基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)課件

第二章基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)Enzymes第二章基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)Enzymes1一、限制性核酸內(nèi)切酶第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶是一類能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此處切割DNA雙鏈的核酸內(nèi)切酶。

（Restrictionendonuclease）一、限制性核酸內(nèi)切酶第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶是一類能夠識(shí)別22.性質(zhì)內(nèi)切酶主要來源于原核生物即在核酸分子鏈的內(nèi)部制造切口的酶。形成5’-P和3’-OH末端自我保護(hù)作用3.功能細(xì)菌的限制和修飾系統(tǒng)（R/M體系）1.來源2.性質(zhì)內(nèi)切酶主要來源于原核生物即在核酸分子鏈的內(nèi)部制造切3由寄主控制的限制和修飾現(xiàn)象---20世紀(jì)60年代，Linn和Arber發(fā)現(xiàn)(B)(K)大腸桿菌B大腸桿菌K114×10—

410—4E.O.P成斑率efficiencyofplating外源DNA自身DNA核酸限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)：切酶。由寄主控制的限制和修飾現(xiàn)象---20世紀(jì)60年代，Linn和4E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶當(dāng)λ(k)噬菌體侵染E.coliB時(shí)，由于其DNA中有EcoB核酸酶特異識(shí)別的堿基序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中雖然也存在這種特異序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）將甲基轉(zhuǎn)移給限制酶識(shí)別序列的特定堿基，使之甲基化。EcoB核酸酶不能識(shí)別已甲基化的序列。E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶5限制—修飾的酶學(xué)系統(tǒng)(B)(B)酶切位點(diǎn)不被修飾噬菌體DNA被切割酶切位點(diǎn)被修飾基因組DNA不被切割限制—修飾的酶學(xué)系統(tǒng)(B)(B)酶切位點(diǎn)噬菌體DNA酶切6Ⅰ型限制性內(nèi)切酶目前鑒定出三種不同類型的限制性內(nèi)切酶。二、限制性內(nèi)切酶的類型Ⅱ型限制性內(nèi)切酶

Ⅲ型限制性內(nèi)切酶IV型限制性內(nèi)切酶Ⅰ型限制性內(nèi)切酶目前鑒定出三種不同類型的限制性內(nèi)7限制性核酸內(nèi)切酶的類型及其主要特性

特性1.限制修飾活性2.內(nèi)切酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)3.限制輔助因子4.切割位點(diǎn)5.特異性切割6.基因克隆中

I型雙功能的酶3種不同亞基ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸距特異性位點(diǎn)5‘端至少1000bp不是（隨機(jī)）無用

II型限制酶和修飾酶分開單一成分

Mg2+位于識(shí)別位點(diǎn)上是非常有用

III型雙功能酶2種亞基ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸特異性位點(diǎn)3‘端24-26bp處是用處不大限制性核酸內(nèi)切酶的類型及其主要特性特性81973年H.OSmith和D.Nathans提議的命名系統(tǒng)，命名原則如下：三、限制性內(nèi)切酶的命名用屬名的第一個(gè)字母和種名的頭兩個(gè)字母組成3個(gè)字母的略語表示寄主菌的物種名，組成酶的基本名稱。大腸桿菌（Escherichiacoli）用Eco表示；流感嗜血菌（Haemophilusinfluenzae）用Hin表示1973年H.OSmith和D.Nathans提議的命名92.

如果酶存在于一種特殊的菌株中，則將該菌株名的第一個(gè)字母加在基本名稱后，若酶的編碼基因位于噬菌體（病毒）或質(zhì)粒上，則用一個(gè)大寫字母表示此染色體外遺傳成分。如HindⅡ：d菌株

EcoRI：抗藥性R質(zhì)粒

2.如果酶存在于一種特殊的菌株中，則將該菌株名的第一個(gè)字母103.

如果一種特殊的菌株內(nèi)有幾種不同的限制與修復(fù)系統(tǒng)，用羅馬字母表示該菌株中發(fā)現(xiàn)某種酶的先后次序。如HindⅡ：d菌株中發(fā)現(xiàn)的第二個(gè)酶4.

所有的限制酶，除以上名稱外還要冠以系統(tǒng)名稱。限制性內(nèi)切酶的系統(tǒng)命名為R，甲基化酶為M。如R.HindⅢ表示限制性內(nèi)切酶

M.HindⅢ表示相應(yīng)的甲基化酶實(shí)際應(yīng)用中，R常被省略。3.如果一種特殊的菌株內(nèi)有幾種不同的限制與修復(fù)系統(tǒng)，用羅馬11首先由H.O.Smith和K.W.Wilcox在1970年從流感嗜血菌中分離出來。（1）識(shí)別位點(diǎn)序列未甲基化修飾的雙鏈DNA上的特殊靶序列（多數(shù)是呈典型的旋轉(zhuǎn)對(duì)稱型的回文結(jié)構(gòu)）4-6bp。與DNA的來源無關(guān)，即沒有種的特異性。四.Ⅱ類限制性內(nèi)切酶的基本特性分離的第一個(gè)酶是HindⅡ首先由H.O.Smith和K.W.Wilcox在197012稀有切割限制酶（rarecutter）可以識(shí)別6個(gè)以上的核苷酸序列的少數(shù)的限制內(nèi)切酶。如Not

I

（GCGGCCGC）某些限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列中，某一個(gè)或兩個(gè)堿基并非嚴(yán)格專一。如HindⅡ可識(shí)別4種核苷酸序列：

Y:C或TR:A或GGTYRAC-3’5’-稀有切割限制酶（rarecutter）可以識(shí)別6個(gè)以上的核13EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’PstI5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’

產(chǎn)生粘性末端EcoRV5’-GATATC-3’3’-CTATAG-5’

產(chǎn)生平齊末端（2）切割位點(diǎn)切開雙鏈DNA，形成粘性末端（stickyend）或平齊末端（bluntend）。如：識(shí)別位點(diǎn)處EcoRI5’-GAATTC-3’EcoRV14含有幾個(gè)核苷酸單鏈的末端。分兩種類型：GAATTC

CTTAA

GG

AATTCCTTAAG5’--3’3’--5’5’--3’3’--5’[1]粘性末端（stickyends，cohensiveends）?。?’端凸出（如EcoRI切點(diǎn)）含有幾個(gè)核苷酸單鏈的末端。分兩種類型：GAATTCCTTA15CTGCAG

GACGTC5’--3’3’--5’5’--3’3’--5’CTGCAG

G

ACGTCⅱ）3’端凸出（如PstI切點(diǎn)）CTGCAGGACGTC5’--3’3’--5’5’--316i）不同的DNA雙鏈：只要粘性末端堿基互補(bǔ)就可以連接。這比連接兩個(gè)平齊末端容易得多。[2]粘性末端的意義①連接便利ii）同一個(gè)DNA分子內(nèi)連接：通過兩個(gè)相同的粘性末端可以連接成環(huán)形分子。i）不同的DNA雙鏈：只要粘性末端堿基互補(bǔ)就可以連接。這比連17第二章基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)課件18[3]平齊末端（bluntend）在識(shí)別序列的對(duì)稱軸上同時(shí)切割5’-GATATC-3’3’--5’CTATAG如EcoRV[3]平齊末端（bluntend）在識(shí)別序列的對(duì)稱軸上同19不同來源的酶，識(shí)別相同的序列，切割方式相同或不同。識(shí)別位點(diǎn)和切點(diǎn)完全相同如HindⅢ

和HsuIHindⅢ5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’HsuI5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’[5]同裂酶（Isoschizomer)①完全同裂酶：不同來源的酶，識(shí)別相同的序列，切割方式相同或不同。識(shí)別位點(diǎn)和20XmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’SmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’識(shí)別位點(diǎn)相同，但切點(diǎn)不同。如XmaI和SmaI。②不完全同裂酶：XmaI5’-CCCGGG-3’識(shí)別位點(diǎn)相21識(shí)別的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamHI、Bgl

Ⅱ、BclI、XhoⅡ等5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’BamHIBclI5’-TGATCA-3’3’-ACTAGT-5’

5’-AGATCT-3’3’-TCTAGA-5’BglⅡ5’-UGATCY-3’3’-YCTAGU-5’Xho

ⅡU代表嘌呤；Y代表嘧啶。[6]同尾酶(Isocaudamers）識(shí)別的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamHI、Bg22限制性內(nèi)切酶的識(shí)別和酶切活性一般在一定的溫度、離子強(qiáng)度、pH等條件下才表現(xiàn)最佳切割能力和位點(diǎn)的專一性。如果改變反應(yīng)條件就會(huì)影響酶的專一性和切割效率，稱為星號(hào)（*）活性。所以一般使用專一的反應(yīng)緩沖液。

影響限制酶的酶活性的因素星號(hào)（*）活性限制性內(nèi)切酶的識(shí)別和酶切活性一般在一定的溫度、離子強(qiáng)度、pH23EcoRI和BamHI等都有*活性。在低鹽、高pH（>8）時(shí)可識(shí)別和切割GAATTA、AAATTC、GAGTTC等GAATTCEcoRI：使用的時(shí)候要特別注意！7EcoRI和BamHI等都有*活性。在低鹽、高pH（>824誘發(fā)星號(hào)（*）活性的原因?。└吒视秃竣ⅲ﹥?nèi)切酶用量過大ⅲ）低離子強(qiáng)度ⅳ）高pHⅴ）含有機(jī)溶劑，如乙醇ⅵ）Mn2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+等二價(jià)陽離子的存在酶量不宜過多，盡量遵循生產(chǎn)商推薦的反應(yīng)條件誘發(fā)星號(hào)（*）活性的原因?。└吒视秃棵噶坎灰诉^多，盡量遵循25從細(xì)菌DNA環(huán)化現(xiàn)象推測(cè)，必定存在一種能把兩條DNA雙鏈連接到一起的酶。第二節(jié)DNA連接酶一、DNA連接酶（ligase)的發(fā)現(xiàn)DNA復(fù)制一定有斷口從細(xì)菌DNA環(huán)化現(xiàn)象推測(cè)，必定存在一種能把兩條DNA雙鏈連接26DNA連接酶:一種能夠催化在兩條DNA鏈之間形成磷酸二酯鍵的酶1967年，世界上數(shù)個(gè)實(shí)驗(yàn)室?guī)缀跬瑫r(shí)發(fā)現(xiàn)了一種能夠催化在2條DNA鏈之間形成磷酸二酯鍵的酶，即DNA連接酶。

DNA連接酶:一種能夠催化在兩條DNA鏈之間形成磷酸二酯鍵的27（1）大腸桿菌連接酶1.兩種共價(jià)連接DNA限制片段的DNA連接酶連接粘性末端，準(zhǔn)確性高,NAD+齊平末端，效率低二、DNAligase的特點(diǎn)（2）T4噬菌體的連接酶不但能連接粘性末端；還能連接齊平末端DNA-DNARNA-RNADNA-RNAATP（1）大腸桿菌連接酶1.兩種共價(jià)連接DNA限制片段的DNA28（1）必須是雙鏈DNA（2）DNA3’端有游離的-OH，

5’端有一個(gè)磷酸基團(tuán)（P）（3）需要能量ATP

或NAD+2.DNA連接酶催化的連接反應(yīng)特點(diǎn)（4）只能連接缺口（nick），不能連接裂口（gap）。（1）必須是雙鏈DNA（2）DNA3’端有游離的-OH，（329

是兩條鏈－因此不能將兩條單鏈連接起來或使單鏈環(huán)化起來。

OHP××是相鄰的－因此只能封閉nick.不能封閉gapgapNONickOK是兩條鏈－因此不能將兩條單鏈連接起來或使單鏈環(huán)化起來。30三、

DNA連接酶的反應(yīng)條件Tris-HCl50-100mM，pH7.5MgCl210mMATP0.5-1mMDTT5mMVolume10-20mlTT4-15℃，4-16hr三、DNA連接酶的反應(yīng)條件Tris-HCl50-10311.反應(yīng)溫度理論37

℃黏性末端：12～16℃平頭末端：10～20℃2.ATP濃度一般，ATP最適的終濃度為0.5mmol/L.ATP濃度高至5mmol/L，影響平頭末端的連接ATP濃度高至7.5mmol/L，抑制粘性末端及平頭末端的連接。四、影響連接反應(yīng)的因素1.反應(yīng)溫度理論37℃黏性末端：12～16℃2.323連接酶的濃度：

平末端DNA分子的連接反應(yīng)中，最適1～2個(gè)單位。粘性末端DNA片段之間的連接，0.1個(gè)單位。時(shí)間：

16℃4小時(shí)

4℃

過夜3連接酶的濃度：33增加插入片段與載體的接觸機(jī)會(huì)，減少同一個(gè)分子末端自我連接的現(xiàn)象。4.DNA末端的濃度3:1

插入片段與載體的濃度比例兩種構(gòu)型：線狀分子和環(huán)狀分子與DNA濃度及DNA分子長(zhǎng)度相關(guān)增加插入片段與載體的接觸機(jī)會(huì)，減少同一個(gè)分子末端自我連接的現(xiàn)34注意事項(xiàng)：10xLigationBuffer含有ATP，使用前應(yīng)在室溫放置至融化或用手掌溫度輔助融化，然后置于冰上。不要加熱融化以免ATP降解。T4DNALigase對(duì)熱敏感，容易失活。使用時(shí)請(qǐng)放置冰上，用后立即置冰箱中冷凍保存。注意事項(xiàng)：10xLigationBuffer含有ATP，使用35第三節(jié)DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶（DNApolymerase)能在引物和模板的存在下，把脫氧核糖多核苷酸連續(xù)地加到雙鏈DNA分子引物鏈的3’－OH末端，催化核苷酸的聚合作用.第三節(jié)DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶（DNApol36一、基因工程中常用的DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶2.Klenowfragment3.T7DNA聚合酶4.T4DNA聚合酶5.修飾過的T7DNA聚合酶6.逆轉(zhuǎn)錄酶7.TaqDNA聚合酶一、基因工程中常用的DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶371.共同特點(diǎn)把dNTPs連續(xù)地加到引物的3’－OH端2.主要區(qū)別T7DNA聚合酶可以連續(xù)添加數(shù)千個(gè)dNTPs而不從模板上掉下來。有的DNA聚合酶只能連續(xù)添加10多個(gè)dNTPs就會(huì)從模板上解離下來。二、常用的DNA聚合酶的特點(diǎn)持續(xù)合成能力和外切酶活性不同。1.共同特點(diǎn)把dNTPs連續(xù)地加到引物的3’－OH端2.38DNA聚合酶3’5’外切酶活性5’3’外切酶活性聚合速率持續(xù)能力大腸桿菌DNA聚合酶低有中低Klenowfragment低無中低T4DNA聚合酶高無中低T7DNA聚合酶高無快高化學(xué)修飾T7DNA聚合酶低無快高遺傳修飾T7DNA聚合酶無無快高逆轉(zhuǎn)錄酶無無低中TaqDNA聚合酶無有快高3.常用DNA聚合酶的特性比較DNA聚合酶3’5’外5’3’外切酶活性聚合速率持續(xù)能力39三、DNA聚合酶在基因工程中的用途1.大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ主要用來制備帶放射性標(biāo)記的DNA探針（32P標(biāo)記）。（1）大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的性質(zhì)①一條單鏈多肽②5’3’外切酶活性位于N端③用枯草桿菌蛋白酶處理可以切掉N端的5’3’外切酶活性部分,就成為Klenowfragment。三、DNA聚合酶在基因工程中的用途1.大腸桿菌DNA聚合酶402.Klenowfragment具有5’3’聚合酶活性和3’5’外切酶活性。（失去了5’3’外切酶活性）。（1）Klenowfragment的性質(zhì)DNAPolIKlenowfragment(76KD）枯草桿菌蛋白酶2.Klenowfragment具有5’3’聚合酶活性41①3’端補(bǔ)平5’5’klenow②DNA3’末端標(biāo)記補(bǔ)平限制性內(nèi)切酶切后形成的3’隱蔽端。在3’隱蔽端加上放射性標(biāo)記的dNTP。klenow（2）主要用途①3’端補(bǔ)平5’5’klenow②DNA3’末端標(biāo)記補(bǔ)423’隱蔽末端的DNA片斷Klenowfragment補(bǔ)平根據(jù)末端的順序選擇一種-32P-dNTPs末端標(biāo)記的DNA限制性內(nèi)切酶切5’----G3’3’----CTTAA5’5’----GAA3’3’----CTTAA5’5’----GAATT3’3’----CTTAA5’5’----G3’3’----CCTAG5’5’----GG3’3’----CCTAG5’5’----GGATC3’3’----CCTAG5’EcoRIBamHI-32P-dATP-32P-dGTP25oC1h3’隱蔽末端的DNA片斷Klenowfragment補(bǔ)平根43③cDNA第二鏈的合成mRNAcDNA第一鏈逆轉(zhuǎn)錄cDNA第二鏈klenow5’3’3’5’5’3’引物③cDNA第二鏈的合成mRNAcDNA第一鏈逆轉(zhuǎn)錄cDNA44（1）T4DNA聚合酶的性質(zhì)3.T4DNA聚合酶從T4噬菌體感染后的大腸桿菌培養(yǎng)物中分離純化，由噬菌體基因43編碼。有5’3’聚合酶活性和3’5’外切酶活性（降解單鏈更快）。①來源②酶活性（1）T4DNA聚合酶的性質(zhì)3.T4DNA聚合酶從T45③特點(diǎn)A當(dāng)沒有dNTP時(shí)，T4DNA聚合酶行使3’5’外切酶功能，制造出3’隱蔽端。B如果只有一種dNTP，則降解到該dNTP的位置。C在四種dNTP均存在時(shí)，聚合活性占主導(dǎo)地位。③特點(diǎn)A當(dāng)沒有dNTP時(shí)，T4DNA聚合酶行使3’5465’5’3’3’5’5’3’3’T4DNA聚合酶無dNTPsT4DNA聚合酶有dNTPs5’5’5’5’3’3’5’5’3’3’T4DNA聚合酶無dNTP47（2）T4DNA聚合酶的用途標(biāo)記末端（取代合成法或置換合成法）用3’5’外切酶活性作用于所有末端形式的3’端（平端、3’隱蔽端、5’隱蔽端）制造出3’隱蔽端。再利用它的5’3’聚合酶活性補(bǔ)平，并加入放射性標(biāo)記的dNTP。①補(bǔ)平隱蔽末端②DNA3’末端標(biāo)記（2）T4DNA聚合酶的用途標(biāo)記末端（取代合成法或置換合484.T7DNA聚合酶（1）來源從T7噬菌體感染大腸桿菌細(xì)胞中純化出來的，由兩個(gè)亞基組成：①T7噬菌體基因5編碼的大亞基：T7噬菌體5蛋白有5’3’聚合酶和3’5’外切酶活性。②大腸桿菌編碼的小亞基：硫氧還蛋白增加大亞基對(duì)模板的親和性。4.T7DNA聚合酶（1）來源從T7噬菌體感染大腸桿菌細(xì)49（2）T7DNA聚合酶的特點(diǎn)①持續(xù)合成能力強(qiáng)一旦與模板結(jié)合就會(huì)不間斷地合成互補(bǔ)鏈。②3’5’外切酶活性高單鏈和雙鏈都能降解。③不受DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響其它DNA聚合酶受DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的阻礙（2）T7DNA聚合酶的特點(diǎn)①持續(xù)合成能力強(qiáng)一旦與模板結(jié)50②進(jìn)行末端標(biāo)記①催化大分子量DNA為模板的合成如M13噬菌體③補(bǔ)平隱蔽末端（3）T7DNA聚合酶的用途合成補(bǔ)平3’隱蔽末端；水解修平3’突出末端。②進(jìn)行末端標(biāo)記①催化大分子量DNA為模板的合成如M13515.修飾后的T7DNA聚合酶（1）T7DNA聚合酶的化學(xué)修飾去除3’5’外切酶活性，使DNA聚合能力和聚合速率提高了3倍。（2）修飾后的T7DNA聚合酶的用途①DNA測(cè)序雙脫氧法。②標(biāo)記DNA3’隱蔽末端③更有效地補(bǔ)平末端5.修飾后的T7DNA聚合酶（1）T7DNA聚合酶的化學(xué)526.逆轉(zhuǎn)錄酶最普遍使用的是來源于鳥類骨髓母細(xì)胞瘤病毒（avianmyeloblastosisvirus,AMV）：依賴RNA的DNA聚合酶（RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶）。（1）來源RNA腫瘤病毒。（2）AMV的性質(zhì)由和兩條多肽鏈組成，最適反應(yīng)溫度為41～45℃6.逆轉(zhuǎn)錄酶最普遍使用的是來源于鳥類骨髓母細(xì)胞瘤病毒（av53①鏈有反轉(zhuǎn)錄活性和RNaseH活性。RNaseH：以5’3’或3’5’方向特異地水解RNA-DNA雜交雙鏈中的RNA鏈。RNaseHRNADNARNADNA①鏈有反轉(zhuǎn)錄活性和RNaseH活性。RNaseH：RN54（3）逆轉(zhuǎn)錄酶的用途②鏈RNA-DNA雜交雙鏈中5’3’DNA外切酶活性。①合成cDNA以oligodT為引物（與mRNA的polyA尾巴互補(bǔ)結(jié)合）。AAAAATTTTT5’3’mRNA5’cDNA（3）逆轉(zhuǎn)錄酶的用途②鏈RNA-DNA雜交雙鏈中5’355②合成DNA探針用隨機(jī)引物（randomprimer）或oligodT做引物。隨機(jī)引物：隨機(jī)順序形成的寡聚DNA片斷。（理論上它能與各種序列的模板結(jié)合）②合成DNA探針用隨機(jī)引物（randomprimer）或56演講完畢，謝謝觀看！演講完畢，謝謝觀看！57第二章基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)Enzymes第二章基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)Enzymes58一、限制性核酸內(nèi)切酶第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶是一類能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此處切割DNA雙鏈的核酸內(nèi)切酶。

（Restrictionendonuclease）一、限制性核酸內(nèi)切酶第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶是一類能夠識(shí)別592.性質(zhì)內(nèi)切酶主要來源于原核生物即在核酸分子鏈的內(nèi)部制造切口的酶。形成5’-P和3’-OH末端自我保護(hù)作用3.功能細(xì)菌的限制和修飾系統(tǒng)（R/M體系）1.來源2.性質(zhì)內(nèi)切酶主要來源于原核生物即在核酸分子鏈的內(nèi)部制造切60由寄主控制的限制和修飾現(xiàn)象---20世紀(jì)60年代，Linn和Arber發(fā)現(xiàn)(B)(K)大腸桿菌B大腸桿菌K114×10—

410—4E.O.P成斑率efficiencyofplating外源DNA自身DNA核酸限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)：切酶。由寄主控制的限制和修飾現(xiàn)象---20世紀(jì)60年代，Linn和61E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶當(dāng)λ(k)噬菌體侵染E.coliB時(shí)，由于其DNA中有EcoB核酸酶特異識(shí)別的堿基序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中雖然也存在這種特異序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）將甲基轉(zhuǎn)移給限制酶識(shí)別序列的特定堿基，使之甲基化。EcoB核酸酶不能識(shí)別已甲基化的序列。E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶62限制—修飾的酶學(xué)系統(tǒng)(B)(B)酶切位點(diǎn)不被修飾噬菌體DNA被切割酶切位點(diǎn)被修飾基因組DNA不被切割限制—修飾的酶學(xué)系統(tǒng)(B)(B)酶切位點(diǎn)噬菌體DNA酶切63Ⅰ型限制性內(nèi)切酶目前鑒定出三種不同類型的限制性內(nèi)切酶。二、限制性內(nèi)切酶的類型Ⅱ型限制性內(nèi)切酶

Ⅲ型限制性內(nèi)切酶IV型限制性內(nèi)切酶Ⅰ型限制性內(nèi)切酶目前鑒定出三種不同類型的限制性內(nèi)64限制性核酸內(nèi)切酶的類型及其主要特性

特性1.限制修飾活性2.內(nèi)切酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)3.限制輔助因子4.切割位點(diǎn)5.特異性切割6.基因克隆中

I型雙功能的酶3種不同亞基ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸距特異性位點(diǎn)5‘端至少1000bp不是（隨機(jī)）無用

II型限制酶和修飾酶分開單一成分

Mg2+位于識(shí)別位點(diǎn)上是非常有用

III型雙功能酶2種亞基ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸特異性位點(diǎn)3‘端24-26bp處是用處不大限制性核酸內(nèi)切酶的類型及其主要特性特性651973年H.OSmith和D.Nathans提議的命名系統(tǒng)，命名原則如下：三、限制性內(nèi)切酶的命名用屬名的第一個(gè)字母和種名的頭兩個(gè)字母組成3個(gè)字母的略語表示寄主菌的物種名，組成酶的基本名稱。大腸桿菌（Escherichiacoli）用Eco表示；流感嗜血菌（Haemophilusinfluenzae）用Hin表示1973年H.OSmith和D.Nathans提議的命名662.

如果酶存在于一種特殊的菌株中，則將該菌株名的第一個(gè)字母加在基本名稱后，若酶的編碼基因位于噬菌體（病毒）或質(zhì)粒上，則用一個(gè)大寫字母表示此染色體外遺傳成分。如HindⅡ：d菌株

EcoRI：抗藥性R質(zhì)粒

2.如果酶存在于一種特殊的菌株中，則將該菌株名的第一個(gè)字母673.

如果一種特殊的菌株內(nèi)有幾種不同的限制與修復(fù)系統(tǒng)，用羅馬字母表示該菌株中發(fā)現(xiàn)某種酶的先后次序。如HindⅡ：d菌株中發(fā)現(xiàn)的第二個(gè)酶4.

所有的限制酶，除以上名稱外還要冠以系統(tǒng)名稱。限制性內(nèi)切酶的系統(tǒng)命名為R，甲基化酶為M。如R.HindⅢ表示限制性內(nèi)切酶

M.HindⅢ表示相應(yīng)的甲基化酶實(shí)際應(yīng)用中，R常被省略。3.如果一種特殊的菌株內(nèi)有幾種不同的限制與修復(fù)系統(tǒng)，用羅馬68首先由H.O.Smith和K.W.Wilcox在1970年從流感嗜血菌中分離出來。（1）識(shí)別位點(diǎn)序列未甲基化修飾的雙鏈DNA上的特殊靶序列（多數(shù)是呈典型的旋轉(zhuǎn)對(duì)稱型的回文結(jié)構(gòu)）4-6bp。與DNA的來源無關(guān)，即沒有種的特異性。四.Ⅱ類限制性內(nèi)切酶的基本特性分離的第一個(gè)酶是HindⅡ首先由H.O.Smith和K.W.Wilcox在197069稀有切割限制酶（rarecutter）可以識(shí)別6個(gè)以上的核苷酸序列的少數(shù)的限制內(nèi)切酶。如Not

I

（GCGGCCGC）某些限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列中，某一個(gè)或兩個(gè)堿基并非嚴(yán)格專一。如HindⅡ可識(shí)別4種核苷酸序列：

Y:C或TR:A或GGTYRAC-3’5’-稀有切割限制酶（rarecutter）可以識(shí)別6個(gè)以上的核70EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’PstI5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’

產(chǎn)生粘性末端EcoRV5’-GATATC-3’3’-CTATAG-5’

產(chǎn)生平齊末端（2）切割位點(diǎn)切開雙鏈DNA，形成粘性末端（stickyend）或平齊末端（bluntend）。如：識(shí)別位點(diǎn)處EcoRI5’-GAATTC-3’EcoRV71含有幾個(gè)核苷酸單鏈的末端。分兩種類型：GAATTC

CTTAA

GG

AATTCCTTAAG5’--3’3’--5’5’--3’3’--5’[1]粘性末端（stickyends，cohensiveends）?。?’端凸出（如EcoRI切點(diǎn)）含有幾個(gè)核苷酸單鏈的末端。分兩種類型：GAATTCCTTA72CTGCAG

GACGTC5’--3’3’--5’5’--3’3’--5’CTGCAG

G

ACGTCⅱ）3’端凸出（如PstI切點(diǎn)）CTGCAGGACGTC5’--3’3’--5’5’--373i）不同的DNA雙鏈：只要粘性末端堿基互補(bǔ)就可以連接。這比連接兩個(gè)平齊末端容易得多。[2]粘性末端的意義①連接便利ii）同一個(gè)DNA分子內(nèi)連接：通過兩個(gè)相同的粘性末端可以連接成環(huán)形分子。i）不同的DNA雙鏈：只要粘性末端堿基互補(bǔ)就可以連接。這比連74第二章基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)課件75[3]平齊末端（bluntend）在識(shí)別序列的對(duì)稱軸上同時(shí)切割5’-GATATC-3’3’--5’CTATAG如EcoRV[3]平齊末端（bluntend）在識(shí)別序列的對(duì)稱軸上同76不同來源的酶，識(shí)別相同的序列，切割方式相同或不同。識(shí)別位點(diǎn)和切點(diǎn)完全相同如HindⅢ

和HsuIHindⅢ5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’HsuI5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’[5]同裂酶（Isoschizomer)①完全同裂酶：不同來源的酶，識(shí)別相同的序列，切割方式相同或不同。識(shí)別位點(diǎn)和77XmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’SmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’識(shí)別位點(diǎn)相同，但切點(diǎn)不同。如XmaI和SmaI。②不完全同裂酶：XmaI5’-CCCGGG-3’識(shí)別位點(diǎn)相78識(shí)別的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamHI、Bgl

Ⅱ、BclI、XhoⅡ等5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’BamHIBclI5’-TGATCA-3’3’-ACTAGT-5’

5’-AGATCT-3’3’-TCTAGA-5’BglⅡ5’-UGATCY-3’3’-YCTAGU-5’Xho

ⅡU代表嘌呤；Y代表嘧啶。[6]同尾酶(Isocaudamers）識(shí)別的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamHI、Bg79限制性內(nèi)切酶的識(shí)別和酶切活性一般在一定的溫度、離子強(qiáng)度、pH等條件下才表現(xiàn)最佳切割能力和位點(diǎn)的專一性。如果改變反應(yīng)條件就會(huì)影響酶的專一性和切割效率，稱為星號(hào)（*）活性。所以一般使用專一的反應(yīng)緩沖液。

影響限制酶的酶活性的因素星號(hào)（*）活性限制性內(nèi)切酶的識(shí)別和酶切活性一般在一定的溫度、離子強(qiáng)度、pH80EcoRI和BamHI等都有*活性。在低鹽、高pH（>8）時(shí)可識(shí)別和切割GAATTA、AAATTC、GAGTTC等GAATTCEcoRI：使用的時(shí)候要特別注意！7EcoRI和BamHI等都有*活性。在低鹽、高pH（>881誘發(fā)星號(hào)（*）活性的原因?。└吒视秃竣ⅲ﹥?nèi)切酶用量過大ⅲ）低離子強(qiáng)度ⅳ）高pHⅴ）含有機(jī)溶劑，如乙醇ⅵ）Mn2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+等二價(jià)陽離子的存在酶量不宜過多，盡量遵循生產(chǎn)商推薦的反應(yīng)條件誘發(fā)星號(hào)（*）活性的原因ⅰ）高甘油含量酶量不宜過多，盡量遵循82從細(xì)菌DNA環(huán)化現(xiàn)象推測(cè)，必定存在一種能把兩條DNA雙鏈連接到一起的酶。第二節(jié)DNA連接酶一、DNA連接酶（ligase)的發(fā)現(xiàn)DNA復(fù)制一定有斷口從細(xì)菌DNA環(huán)化現(xiàn)象推測(cè)，必定存在一種能把兩條DNA雙鏈連接83DNA連接酶:一種能夠催化在兩條DNA鏈之間形成磷酸二酯鍵的酶1967年，世界上數(shù)個(gè)實(shí)驗(yàn)室?guī)缀跬瑫r(shí)發(fā)現(xiàn)了一種能夠催化在2條DNA鏈之間形成磷酸二酯鍵的酶，即DNA連接酶。

DNA連接酶:一種能夠催化在兩條DNA鏈之間形成磷酸二酯鍵的84（1）大腸桿菌連接酶1.兩種共價(jià)連接DNA限制片段的DNA連接酶連接粘性末端，準(zhǔn)確性高,NAD+齊平末端，效率低二、DNAligase的特點(diǎn)（2）T4噬菌體的連接酶不但能連接粘性末端；還能連接齊平末端DNA-DNARNA-RNADNA-RNAATP（1）大腸桿菌連接酶1.兩種共價(jià)連接DNA限制片段的DNA85（1）必須是雙鏈DNA（2）DNA3’端有游離的-OH，

5’端有一個(gè)磷酸基團(tuán)（P）（3）需要能量ATP

或NAD+2.DNA連接酶催化的連接反應(yīng)特點(diǎn)（4）只能連接缺口（nick），不能連接裂口（gap）。（1）必須是雙鏈DNA（2）DNA3’端有游離的-OH，（386

是兩條鏈－因此不能將兩條單鏈連接起來或使單鏈環(huán)化起來。

OHP××是相鄰的－因此只能封閉nick.不能封閉gapgapNONickOK是兩條鏈－因此不能將兩條單鏈連接起來或使單鏈環(huán)化起來。87三、

DNA連接酶的反應(yīng)條件Tris-HCl50-100mM，pH7.5MgCl210mMATP0.5-1mMDTT5mMVolume10-20mlTT4-15℃，4-16hr三、DNA連接酶的反應(yīng)條件Tris-HCl50-10881.反應(yīng)溫度理論37

℃黏性末端：12～16℃平頭末端：10～20℃2.ATP濃度一般，ATP最適的終濃度為0.5mmol/L.ATP濃度高至5mmol/L，影響平頭末端的連接ATP濃度高至7.5mmol/L，抑制粘性末端及平頭末端的連接。四、影響連接反應(yīng)的因素1.反應(yīng)溫度理論37℃黏性末端：12～16℃2.893連接酶的濃度：

平末端DNA分子的連接反應(yīng)中，最適1～2個(gè)單位。粘性末端DNA片段之間的連接，0.1個(gè)單位。時(shí)間：

16℃4小時(shí)

4℃

過夜3連接酶的濃度：90增加插入片段與載體的接觸機(jī)會(huì)，減少同一個(gè)分子末端自我連接的現(xiàn)象。4.DNA末端的濃度3:1

插入片段與載體的濃度比例兩種構(gòu)型：線狀分子和環(huán)狀分子與DNA濃度及DNA分子長(zhǎng)度相關(guān)增加插入片段與載體的接觸機(jī)會(huì)，減少同一個(gè)分子末端自我連接的現(xiàn)91注意事項(xiàng)：10xLigationBuffer含有ATP，使用前應(yīng)在室溫放置至融化或用手掌溫度輔助融化，然后置于冰上。不要加熱融化以免ATP降解。T4DNALigase對(duì)熱敏感，容易失活。使用時(shí)請(qǐng)放置冰上，用后立即置冰箱中冷凍保存。注意事項(xiàng)：10xLigationBuffer含有ATP，使用92第三節(jié)DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶（DNApolymerase)能在引物和模板的存在下，把脫氧核糖多核苷酸連續(xù)地加到雙鏈DNA分子引物鏈的3’－OH末端，催化核苷酸的聚合作用.第三節(jié)DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶（DNApol93一、基因工程中常用的DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶2.Klenowfragment3.T7DNA聚合酶4.T4DNA聚合酶5.修飾過的T7DNA聚合酶6.逆轉(zhuǎn)錄酶7.TaqDNA聚合酶一、基因工程中常用的DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶941.共同特點(diǎn)把dNTPs連續(xù)地加到引物的3’－OH端2.主要區(qū)別T7DNA聚合酶可以連續(xù)添加數(shù)千個(gè)dNTPs而不從模板上掉下來。有的DNA聚合酶只能連續(xù)添加10多個(gè)dNTPs就會(huì)從模板上解離下來。二、常用的DNA聚合酶的特點(diǎn)持續(xù)合成能力和外切酶活性不同。1.共同特點(diǎn)把dNTPs連續(xù)地加到引物的3’－OH端2.95DNA聚合酶3’5’外切酶活性5’3’外切酶活性聚合速率持續(xù)能力大腸桿菌DNA聚合酶低有中低Klenowfragment低無中低T4DNA聚合酶高無中低T7DNA聚合酶高無快高化學(xué)修飾T7DNA聚合酶低無快高遺傳修飾T7DNA聚合酶無無快高逆轉(zhuǎn)錄酶無無低中TaqDNA聚合酶無有快高3.常用DNA聚合酶的特性比較DNA聚合酶3’5’外5’3’外切酶活性聚合速率持續(xù)能力96三、DNA聚合酶在基因工程中的用途1.大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ主要用來制備帶放射性標(biāo)記的DNA探針（32P標(biāo)記）。（1）大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的性質(zhì)①一條單鏈多肽②5’3’外切酶活性位于N端③用枯草桿菌蛋白酶處理可以切掉N端的5’3’外切酶活性部分,就成為Klenowfragment。三、DNA聚合酶在基因工程中的用途1.大腸桿菌DNA聚合酶972.Klenowfragment具有5’3’聚合酶活性和3’5’外切酶活性。（失去了5’3’外切酶活性）。（1）Klenowfragment的性質(zhì)DNAPolIKlenowfragment(76KD）枯草桿菌蛋白酶2.Klenowfragment具有5’3’聚合酶活性98①3’端補(bǔ)平5’5’klenow②DNA3’末端標(biāo)記補(bǔ)平限制性內(nèi)切酶切后形成的3’隱蔽端。在3’隱蔽端加上放射性標(biāo)記的dNTP。klenow（2）主要用途①3’端補(bǔ)平5’5’klenow②DNA3’末端標(biāo)記補(bǔ)993’隱蔽末端的DNA片斷Klenowfragment補(bǔ)平根據(jù)末端的順序選擇一種-32P-dNTPs末端標(biāo)記的DNA限制性內(nèi)切酶切5’----G3’3’----CTTAA5’5’----GAA3’3’----CTTAA5’5’----GAATT3’3’----CTTAA5’5’----G3’3’----CCTAG5’5’----GG3’3’----CCTAG5’5’----GGATC3’3’----CCTAG5’EcoRIBamHI-32P-dATP-32P-dGTP25oC1h3’隱蔽末端的DNA片斷Klenowfragment補(bǔ)平根100③cDNA第二鏈的合成mRNAcDNA第一鏈逆轉(zhuǎn)錄cDNA第二鏈kle