核酸電泳相關(guān)試劑、緩沖液的配制方法

核酸電泳相關(guān)試劑、緩沖液的配制方法50×TAEBuffer(pH8.5)組份濃度2MTris-醋酸，100mMEDTA配制量1L配制方法稱量下列試劑，置于1L燒杯中。Tris242gNa2EDTA·2H2O37.2g向燒杯中加入約800ml的去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙狻＜尤?7.1ml的乙酸，充分?jǐn)嚢琛＜尤ルx子水將溶液定容至lL后，室溫保存。10×TBEBuffer(pH8.3)組份濃度890mMTris-硼酸，20mMEDTA配制量1L配制方法稱量下列試劑，置于lL燒杯中。Tris108gNa2EDTA·2H2O7.44g硼酸55g向燒杯中加入約800ml的去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙狻＜尤ルx子水將溶液定容至lL后，室溫保存。10×MOPS(3-嗎啉基丙磺酸)Buffer組份濃度200rnMMOPS，20mMNaOAc，10mMEDTA配制量1L配制方法稱41.8gMOPS，置于1L燒杯中。加約700mlDEPC處理水，攪拌溶解。使用2NNaOH調(diào)節(jié)pH值至7.0。再向溶液中加入下列試劑。1MNaOAc(DEPC處理)20ml0.5MEDTA(pH8.0)(DEPC處理)20ml用DEPC處理水將溶液定容至1L。用0.45m濾膜過(guò)濾除去雜質(zhì)。室溫避光保存。注：溶液見(jiàn)光或高溫滅菌后會(huì)變黃。變黃時(shí)也可使用，但變黑時(shí)不要使用。溴乙錠(10mg/ml)組份濃度10mg/ml溴乙錠配制量100ml配制方法稱量1g溴乙錠，加入到100ml容器中。加入去離子水100ml，充分?jǐn)嚢钄?shù)h完全溶解溴乙錠。將溶液轉(zhuǎn)移至棕色瓶中，室溫避光保存。溴乙錠的工作濃度為0.5g/ml。注意：溴乙錠是一種致癌物質(zhì)，必須小心操作。Agarose凝膠配制方法配制適量的電泳及制膠用的緩沖液(通常是0.5×TBE或1×TAE)。根椐制膠量及凝膠濃度，準(zhǔn)確稱量瓊脂糖粉，加入適當(dāng)?shù)腻F形瓶中。加入一定量的電泳緩沖液(總液體量不宜超過(guò)錐形瓶的50%容量)。注：用于電泳的緩沖液和用于制膠的緩沖液必須統(tǒng)一。在錐形瓶的瓶封上保鮮膜，并在膜上扎些小孔，然后在微波爐中加熱熔化瓊脂糖。加熱過(guò)程中，當(dāng)溶液沸騰后，請(qǐng)戴上防熱手套。小心搖動(dòng)錐形瓶。使瓊脂糖充分均勻熔化。此操作重復(fù)數(shù)次，直至瓊脂糖完全熔化。必須注意，在微波爐中加熱時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，每次當(dāng)溶液起泡沸騰時(shí)停止加熱，否則會(huì)引起溶液過(guò)熱暴沸，造成瓊脂糖凝膠濃度不準(zhǔn)，也會(huì)損壞微波爐。熔化瓊脂糖時(shí)，必須保證瓊脂糖充分完全熔化，否則，會(huì)造成電泳圖像模糊不清。使溶液冷卻至60℃注：溴乙錠是一種致癌物質(zhì)。使用含有溴乙錠的溶液時(shí)，請(qǐng)戴好手套。將瓊脂糖溶液倒入制膠模中，然后在適當(dāng)位置處插上梳子。凝膠厚度一般在3~5min之間。在室溫下使膠凝固(大約30min~1h)，然后放置于電泳槽中進(jìn)行電泳。注：凝膠不立即使用時(shí)，請(qǐng)用保鮮膜將凝膠包好后在4℃瓊脂糖凝膠濃度與線形DNA的最佳分辨范圍瓊脂糖濃度最佳線形DNA分辨范圍(bp)0.5%0.7%1.0%1.2%1.5%2.0%1,000~30,000800~12,000500~10,000400~7,000200~3,00050~2,0006×LoadingBuffer(DNA電泳用)組份濃度30mMEDTA36%(V/V)Glycerol0.05%(W/V)XyleneCyanolFF0.05%(W/V)BromophenolBlue配制量500ml配制方法稱量下列試劑，置于500ml燒杯中。EDTA4.4gBromophenolBlue250mgXyleneCyanolFF250mg向燒杯中加入約200ml的去離子水后，加熱攪拌充分溶解。加入180ml的甘油(Glycerol)后，使用2NNaOH調(diào)節(jié)pH值至7.0。用去離子水定容至500ml后，室溫保存。10×LoadingBuffer(RNA電泳用)組份濃度10mMEDTA50%(V/V)Glycerol0.25%(W/V)XyleneCyanolFF0.25%(W/V)BromophenolBlue配制置10ml配制方法稱量下列試劑，置于10ml離心管中。0.5MEDTA(pH8.0)200μlBromophenolBlue25mgXyleneCyanolFF25mg向離心管中加入約4ml的DEPC處理水后，充分?jǐn)嚢枞芙?。加?ml的甘油(Glycerol)后，充分混勻。用DEPC處理水定容至10ml后，室溫保存。核酸、蛋白質(zhì)雜交用相關(guān)試劑、緩沖液的配制方法20×SSC組份濃度3.0MNaCl，0.3MNa3citrate·2H2O(檸檬酸鈉)配制量1L配制方法稱量下列試劑，置于lL燒杯中。NaCl175.3gNa3citrate·2H2O88.2g向燒杯中加入約800ml的去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙?。滴?4NHCl，調(diào)節(jié)pH值至7.0后，加去離子水將溶液定容至1L。高溫高壓滅菌后，室溫保存。20×SSPEBuffer組份濃度3.0MNaCl，0.2MNaH2PO4，0.02MEDTA配制量1.L配制方法稱量下列試劑，置于lL燒杯中。NaCl175.3NaH2PO4·H2O27.6Na2EDTA·2H2O7.4向燒杯中加入約800ml的去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙?。加NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.4(約6.5ml的10NNaOH)。加去離子水將溶液定容至lL。高溫高壓滅菌后，室溫保存。50XDenhardt’S溶液1%(W/V)Ficoll400(菲可400/水溶性聚蔗糖400)1%(W/V)Polyvinylpyrrolidone(聚維酮/聚乙烯吡咯烷酮)1%(W/V)BSA組份濃度配制量500ml配制方法稱量下列試劑，置于500ml燒杯中。Flcoll4005gPoLyvlnylpyrrolldone5gBSA5g加去離子水約400ml，充分?jǐn)嚢枞芙饧尤ルx子水將溶液定容至500ml。用0.45μm濾膜過(guò)濾后，分裝成每份25ml。-20℃保存。0.5M磷酸鹽Buffer組份濃度0.5MNa2HPO4。配制量lL配制方法稱量134gNa2HPO4·7H2O置于lL燒杯中。加入約800ml的去離子水充分?jǐn)嚢枞芙狻＜尤?5%的H3PO4(濃磷酸)調(diào)節(jié)溶液pH值至7.2。加去離子水定容至1L。高溫高壓滅菌后，室溫保存。SalmonDNA(鮭魚(yú)精DNA)組份濃度10mg/mlSalmonDNA配制量約100ml配制方法稱取鮭魚(yú)精DNA2g置于500ml燒杯中，加入約200ml的TEBuffer。用磁力攪拌器室溫?cái)嚢?~4h，溶解后加入4ml的5MNaCl，使其終濃度為0.1M。用苯酚和苯酚/氯仿各抽提1次?；厥账嗳芤汉?，使用17號(hào)皮下注射針頭快速吸打溶液約20次，以切斷DNA。加入2倍體積的預(yù)冷乙醇進(jìn)行乙醇沉淀。離心回收DNA后，溶解于100ml的去離子水中。測(cè)定溶液的OD260值。計(jì)算溶液的DNA濃度后，稀釋DNA溶液至10mg/ml。煮沸10min后，分裝成小份(1ml/份)。-20℃使用前在沸水浴中加熱5min后，迅速冰浴冷卻。DNA變性緩沖液組份濃度1.5MNaCl，0.5MNaOH配制量1L配制方法稱量下列試劑，置于lL燒杯中。NaCl87.7gNaOH20g向燒杯中加入約800ml的去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙?。加去離子水將溶液定容至lL后，室溫保存。預(yù)雜交液/雜交液(DNA雜交用)6×SSC(或SSPE)5×Denhardt’s0.5%(W/V)SDS100μg/mlSalmonDNA組份濃度配制置100ml配制方法稱量下列試劑，置于200ml燒杯中。20×SSC(或SSPE)30ml50×Denhardt’s10ml10%SDS5ml10mg/mlSalmonDNA1mldH2O54ml充分混勻后，使用0.45μm濾膜濾去雜質(zhì)后使用。預(yù)雜交液/雜交液(RNA雜交用)6×SSC(或SSPE)5×Denhardt‘s0.5%(W/V)SDS100SalmonDNA50%(V/V)Formamlde組份濃度配制量100mL配制方法稱量下列試劑，置于200ml燒杯中。20×SSC(或SSPE)30ml50×Denhardt’s10ml10%SDS5ml10mg/mlSalmonDNA1mlFormamide(甲酰胺)50mldH2O4ml充分混勻后，使用0.45μm濾膜濾去雜質(zhì)后使用。膜轉(zhuǎn)移緩沖液(Western雜交用)組份濃度39mMGlycine，48mMTris，0.037%(W/V)SDS，20%(V/V)甲醇配制量1L配制方法稱量下列試劑，置于lL燒杯中。Glycine2.9gTris5.8gSDS0.37g向燒杯中加入約600ml的去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙?。加去離子水將溶液定溶至800ml后，加入200ml的甲醇。室溫保存。TBSTBuffer(Western雜交膜清洗液)組份濃度20mMTris-HCl，150mMNaCl，0.05%(V/V)Tween20配制量1L配制方法稱量下列試劑，置于lL燒杯中。NaCl8.8g1MTris-HCl(pH8.0)20ml向燒杯中加入約800ml的去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙?。加?.5mlTween20后充分混勻。加去離子水將溶液定容至lL后，4℃封閉緩沖液(Western雜交用)組份濃度5%(W/V)脫脂奶粉/TBSTBuffer配制量100ml配制方法稱5g脫脂奶粉加入到100mlTBSTBuffer中，充分?jǐn)嚢枞芙狻?.4℃實(shí)驗(yàn)室常用培養(yǎng)基的配制方法Ampicillin(氨卡青霉素)(100mg/ml)組份濃度100mg/mlAmpicillin配制量50ml配制方法稱量5gAmpicillin置于50ml離心管中。加入40ml滅菌水，充分混合溶解后，定容至50ml。用0.22μm過(guò)濾膜過(guò)濾除菌。小份分裝(1ml/份)后，-20℃IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)(24mg/ml)組份濃度24mg/mLIPTG配制量50mL配制方法稱1.2gIPTG置于50ml離心管中。加入40ml滅菌水，充分混合溶解后，定容至50ml。用022μm過(guò)濾膜過(guò)濾除菌。4小份分裝(1ml，份)后，-20℃X-Gal(20mg/ml)組份濃度20mg/mlX-Gal配制量50ml配制方法稱量lgX-Gal置于50ml離心管中。加入40mlDMF(二甲基甲酰胺)，充分混合溶解后，定容至50ml。小份分裝(1ml/份)后，-20℃LB培養(yǎng)基組份濃度1%(W/V)Tryptone(胰蛋白胨)，0.5%(W/V)YeastExtract(酵母提取物)，1%(W/V)NaCl配制量1L配制方法稱取下列試劑，置于lL燒杯中。Tryptone10gYeastExtract5gNaCl10g加入約800ml的去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙?。滴?NNaOH(約0.2m1)，調(diào)節(jié)pH值至7.0。加去離子水將培養(yǎng)基定容至1L。5高溫高壓滅菌后，4。C保存。LB/Amp培養(yǎng)基組份濃度1%(W/V)Tryptone0.5%(W/V)YeastExtract1%(W/V)NaCl0.1mg/mlAmpicillin配制量1L配制方法稱取下列試劑，置于lL燒杯中。Tryptone10gYeastExtract5gNaCl10g加入約800ml的去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙?。滴?NNaOH(約0.2mL)。調(diào)節(jié)pH值至7.0。加去離子水將培養(yǎng)基定容至1L。高溫高壓滅菌后，冷卻至室溫。加入1mlAmpicillin(100mg/ml)后均勻混合。4℃保存。TB培養(yǎng)基組份濃度1.2%(W/V)Tryptone2.4%(W/V)YeastExtract0.4%(V/V)Glycerol17mMKH2PO472mMK2HPOa配制量1L配制方法配制磷酸鹽緩；中液(0.17MKH2PO4，0.72MK2HPO4)100ml。溶解2.31gKH2PO4和l2.54gK2HPO4于90ml的去離子水中，攪拌溶解后，加去離子水定容至100ml，高溫高壓滅菌。稱取下列試劑，置于lL燒杯中。Tryptone12gYeastExtract24gGlycerol4m加入約800ml的去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙狻＜尤ルx子水將培養(yǎng)基定容至1L后，高溫高壓滅菌。待溶液冷卻至60℃4℃保存。TB/Amp培養(yǎng)基組份濃度1.2%(W/V)Tryptone2.4%(W/V)YeastExtract0.4%(V/V)Glycerol17mMKH2PO472mMK2HPO40.1mg/mlAmpicillin配制量1L配制方法配制磷酸鹽緩沖液(0.17MKH2PO4，0.72MK2HPO4)100ml。溶解2.31gKH2PO4,和12.54gK2HPO4于90ml的去離子水中，攪拌溶解后，加去離子水定容至100ml，高溫高壓滅菌。稱取下列試劑，置于lL燒杯中。Tryptone12gYeastExtract24gGlycerol4ml加入約800ml的去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙?。加去離子水將培養(yǎng)基定容至lL后，高溫高壓滅菌。待溶液冷卻至60℃以下時(shí)，加入100ml的上述滅菌磷酸鹽緩沖液均勻混合后4℃SOB培養(yǎng)基組份濃度2%(W/V)Tryptone0.5%(W/V)YeastExtract0.05%(W/V)NaCl2.5mMKCl10mMMgCl2配制量1L配制方法配制250mMKCl溶液。在90ml的去離子水中溶解l.86gKCl后，定容至100ml。配制2MMgCl2溶液。在90ml去離子水中溶解19gMgCl2后，定容至100ml，高溫高壓滅菌。稱取下列試劑，置于lL燒杯中。Tryptone20gYeastExtract5gNaCl0.5g加入約800ml的去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙狻Ａ咳?0m1250mMKCl溶液，加入到燒杯中。滴加5NNaOH溶液(約0.2m1)，調(diào)節(jié)pH值至7.0。加入去離子水將培養(yǎng)基定容至lL。高溫高壓滅菌后，4℃使用前加入5ml滅菌的2MMgCl2溶液。SOC培養(yǎng)基組份濃度2%(W/V)Tryptone0.5%(W/V)YeastExtract0.05%(W/V)NaCl2.5mMKCl10mMMgCl220mMGlucose配制量100mL配制方法配制lMGlucose溶液。將18gGlucose溶于90ml去離子水中，充分溶解后定容至100ml。用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌。向l00mlSOB培養(yǎng)基中加入除菌的1MGlucose溶液2ml，均勻混合。4℃保存。2×YT培養(yǎng)基組份濃度1.6%(WV)Tryptone，1%(W/V)YeastExtract，0.5%(W/V)NaCl配制量1L配制方法稱取下列試劑，置于lL燒杯中。Tryptone16gYeastExtract10gNaCl5g加入約800ml的去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙狻５渭?NNaOH，調(diào)節(jié)pH值至7.0。加去離子水將培養(yǎng)基定容至1L。高溫高壓滅菌后，4℃Фb×broth組份濃度2%(W/V)Tryptone，0.5%(W/V)YeastExtract，o5%(W/V)MgSO4·7H2O配制量1L配制方法稱取下列試劑，置于lL燒杯中。Tryptone20gYeastExtract5gMgSO4·7H2O5g加入約800ml的去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙狻５渭?NKOH。調(diào)節(jié)pH值至7.5。加去離子水將培養(yǎng)基定容至1L。高溫高壓滅菌后，4℃NZCYM培養(yǎng)基組份濃度0.5%(WV)YeastExtract0.1%(WV)CasaminoAcid（酪蛋白氨基酸）1%(WV)NZ胺0.5%(WV)NaCl0.2%(WV)MgSO4·7HO配制量1L配制方法稱取下列試劑。置于lL燒杯中。YeastExtract5gCasaminoAcid1gNZ胺10gNaCl5gMgSO4·7HO2g加入約800ml的去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙?。滴?NNaOH(約0.2m1)，調(diào)節(jié)pH值至7.0。加去離子水將培養(yǎng)基定容至1L。高溫高壓滅菌后，4℃NZYM培養(yǎng)基組份濃度0.5%(WV)YeastExtract1%(WV)NZ胺0.1%(WV)NaCl0.2%(WV)MgSO4·7HO配制方法NZYM培養(yǎng)基除不含CasaminoAcid外，其他成份與NZCYM培養(yǎng)基相同。NZM培養(yǎng)基組份濃度1%(WV)NZ胺0.1%(WV)NaCl0.2%(WV)MgSO4·7HO配制方法：NZM培養(yǎng)基除不含YeastExtract(酵母提取物)外，其他成份與NZYM培養(yǎng)基相同。一般固體培養(yǎng)基的配制配制方法1.按照液體培養(yǎng)基配方準(zhǔn)備好液體培養(yǎng)基，在高溫高壓滅菌前，加入下列試劑中的一種。Agar(瓊脂；鋪制平板用)15g/LAgar(瓊脂；配制頂層瓊脂用)7g/LAgarose(瓊脂糖；鋪制平板用)15g/LAgarose(瓊脂糖；配制頂層瓊脂用)7g/L高溫高壓滅菌后，戴上手套取出培養(yǎng)基，搖動(dòng)容器使瓊脂或瓊脂糖充分混勻(此時(shí)培養(yǎng)基溫度很高，小心燙傷)。待培養(yǎng)基冷卻至50~60℃鋪制平板(30~35ml培養(yǎng)基/90mmLB/Amp/X-Gal/LPTG平板培養(yǎng)基組份濃度1%(W/V)Tryptone0.5%(W/V)YeastExtract1%(W/V)NaCl0.1mg/mlAmpicillin0.024mg/mlIPTG0.04mg/mlX-GaL1.5%(W/V)Agar配制量1L配制方法稱取下列試劑，置于lL燒杯中。Tryptone10gYeastExtract5gNaCl10g加入約800ml的去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙?。滴?NNaOH(約0.2mL)，調(diào)節(jié)pH值至7.0。加去離子水將培養(yǎng)基定容至1L后，加入15g高溫高壓滅菌后，冷卻至60℃加入1mlAmpicillin(100mg/ml)、1mlIPTG(24mg/ml)、2mlX-Gal(20mg/mL)后均勻混合。鋪制平板(30~35ml培養(yǎng)基/90mm培養(yǎng)皿)。8.4℃TB/Amp/X-Gal/LPTG平板培養(yǎng)基組份濃度1.2%(W/V)Tryptone2.4%(W/V)YeastExtract0.4%(V/V)Glycerol17mMKH2PO472mMK2HPO40.1mg/mlAmpicillin0.024mg/mlIPTG0.04mg/mLX-GaL1.5%(W/V)Agar配制量1L配制方法配制磷酸鹽緩沖液(0.17MKH2PO4，0.72MK2HPO4)100ml。溶解2.31gKH2PO4和12.54稱取下列試劑，置于lL燒杯中。Tryptone12gYeastExtract24gGlycerol4ml加入約800ml的去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙?。加去離子水將培養(yǎng)基定容至1L后。加入l5gAgar。高溫高壓滅菌后，冷卻至60℃加入100ml的上述滅菌磷酸鹽緩沖液、lmlAmpicillin(100mg/ml)、1mlIPTG(24mg/mL)、2mlX-Gal(20mg/ml)后均勻混合。鋪制平板(30~35ml培養(yǎng)基/90mm4℃避光保存。抗生素的貯存溶液及其工作濃度抗生素貯存液*1工作濃度濃度保存條件嚴(yán)緊型質(zhì)粒松弛型質(zhì)粒氨芐青霉素羧芐青霉素氯霉素卡那霉素鏈霉素四環(huán)素*250mg/ml(溶于水)-2050mg/mL(溶于水)-2034mg/mL(溶于乙醇)-2010mg/mL(溶于水)-2010mg/mL(溶于水)-205mg/mL(溶于乙醇)-2020μg/ml60μg/ml20μg/ml60μg/ml25μg/mll70μg/mL10μg/ml50μg/ml10μg/ml50μg/ml10μg/ml50μg/mL*1以水為溶劑的抗生素貯存液應(yīng)通過(guò)0.22μm濾器過(guò)濾除菌。以乙醇為溶劑的抗生素溶液無(wú)須除菌處理。所有抗生素溶液均應(yīng)保存于不透光的容器中。*2鎂離子是四環(huán)素的拮抗劑，四環(huán)素抗性菌的篩選應(yīng)使用不含鎂鹽的培養(yǎng)基(如LB培養(yǎng)基)。SDS濃縮膠(5%Acrylamide)配方表各種組份名稱各種凝膠體積所對(duì)應(yīng)的各種組份的取樣量1m12m13m14ml5ml6m18m110mLH2O30%Acrylamide1.0MTris-HCl(pH6.8)10%SDS10%過(guò)硫酸銨TEMED.0.681.42.12.73.44.15.56.80.170.330.50.670.831.01.3170.130.250.380.50.630751.0l.250.010.020.030.040.050060.080.10.010.020.030.040.050.060.080.10.0010.0020.0030.0040.0050.0060.0080.01SDS分離膠配方表各種組份名稱各種凝膠體積所對(duì)應(yīng)的各種組份的取樣量5m110m115m120ml25m130m140m150ml6%GelH2O30%Acrylamide1.5MTris-HCl(pH8.8)10%SDS10%過(guò)硫酸銨TEMED8%GelH2O30%Acrylamide1.5MTris-HCl(pH88)10%SDS10%過(guò)硫酸銨TEMED10%GeLH2O30%Acrylamide1.5MTris+HCl(pH8.8)10%SDS10%過(guò)硫酸銨TEMED12%GeLH2O30%Acrylamide1.5MTris-HCl(pH8.8)10%SDS10%過(guò)硫酸銨TEMED15%GelH2O30%Acrylamide1.5MTris-HCl(pH8.8)10%SDS10%過(guò)硫酸銨TEMED2.65.37.010.613.215.921.226.51.02.0304.05.06.08.010.01.32.53.85.06.37.510.012.50.050.10.150.20.250.30.40.50.0.050.10.150.20.250.30.40.50.0040.0080.010.0040.0080.0120.0150.020.0240.0320.042.34.66.99.311.513.918.523.21.32.74.05.36.78.010.713.31.32.53.85.06.37.510.012.50.050.10.150.20.250.30.40.50.0.050.10.15020.250.3040.5