精液分析的質(zhì)量控制(陸金春)課件

按照WHO5規(guī)范化評估男性生育力:

精液分析的質(zhì)量控制

1主要內(nèi)容QC的概念精液分析QC的重要性質(zhì)量控制的過程精子濃度、活力及形態(tài)學(xué)分析的質(zhì)量控制精漿生化檢測的質(zhì)量控制抗精子抗體檢測的質(zhì)量控制質(zhì)量控制的實施措施2

質(zhì)量控制（QC）

即質(zhì)量管理。實驗室為了達到質(zhì)量的要求，自行或由權(quán)威部門建立觀察分析步驟的變異性，隨時評估檢測結(jié)果準確性的一系列相關(guān)制度。

目的：尋找和發(fā)現(xiàn)檢測分析過程中的誤差和產(chǎn)生誤差的原因，保持檢測結(jié)果準確性的穩(wěn)定。

是達到質(zhì)量保證（QA）的一種手段3QC的重要性

保證不同時間同一實驗室檢驗結(jié)果的一致性；保證不同實驗室檢驗結(jié)果的可比性5

質(zhì)量控制過程

分析前質(zhì)量控制：精液樣本的留取、接受、編號、保存等分析中質(zhì)量控制：精液分析過程中的質(zhì)控措施，如質(zhì)控品、SOP、95%可信區(qū)間等分析后質(zhì)量控制：報告的正確發(fā)出至臨床醫(yī)生做出診斷61.禁欲時間因素待做精液常規(guī)檢查者的禁欲天數(shù)規(guī)定為2-7天。

2.精液收集的完整性因素推薦采用廣口容器為采精器皿，保證精液沒有丟失。3.精液體積測量的準確性因素采用5版推薦的天平稱重法計算精液體積（推薦使用自動去皮的精密度達0.01g的天平），這是獲得一次射精的精子總數(shù)的關(guān)鍵步驟。分析前質(zhì)量控制74.雜質(zhì)的干擾因素使用第5版推薦的相差顯微鏡，相差顯微鏡這種高級光學(xué)系統(tǒng)能使精液中的大部分雜質(zhì)與精子區(qū)分，使精子頭部發(fā)光，雜質(zhì)顯示為灰色，這樣可以過濾大部分的雜質(zhì)。5.計數(shù)板間隙的準確性因素

計數(shù)板間隙對濃度檢測數(shù)據(jù)的準確性的影響巨大，常使誤差達50%以上。計數(shù)板的深度按照5版要求每6~12個月必須校準一次。分析前質(zhì)量控制8不論是10μm深的計數(shù)池（Makler、Macro、Geoffrey）還是20μm深的計數(shù)池(Glodcyto、Leja、Cell-VU)，沒有一種精子計數(shù)池的深度是100%的合格。Makler、Macro和Geoffrey計數(shù)池的深度分別為（12.72±1.08）、（10.19±0.48）和（10.00±0.28）μm，Glodcyto、Leja和Cell-VU計數(shù)池的深度分別為（23.76±2.15）、（20.49±0.22）、（24.22±2.58）μm。Geoffrey計數(shù)池的合格率最高，為94.12%，其次為Macro（65.63%）和Leja（35%）計數(shù)池，其余三種計數(shù)池的合格率均為0。105種精子計數(shù)池的深度分別為8.1、9.1、10.2、11.1、11.9μm。不同深度的精子計數(shù)池計數(shù)的低、高濃度質(zhì)控珠濃度結(jié)果均有顯著差異（P<0.01），但低、高濃度質(zhì)控珠濃度與計數(shù)池深度均呈顯著正相關(guān)（r均為0.997，P均<0.01）。以10.2μm的計數(shù)板為基準（100%），5種計數(shù)板深度的相應(yīng)校正系數(shù)分別為：1.26（10.2/8.1）、1.12（10.2/9.1）、1.00（10.2/10.2）、0.92（10.2/11.1）和0.86（10.2/11.9），校正后的各計數(shù)池相對偏差均低于5%。31例精液標本用不同深度的精子計數(shù)池進行檢測，精子濃度結(jié)果類似于質(zhì)控珠懸液。12我們利用Filmetrics間隙測量儀精確測量4種不同深度的Geoffrey精子計數(shù)池，然后按照WHO5手冊的要求利用CASA系統(tǒng)分析36例精液標本的前向運動精子百分率（PR）、非前向運動精子百分率（NP）和總活動率（PR+NP），并進行比較分析。

實驗三144種精子計數(shù)池的深度分別為9.8、12.7、15.7和19.9μm，測得的PR分別為（44.00±11.63）%、（41.96±12.62）%、（40.86±11.71）%和（37.78±11.38）%，NP分別為（13.54±3.01）%、（14.13±2.94）%、（14.91±3.02）%和（16.53±2.77）%，總活動率分別為（57.53±11.06）%、（56.08±11.97）%、（55.78±11.55）%和（54.31±12.11）%。精子計數(shù)板深度與PR呈顯著負相關(guān)（r=-0.993，P<0.05），與NP呈顯著正相關(guān)（r=0.989，P<0.05），與活動率呈顯著負相關(guān)（r=-0.978，P<0.05）。盡管精子總活動率在4種不同深度的計數(shù)池之間沒有顯著差異，但PR和NP在9.8μm深的計數(shù)池和19.9μm深的計數(shù)池之間均有顯著性差異（P<0.05）。15精子計數(shù)池的深度對精子活力的影響不容忽視，不同深度計數(shù)池獲得的結(jié)果差異將會給臨床醫(yī)生對患者做出正確的診斷（如弱精子癥）和采取合適的治療措施帶來一定的負面影響。不同深度的精子計數(shù)池應(yīng)有相應(yīng)的精子活力正常參考值范圍。166.檢測時間和液化程度的影響檢查精子活力，必須在精液完全液化后進行，最好在60分鐘以內(nèi)進行檢測，以防止脫水、pH值或溫度的變化對精子活力的有害影響。對射出60分鐘后仍沒有完全液化的精液，必須采取措施促使其液化，常用的方法是用注射器連接18號鈍性針頭反復(fù)緩慢抽吸，或加入等體積的培養(yǎng)液用加樣器反復(fù)吹打，也可以使用菠蘿蛋白酶消化。分析前質(zhì)量控制17分析前質(zhì)量控制7.充分混勻后取樣為確保獲得可重復(fù)的數(shù)據(jù)，在取樣用于檢測前，應(yīng)充分混勻標本。當(dāng)重復(fù)取樣的結(jié)果一致時才能認可此測定值?；靹蚓簳r不要太劇烈震蕩而產(chǎn)生氣泡。不要在漩渦震蕩器上高速混勻，這樣會損傷精子。建議使用盤式混勻器或三維混勻器。18分析精子數(shù)為了獲得可接受的較低的吸樣誤差，每次至少分析200條精子評價相同的計數(shù)池兩次，或評價從單一稀釋液充兩次的池都不是真正的重復(fù)，由于其不能反映吸樣、混合和稀釋的誤差20通過評估更多精子可以減小取樣誤差，但需權(quán)衡增加精確度與時間花費及因檢測人員疲勞導(dǎo)致準確性下降之間的利弊。當(dāng)至少計數(shù)400個精子時，抽樣誤差相對較小，約5%。精子計數(shù)與取樣誤差21表示存在計數(shù)錯誤或者取樣誤差，或者精液未充分混勻，以及在計數(shù)池上精子未隨機分布。此時需要放棄第一次的兩個值并重復(fù)評估（不要計數(shù)第三個樣本，取3個值的平均值，或者取3個值中最相近的兩個值的平均值）。對一些不常見的精液標本，如非均質(zhì)的精液標本，甚至取第三批重復(fù)樣本仍不能獲得可接受差異值。在這種情況下，計算所有重復(fù)樣本的平均值，并記錄在報告中。當(dāng)計數(shù)結(jié)果大于可接受差異23不同類型標本的處理方法高濃度精液標本

運用CASA分析時，精子濃度高于50×106/ml的標本，由于精子之間的相互碰撞，會影響CASA的分析質(zhì)量，為了保證CASA對于濃度分析的準確性，可對標本進行稀釋。

一般儀器對于50×106/ml—100×106/ml濃度的標本能夠進行分析，但準確性不高，要發(fā)表論文或者質(zhì)控要求高的實驗室最好對高于50×106/ml的標本進行稀釋。濃度超過100×106/ml的標本必須進行稀釋24CASA較人工分析的優(yōu)勢用CASA（計算機輔助精液分析）分析精子活力，較人工方法具有兩大優(yōu)勢：高精確性和提供精子動力學(xué)參數(shù)的量化數(shù)據(jù)

（前向運動和超活化運動，即獲能精子特征參數(shù)）。CASA分析視頻記錄的功能更容易實現(xiàn)標準化和更好地實施質(zhì)量保證程序。26

WHO第5版對評估精子活力的溫度條件非常重視，要求每個實驗室都必須標準化。雖然室溫和37℃都可取，但我國幅員遼闊，各地氣溫相差很大，室內(nèi)保溫條件各不相同，唯有統(tǒng)一37℃的恒溫標準才能使檢測結(jié)果可以比較。WHO第5版提出：在37℃評估精子活力，保溫板（計數(shù)板）應(yīng)預(yù)熱10分鐘。最好在帶有恒溫載物臺的顯微鏡下進行檢查。同時標本也必須在相同的溫度下孵育。27分析時要注意的細節(jié)1.加樣后應(yīng)靜置5~15秒再檢查，避免液體流動（漂移）影響判斷。但最好在10分鐘內(nèi)檢查完畢，防止溫度變化和脫水等因素對精子活力的影響。2.為防止干燥影響觀察精子活力的效果，應(yīng)在距離蓋玻片（實際可檢查范圍）邊緣至少5mm的區(qū)域觀察精子。3.為了避免重復(fù)觀察相同的區(qū)域，最好根據(jù)精子濃度利用網(wǎng)格事先隨機選擇視野。在視野中界定的區(qū)域內(nèi)要評估所有精子的活力。

28精子形態(tài)學(xué)分析的質(zhì)量控制30精子形態(tài)學(xué)分析操作的標準化精子形態(tài)學(xué)分析過程中的所有操作步驟都可能影響精子形態(tài)學(xué)分析的結(jié)果，如精液樣本的洗滌、制片、固定、染色方法、顯微鏡質(zhì)量、自動化分析系統(tǒng)的質(zhì)量等。

31正常形態(tài)精子判斷標準的一致性精子頭外形上應(yīng)該是光滑、輪廓規(guī)則，大體上呈橢圓形，頂體區(qū)可清晰分辨，占頭部的40%~70%，沒有大空泡，并且不超過2個小空泡，空泡大小不超過頭部的20%，頂體后區(qū)不含任何空泡中段應(yīng)該細長、規(guī)則，大約與頭部長度相等，中段主軸應(yīng)與頭部長軸成一條直線，殘留胞漿不超過精子頭大小的1/3；主段應(yīng)該比中段細，均一，長約45um，可以自身卷曲成環(huán)狀，尾部沒有顯示鞭毛折斷的銳利折角。

32α葡糖苷酶、ACP、Zn、果糖等嚴格的標準操作程序（SOP）標準液的吸光度相對恒定或定標室內(nèi)質(zhì)控品（每次與樣本同時檢測）精漿生化檢測的質(zhì)量控制33抗精子抗體檢測的質(zhì)量控制嚴格的SOP（加樣、稀釋、洗滌、孵育時間等）每次帶有陰、陽性對照準備兩種試劑，陽性樣本復(fù)核陽性判斷標準

34QC的實施措施35QC樣本來源購買——比較貴、缺乏，有靶值實驗室制備——費用低，靶值未知精子濃度QC樣本：乳膠珠、保存時間、聚集精子形態(tài)學(xué)QC樣本：固定或染色玻片精子活動率QC樣本：錄像帶、DVD視頻、網(wǎng)格膠片精漿生化和AsAb的QC樣本：中、低值精漿，陽性精漿36QC圖——Xbar圖

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QC圖的基本控制規(guī)則

一個結(jié)果在控制線之外隨機誤差3個點中的2個在警告線之外

系統(tǒng)誤差5個點中的4個在警告線之外系統(tǒng)誤差兩個連續(xù)的結(jié)果均在上或下控制線之外系統(tǒng)誤差兩個連續(xù)的結(jié)果一個在上控制線外，一個在下控制線外隨機誤差8個連續(xù)的結(jié)果均在均值上或下系統(tǒng)誤差

38失控的原因

樣本不恰當(dāng)?shù)幕靹颍ǔＲ娪谡吵淼暮陀芯奂臉颖荆┘夹g(shù)人員緊張（如奇怪的吸樣或記錄誤差）技術(shù)較差（如粗心的吸樣或處理玻片或計數(shù)池充池）不恰當(dāng)?shù)呐嘤?xùn)（如精子計數(shù)鑒定的系統(tǒng)差異、正常形態(tài)的分類、來自計算錯誤的偏差）儀器誤差（如磨損或未校正的自動吸樣槍，不重合的顯微鏡，不準確的天平、計數(shù)池深度不準確等）QC樣本的變質(zhì)設(shè)備的改變，特別是吸樣器和計數(shù)池的改變操作或?qū)嶒炇噎h(huán)境的改變39失控的解決

當(dāng)結(jié)果失控時，可能的原因和采取的正確措施應(yīng)該被記錄。如果問題不明顯，再次分析QC樣本以檢測最初結(jié)果是不是不常見。如果QC結(jié)果仍然在控制限之外，必須找