀清潔液中。該清潔液具有高度腐蝕性，操作時(shí)必須穿長(zhǎng)筒膠靴，戴防酸橡皮手套，圍裙和眼鏡，以防清潔液濺出而灼傷。在配液時(shí)還需注意將酸緩慢放入水中，以防酸遇水放熱產(chǎn)生酸濺出或使玻璃及陶制容器裂開(kāi)而使清潔液外泄。切勿將水加入酸中，以防酸濺出。常用清潔液為75%和50%兩種。重復(fù)使用的玻璃器皿的處理步驟：（1）刷洗。用軟毛刷和優(yōu)質(zhì)中性洗滌劑刷洗，去除器皿內(nèi)外表面的雜質(zhì)。刷洗時(shí)注意不要用力過(guò)重，以防損壞器皿內(nèi)表面光潔度，影響細(xì)胞生長(zhǎng)；也不能留有死角。器皿數(shù)量大時(shí)，可使用超聲波清潔裝置，沖洗干凈后晾干。體外培養(yǎng)細(xì)胞中塑料器皿的使用越來(lái)越多，有進(jìn)口的，也有國(guó)產(chǎn)的。主要有多孔培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶及吸嘴。多孔培養(yǎng)板有4孔、6孔、24孔、96孔等規(guī)格可供選擇。多數(shù)為進(jìn)口產(chǎn)品，已消毒滅菌密封包裝，使用時(shí)只需打開(kāi)即可。2、塑料器材消毒采用紫外線直接照射或輻照滅菌辦法。清洗時(shí)要防止產(chǎn)生劃痕，以免影響細(xì)胞的貼附性。所以，培養(yǎng)要求較高的細(xì)胞的塑料器材，最好一次性使用。有一次性使用的，也有反復(fù)使用的。在我國(guó)不少實(shí)驗(yàn)室，由于經(jīng)費(fèi)有限，經(jīng)過(guò)清洗和消毒滅菌再使用的較多。塑料器皿若使用后，先用自來(lái)水浸泡沖洗、晾干，再用3%HCl或2%NaOH溶液浸泡過(guò)夜，用自來(lái)水充分沖洗，或先用2%NaOH處理之后再用3%HCl浸泡30分鐘，最后用自來(lái)水沖洗干凈，并用雙蒸水沖洗3次以上，晾干。已用過(guò)的金屬器材，及時(shí)用酒精棉球擦干凈，包裝入鋁盒內(nèi)于121℃高壓蒸氣滅菌20分鐘。4、金屬器材細(xì)胞培養(yǎng)中需用多種金屬器材，用于解剖、取材、剪切組織及持取物件等，常用的有剪刀、鑷子、手術(shù)刀、解剖刀、血管鉗、組織鑷、眼科鑷及各種型號(hào)針頭等。新的金屬器材，先用紙擦去表面的油脂，再用洗衣粉煮沸，或用1%碳酸氫鈉煮沸15分鐘，擦干后再用95%酒精紗布擦干，包裝或置鋁盒內(nèi)于121℃高壓蒸氣滅菌20分鐘。

5、其他物品紗布先用自來(lái)水洗凈后，再用單蒸水沖洗，然后用單蒸水煮沸2次，每次15分鐘，并經(jīng)常用長(zhǎng)鑷子翻動(dòng)，再用單蒸水洗2次，晾干后折成八層包裝，用121℃高壓蒸氣滅菌20分鐘。用于細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的各種人工合成培養(yǎng)液、緩沖液和酶濾液等也需要進(jìn)行除(滅)菌處理。緩沖液常用高壓蒸氣消毒。血清用56℃水浴滅活30分鐘。人工合成培養(yǎng)液等酶溶液用過(guò)濾除菌。注射器的針頭使用后，立即用自來(lái)水（或來(lái)蘇爾水）沖洗數(shù)次，沖洗出針頭內(nèi)的剩余物，以免堵塞針頭，然后用單蒸水洗2-3次，再用95%酒精沖洗3次，包裝或置鋁飯盒內(nèi)121℃高壓蒸氣滅菌20分鐘。1、平衡鹽溶液平衡鹽溶液(balancedsaltsolution，BSS)又稱生理鹽水或鹽溶液，是細(xì)胞培養(yǎng)中常用的基本液體。它主要由無(wú)機(jī)鹽和葡萄糖配制而成，起著維持滲透壓、緩沖和調(diào)節(jié)酸堿度等重要作用。第2節(jié)常用溶液、培養(yǎng)液及其配制體外細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中使用溶液和培養(yǎng)液的好壞，直接影響到細(xì)胞的生長(zhǎng)，配制時(shí)要十分注意。（3）物質(zhì)的可溶性很多用于培養(yǎng)用液的化學(xué)物質(zhì)都很難溶解，在配制時(shí)必須設(shè)法使其溶解。如磷酸鈣在堿性溶液中幾乎難于溶解，因此在制備磷酸緩沖液時(shí)，需將CaCl2及磷酸氫二鈉單溶后再混合，臨時(shí)用NaHCO3調(diào)pH至弱堿性，以避免沉淀析出。(一)配液時(shí)的注意事項(xiàng)（1）需用新鮮的三蒸水或去離子水，按規(guī)定的先后順序配制，稱量要準(zhǔn)確，要看清藥品的規(guī)格、純度、結(jié)晶水的數(shù)量等，切勿搞錯(cuò)。（2）物質(zhì)的純度純度高的物質(zhì)配制成的溶液質(zhì)量高，因此在配液選用時(shí)要注意。常用的純度有優(yōu)級(jí)純(特級(jí)純)，分析純（AR）和化學(xué)純（CD）三種類型。（4）物質(zhì)的不穩(wěn)定性不少物質(zhì)性質(zhì)不穩(wěn)定，高溫高壓下易破壞。如葡萄糖只能在10磅下維持15～20分鐘，若超磅葡萄糖就會(huì)破壞。(5)貯存液通常先配制成10倍或100倍的一系列母液，用前臨時(shí)混合和稀釋，過(guò)濾除菌備用。

3、培養(yǎng)基維持體外培養(yǎng)細(xì)胞生存和生長(zhǎng)的液相基質(zhì)，稱細(xì)胞培養(yǎng)基或簡(jiǎn)稱培養(yǎng)液。理想的培養(yǎng)液必須具備以下條件：(1)保持正常細(xì)胞滲透壓及pH緩沖系統(tǒng)。(2)必須供給細(xì)胞基本營(yíng)養(yǎng)物，包括細(xì)胞合成代謝、能量代謝及微量元素等。(3)培養(yǎng)液中沒(méi)有毒物或抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的物質(zhì)(4)各種基本成分的量合適，互相之間具有平衡關(guān)系，能精確定量調(diào)整。(5)容易制成成品，生產(chǎn)簡(jiǎn)單，最好能高壓滅菌。

此種維持液為無(wú)血清或低血清(2%)培養(yǎng)液。如199培養(yǎng)液不加血清就是良好的維持培養(yǎng)基。有時(shí)此種培養(yǎng)基中加入明膠或脫脂乳。還有一種由Smith設(shè)計(jì)的、含有超濾的肝消化物作為維持培養(yǎng)基。

培養(yǎng)基的種類較多，作用略有差別。凡是能供細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖的培養(yǎng)基稱為生長(zhǎng)液。若細(xì)胞生長(zhǎng)快，在生長(zhǎng)液中維持時(shí)間不長(zhǎng)，可從瓶壁脫落下來(lái)，或者由于生長(zhǎng)密度過(guò)大，使顯微鏡觀察困難。為避免此現(xiàn)象的出現(xiàn)，常在細(xì)胞成片后改