放射免疫分析課件

放射免疫分析31、園日涉以成趣，門雖設而常關。32、鼓腹無所思。朝起暮歸眠。33、傾壺絕余瀝，窺灶不見煙。34、春秋滿四澤，夏云多奇峰，秋月?lián)P明輝，冬嶺秀孤松。35、丈夫志四海，我愿不知老。放射免疫分析放射免疫分析31、園日涉以成趣，門雖設而常關。32、鼓腹無所思。朝起暮歸眠。33、傾壺絕余瀝，窺灶不見煙。34、春秋滿四澤，夏云多奇峰，秋月?lián)P明輝，冬嶺秀孤松。35、丈夫志四海，我愿不知老。第四章放射免疫分析2目的與要求：掌握放射免疫分析的基本原理，實驗室配置及質量控制。內容：放射免疫分析(RIA)是由Yalow和Berson于1960年創(chuàng)建的一種體外放射分析技術。這是檢驗專業(yè)學生必須掌握和重點。3放射免疫分析31、園日涉以成趣，門雖設而常關。放射免疫分析放放射免疫分析課件放射免疫分析課件放射免疫分析課件放射免疫分析課件3、標記抗原與非標記抗原之和多于物質異性抗體結合位點。這樣當反應達到平稀時，標記抗原抗體復合物的生成量受非標記抗原數量的制約。例如：非標記抗原數量增加時，就會抑制標記抗原與抗體的結合，標記抗原抗體復合物的生成量就減少，未與抗體結合的標記抗原的數量加。這種特異性的競爭性抑制的數量關系就是放射免疫分析的定量基礎。標記抗原與被測物質間的數量關系可以用抑制曲線來表示。這種曲線表示了結合抑制的程度與抑制物濃度兩者之間的特定函數關系，也稱為劑量反應曲線。63、標記抗原與非標記抗原之和多于物質異性抗體結合位點。二、劑量反應曲線劑量反應曲線又稱標準曲線。是放射免疫分析定量的基礎，是衡量物質濃度的客觀尺度(一)標準曲線的手工繪制形態(tài)標準曲線的形態(tài)可因所用的反應變量表達形式的不同，或所采用坐標系統(tǒng)不同而有不同的形態(tài)。(二)標準曲線的基本數學函數式放射免疫分析從抗原抗體反應動力學分析，反應是雙向性的，服從質量作用定律。7二、劑量反應曲線7(三)掌握親和常數K值的計算、意義及應用、平衡常數K又稱親和常數，或叫做結合常數。該常數對特定的抗原抗體反應系統(tǒng)是固定不變的。K的單位為1mol或L/mol。其意義在于可用K值反映抗體之間的親和力。K值與游離抗體濃度呈反比關系。K值越大，則游離的抗體濃度［Ab］越小，結合的抗原抗體復合物［Ag-Ab］濃度越大。即抗原抗體的結合力越大。K值是與抗原抗體共同相關的數值，不能認為僅僅是抗體(或抗原)之間的K值。目前，國內外有多種計算K值的方法，有的非常復雜，而通常使用的方法是Scatchard分析作圖法。8(三)掌握親和常數K值的計算、意義及應用、平衡常數K(四)掌握標準曲線的斜率對測定的影響標準曲線的斜率對放射免疫分析方法的靈敏度和精密度均有影響。影響標準曲線斜率的因素：1、親和常數K2、標記抗原和標準抗原的用量3、特異性抗體的用量(五)掌握Bo(總結合)、T(總管)、NSB的概念9(四)掌握標準曲線的斜率對測定的影響標準曲線的斜率對放射免第二節(jié)放射免疫分析方法學一、掌握建立放射免疫分析方法的必備條件(一)對標準抗原的基本要求(1)標準抗朱與待測抗原的免疫性必須一致，即它們與抗體的親和力和特異性應相同。標準抗原與待測抗原所處的介質條件應基本相同。(2)抗原必須純度度。(3)標準抗原的量必須準確。(4)標準抗原應有很好的穩(wěn)定性。10第二節(jié)放射免疫分析方法學10(二)對抗血清的要求抗血清中含有對其相應抗原的特異性抗體。目前常以抗原免疫年輕、健康的純種小動物而誘發(fā)產生多克隆抗體，選取抗體滴度高的血清，為RIA所用?？寡宓馁|量直接影響放射免疫分析方法的靈活敏度和特異性。檢查抗血清質量的指標主要有親和常數(K)、免疫交叉反應率及滴度(或抗體效價)。11(二)對抗血清的要求11(三)對標記抗原的要求標記抗原是放射性測定的依據，對標記抗原的基本要求：1、標記抗原的免疫活性與待測抗原及標準品必須一致。2、標記抗原要有適當高的放射性比活度。3、標記抗原應具有足夠高的放射化學純度12(三)對標記抗原的要求12(四)分離B與F的方法理想分離應滿足如下要求：1、分離B、F完全、快速。2、不影響免疫反應的平衡條件。3、不受分離操作時的環(huán)境因素(如pH、溫度等)的影響。4、操作簡便，分離試劑的來源豐富且價廉。13(四)分離B與F的方法13目前的分離方法有：1、非特異性分離法(1)吸附法：利用表面活性物質將反應的液中小分子游離部分F吸附，通過離心，將F沉淀，使大分子結合物B留在上清液中，而達到分離的目的。(2)過濾法：反應液中B與F混合物在通過一定規(guī)格孔徑的濾膜時，大分子不會通過濾膜孔被阻留在濾膜上，小分子游離的放射性物質F被抽吸通過濾膜而分離。(3)沉淀法。14目前的分離方法有：142、特異性分離法(1)雙抗法(Ab2法)：應用抗IgG的第二抗體來分離B和F的方法稱為雙抗體法。雙抗體法具有特異、高效、非特異性結合低、重復性好等優(yōu)點。在使用此法時，往往加入適量的第一抗體同種動物血清作載體。同時第二抗體必須是過量(但也不宜過大)，且以不影響反應平衡為宜.(2)固相分離法：將特性抗體(第一或第二抗體)或抗原結合在固相物質。(3)金黃色葡萄球菌A蛋白分離法。152、特異性分離法15二、掌握放射免疫分析的設計方法：(一)標譏抗原和抗體用量最佳化設計。1、標記抗原用量選擇。2、抗血清的使用滴度選擇及其方法。(二)標準抗原劑量設計1、標準抗原劑量范圍2、標準曲線工作范圍(三)加樣順序設計(四)反應介質16二、掌握放射免疫分析的設計方法：16(五)反應容積與溫度及時間1、反應容積縮小反應容積可相應減少抗體和標記抗原的絕對用量，使非標記抗原的競爭力相應增強，有利于提高靈敏度，使反應試劑消耗減少。2、溫育溫度和時間抗原、抗體結合反應的平衡結合常數K與溫度有關必須通過實驗來確定最佳工作條件。(六)B與F分離方法選擇(七)樣品采集與保存17(五)反應容積與溫度及時間17第四節(jié)放射免疫分析的質量控制一、掌握誤差和放射免疫誤差的來源(一)誤差及其分類(二)放射免疫分析誤差來源二、掌握質量控制與質控樣品(一)放射免疫分析的質量控制內容(二)質量控制樣品18第四節(jié)放射免疫分析的質量控制18三、掌握質量控制指標：靈敏度、精密度、偏倚和準確度、特異性、穩(wěn)定性、臨床有效性。四、掌握實驗室內部質量控制：精密度的評價、批內偏倚的評價和批間重現性評價。五、掌握實驗室間的外部質量評價。19三、掌握質量控制指標：靈敏度、精密度、偏倚和準確度、特異性、END16、業(yè)余生活要有意義，不要越軌?！A盛頓

17、一個人即使已登上頂峰，也仍要自強不息?！_素·貝克

18、最大的挑戰(zhàn)和突破在于用人，而用人最大的突破在于信任人?！R云

19、自己活著，就是為了使別人過得更美好。——雷鋒

20、要掌握書，莫被書掌握；要為生而讀，莫為讀而生?！紶栁諩ND16、業(yè)余生活要有意義，不要越軌?！A盛頓放射免疫分析31、園日涉以成趣，門雖設而常關。32、鼓腹無所思。朝起暮歸眠。33、傾壺絕余瀝，窺灶不見煙。34、春秋滿四澤，夏云多奇峰，秋月?lián)P明輝，冬嶺秀孤松。35、丈夫志四海，我愿不知老。放射免疫分析放射免疫分析31、園日涉以成趣，門雖設而常關。32、鼓腹無所思。朝起暮歸眠。33、傾壺絕余瀝，窺灶不見煙。34、春秋滿四澤，夏云多奇峰，秋月?lián)P明輝，冬嶺秀孤松。35、丈夫志四海，我愿不知老。第四章放射免疫分析2目的與要求：掌握放射免疫分析的基本原理，實驗室配置及質量控制。內容：放射免疫分析(RIA)是由Yalow和Berson于1960年創(chuàng)建的一種體外放射分析技術。這是檢驗專業(yè)學生必須掌握和重點。3放射免疫分析31、園日涉以成趣，門雖設而常關。放射免疫分析放放射免疫分析課件放射免疫分析課件放射免疫分析課件放射免疫分析課件3、標記抗原與非標記抗原之和多于物質異性抗體結合位點。這樣當反應達到平稀時，標記抗原抗體復合物的生成量受非標記抗原數量的制約。例如：非標記抗原數量增加時，就會抑制標記抗原與抗體的結合，標記抗原抗體復合物的生成量就減少，未與抗體結合的標記抗原的數量加。這種特異性的競爭性抑制的數量關系就是放射免疫分析的定量基礎。標記抗原與被測物質間的數量關系可以用抑制曲線來表示。這種曲線表示了結合抑制的程度與抑制物濃度兩者之間的特定函數關系，也稱為劑量反應曲線。263、標記抗原與非標記抗原之和多于物質異性抗體結合位點。二、劑量反應曲線劑量反應曲線又稱標準曲線。是放射免疫分析定量的基礎，是衡量物質濃度的客觀尺度(一)標準曲線的手工繪制形態(tài)標準曲線的形態(tài)可因所用的反應變量表達形式的不同，或所采用坐標系統(tǒng)不同而有不同的形態(tài)。(二)標準曲線的基本數學函數式放射免疫分析從抗原抗體反應動力學分析，反應是雙向性的，服從質量作用定律。27二、劑量反應曲線7(三)掌握親和常數K值的計算、意義及應用、平衡常數K又稱親和常數，或叫做結合常數。該常數對特定的抗原抗體反應系統(tǒng)是固定不變的。K的單位為1mol或L/mol。其意義在于可用K值反映抗體之間的親和力。K值與游離抗體濃度呈反比關系。K值越大，則游離的抗體濃度［Ab］越小，結合的抗原抗體復合物［Ag-Ab］濃度越大。即抗原抗體的結合力越大。K值是與抗原抗體共同相關的數值，不能認為僅僅是抗體(或抗原)之間的K值。目前，國內外有多種計算K值的方法，有的非常復雜，而通常使用的方法是Scatchard分析作圖法。28(三)掌握親和常數K值的計算、意義及應用、平衡常數K(四)掌握標準曲線的斜率對測定的影響標準曲線的斜率對放射免疫分析方法的靈敏度和精密度均有影響。影響標準曲線斜率的因素：1、親和常數K2、標記抗原和標準抗原的用量3、特異性抗體的用量(五)掌握Bo(總結合)、T(總管)、NSB的概念29(四)掌握標準曲線的斜率對測定的影響標準曲線的斜率對放射免第二節(jié)放射免疫分析方法學一、掌握建立放射免疫分析方法的必備條件(一)對標準抗原的基本要求(1)標準抗朱與待測抗原的免疫性必須一致，即它們與抗體的親和力和特異性應相同。標準抗原與待測抗原所處的介質條件應基本相同。(2)抗原必須純度度。(3)標準抗原的量必須準確。(4)標準抗原應有很好的穩(wěn)定性。30第二節(jié)放射免疫分析方法學10(二)對抗血清的要求抗血清中含有對其相應抗原的特異性抗體。目前常以抗原免疫年輕、健康的純種小動物而誘發(fā)產生多克隆抗體，選取抗體滴度高的血清，為RIA所用?？寡宓馁|量直接影響放射免疫分析方法的靈活敏度和特異性。檢查抗血清質量的指標主要有親和常數(K)、免疫交叉反應率及滴度(或抗體效價)。31(二)對抗血清的要求11(三)對標記抗原的要求標記抗原是放射性測定的依據，對標記抗原的基本要求：1、標記抗原的免疫活性與待測抗原及標準品必須一致。2、標記抗原要有適當高的放射性比活度。3、標記抗原應具有足夠高的放射化學純度32(三)對標記抗原的要求12(四)分離B與F的方法理想分離應滿足如下要求：1、分離B、F完全、快速。2、不影響免疫反應的平衡條件。3、不受分離操作時的環(huán)境因素(如pH、溫度等)的影響。4、操作簡便，分離試劑的來源豐富且價廉。33(四)分離B與F的方法13目前的分離方法有：1、非特異性分離法(1)吸附法：利用表面活性物質將反應的液中小分子游離部分F吸附，通過離心，將F沉淀，使大分子結合物B留在上清液中，而達到分離的目的。(2)過濾法：反應液中B與F混合物在通過一定規(guī)格孔徑的濾膜時，大分子不會通過濾膜孔被阻留在濾膜上，小分子游離的放射性物質F被抽吸通過濾膜而分離。(3)沉淀法。34目前的分離方法有：142、特異性分離法(1)雙抗法(Ab2法)：應用抗IgG的第二抗體來分離B和F的方法稱為雙抗體法。雙抗體法具有特異、高效、非特異性結合低、重復性好等優(yōu)點。在使用此法時，往往加入適量的第一抗體同種動物血清作載體。同時第二抗體必須是過量(但也不宜過大)，且以不影響反應平衡為宜.(2)固相分離法：將特性抗體(第一或第二抗體)或抗原結合在固相物質。(3)金黃色葡萄球菌A蛋白分離法。352、特異性分離法15二、掌握放射免疫分析的設計方法：(一)標譏抗原和抗體用量最佳化設計。1、標記抗原用量選擇。2、抗血清的使用滴度選擇及其方法。(二)標準抗原劑量設計1、標準抗原劑量范圍2、標準曲線工作范圍(三)加樣順序設計(四)反應介質36二、掌握放射免疫分析的設計方法：16(五)反應容積與溫度及時間1、反應容積縮小反應