三維培養(yǎng)干細胞自我更新與定向分化的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

項目名稱：三維培養(yǎng)干細胞自我更新與定向分化的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)首席科學(xué)家：戴建武中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所起止年限：2011.1至2015.8依托部門：中國科學(xué)院

二、預(yù)期目標(biāo)本項目的總體目標(biāo)：通過本項目的實施，建立干細胞三維培養(yǎng)和完善干細胞納米示蹤技術(shù)，解析干細胞自我更新與分化過程中遺傳與表觀遺傳的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為干細胞的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。取得一批具有重大影響的科研成果，提高我國在干細胞研究領(lǐng)域的自主創(chuàng)新能力。五年預(yù)期目標(biāo):1．綜合考慮多種因素，最大限度模擬體內(nèi)環(huán)境，制備出適合干細胞生長分化的三維支架材料，建立三維培養(yǎng)多能干細胞和成體干細胞的自我更新和定向分化的研究體系。包括標(biāo)準干細胞系的鑒定、維持、分析方法、保存與復(fù)蘇、人員培訓(xùn)等基礎(chǔ)設(shè)施和科研能力，建立三維培養(yǎng)4-6種不同干細胞的方法。建立一個全國公用的干細胞三維培養(yǎng)研究的培訓(xùn)基地。2.結(jié)合基因組、蛋白質(zhì)組和磷酸蛋白質(zhì)組分析結(jié)果探討三維培養(yǎng)條件下干細胞自我更新和定向分化的分子和細胞機制，闡明在干細胞自我更新和定向分化中起關(guān)鍵調(diào)控作用的信號通路和信號網(wǎng)絡(luò)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。3．通過模式動物體內(nèi)干細胞維持與定向分化研究，發(fā)現(xiàn)并鑒定與神經(jīng)干細胞的維持、分化相關(guān)的一些新基因，闡明其作用機制。明確體外三維培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞在體內(nèi)的自我更新能力與分化潛能，并對其導(dǎo)入體內(nèi)后的有效性、安全性進行評估。分析三維培養(yǎng)干細胞與體內(nèi)干細胞維持與分化機制的異同，獲得干細胞調(diào)控的真實信息。4.建立干細胞納米示蹤與成像新技術(shù)，包括制備出高生物相容性、高量子產(chǎn)率的量子點，建立量子點標(biāo)記活細胞及亞細胞組分的方法，實現(xiàn)對三維培養(yǎng)干細胞以及活體干細胞的特異性標(biāo)記，建立三維培養(yǎng)干細胞和活體干細胞的三維、非損傷性的納米示蹤與成像技術(shù)。5．培養(yǎng)研究生30名。博士后10名。6．在本領(lǐng)域發(fā)表論文30篇，其中影響因子5以上的15篇。

三、研究方案1）學(xué)術(shù)思路：干細胞的自我更新和定向分化是干細胞研究中的基本問題。在體內(nèi)，干細胞的自我更新和分化是處于三維環(huán)境中，體外三維培養(yǎng)體系下細胞的行為學(xué)特性近似于體內(nèi)細胞的特性。本項目將建立模擬體內(nèi)環(huán)境的干細胞三維培養(yǎng)體系，并利用干細胞納米標(biāo)記與成像技術(shù)，研究三維培養(yǎng)干細胞自我更新和定向分化的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在體內(nèi)研究中，以線蟲和小鼠為模式動物，系統(tǒng)研究體內(nèi)干細胞的維持、分化調(diào)控機制。2）技術(shù)途徑：根據(jù)研究內(nèi)容，本項目技術(shù)途徑如圖所示：具體內(nèi)容如下：適合不同類型干細胞培養(yǎng)的三維膠原支架的構(gòu)建分離純化膠原蛋白，制備三維膠原支架材料，檢測其生物相容性，運用不同生產(chǎn)工藝使其具有適宜的硬度和孔隙結(jié)構(gòu)，建立適合不同類型干細胞培養(yǎng)的三維支架材料。2）三維膠原支架材料的修飾、優(yōu)化在膠原支架材料的基礎(chǔ)上，將微環(huán)境中調(diào)控干細胞自我更新和定向分化的其它細胞外基質(zhì)成份、信號分子或支持細胞等因素通過不同的方法整合到膠原支架材料上，對三維膠原支架材料進行修飾優(yōu)化，以最大限度的模擬體內(nèi)干細胞自我更新和定向分化的環(huán)境。3）干細胞三維培養(yǎng)體系的建立干細胞選擇多潛能干細胞（ES細胞和iPS細胞）和成體干細胞（神經(jīng)干細胞、心肌干細胞、骨骼肌干細胞）。（1）用納米量子點-熒光標(biāo)記結(jié)合活細胞成像技術(shù)記錄和追蹤經(jīng)干細胞誘導(dǎo)分化的神經(jīng)細胞在三維培養(yǎng)介質(zhì)中的粘附、生長、遷移和運動等動態(tài)行為。在亞細胞水平用活體成像技術(shù)觀測參與調(diào)控細胞行為的細胞骨架(如actin或tubulin的熒光融合蛋白)及其他因子的動態(tài)變化。（2）將不同干細胞接種于適宜的三維膠原支架材料，與二維培養(yǎng)體系相比較，利用芯片技術(shù)對二者基因表達情況進行比較，分析在三維培養(yǎng)條件下干細胞的基因表達情況，利用westernblot等技術(shù)對關(guān)鍵因子的蛋白表達進行定量分析。綜合利用細胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的方法對兩種培養(yǎng)體系下細胞的干細胞特性進行比較。4）干細胞自我更新調(diào)控機制研究（1）將干細胞接種于適宜的三維膠原支架材料，進行自我更新和定向分化研究。分離提取細胞RNA用Q-PCR檢測干細胞及分化細胞標(biāo)志蛋白以及調(diào)節(jié)干細胞定向分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的表達，分離提取細胞總蛋白檢測干細胞及分化細胞標(biāo)志蛋白表達水平。用針對integrin等細胞表面標(biāo)記以及細胞骨架蛋白的特異性抗體，通過免疫熒光染色比較二維和三維環(huán)境中干細胞及其定向分化細胞的細胞形態(tài)、粘附特性及運動特性。（2）三維培養(yǎng)干細胞的發(fā)育潛能研究，在建立胚胎干細胞三維培養(yǎng)體系的基礎(chǔ)上，探索三維培養(yǎng)胚胎干細胞的發(fā)育潛能，體外研究中重點探索三維胚胎干細胞向神經(jīng)、心肌等細胞分化的能力及其調(diào)控機制，體內(nèi)利用嵌合以及四倍體補償?shù)确椒ㄨb定三維培養(yǎng)的胚胎干細胞體內(nèi)發(fā)育潛能及細胞多能性。（3）以生物化學(xué)方法檢測三維培養(yǎng)環(huán)境中干細胞的自我更新和分化受外界信號調(diào)控的各種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的動態(tài)變化，并與通過細胞生物學(xué)手段檢測信號通路中各組分激活狀態(tài)的亞細胞分布相結(jié)合，檢測其下游靶基因的表達水平，以分析細胞中各種信號通路的整合情況，解析干細胞對于不同培養(yǎng)條件作出反應(yīng)的分子基礎(chǔ)。其中自我更新研究將以ES細胞和iPS細胞為主，探討其以O(shè)ct4和Nanog為中心的干細胞自我更新的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；。5）干細胞定向分化調(diào)控機制研究（1）選擇成體干細胞包括神經(jīng)、心肌和成肌干細胞，將干細胞接種于三維支架材料上，檢測比較二維和三維培養(yǎng)的神經(jīng)、心肌和成肌干細胞分化過程中的細胞學(xué)特性，包括細胞形態(tài)變化、標(biāo)志蛋白表達及細胞功能等。將干細胞接種于適宜的三維膠原支架材料，進行定向分化研究。通過細胞形態(tài)觀察及免疫熒光染色檢測干細胞定向誘導(dǎo)分化后產(chǎn)生的細胞類型（針對神經(jīng)干細胞分化產(chǎn)生的細胞類型將分別用神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞及寡樹突細胞標(biāo)志蛋白的特異抗體（神經(jīng)元TuJ1及MAP2，星形膠質(zhì)細胞GFAP，寡樹突細胞OSP）作免疫熒光染色,針對人胚胎干細胞分化產(chǎn)生的心肌細胞類型將分別用α-肌漿球蛋白重鏈（α-MHC）、肌鈣蛋白C、心房利鈉肽（ANP）等標(biāo)志蛋白的特異抗體作免疫熒光染色,骨骼肌標(biāo)志蛋白MHC和Caveolin-3）。例如肌原代成肌細胞或肌源性細胞系C2C12細胞在增殖階段的培養(yǎng)條件為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，誘導(dǎo)分化的培養(yǎng)條件為含2%馬血清的DMEM培養(yǎng)基，一般5～6天細胞可以分化成肌管。針對成肌干細胞分化產(chǎn)生的骨骼肌細胞將分別用骨骼肌標(biāo)志蛋白MHC和Caveolin-3作免疫熒光染色。分離提取細胞RNA用Q-PCR檢測干細胞及分化細胞標(biāo)志蛋白以及調(diào)節(jié)干細胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的表達，分離提取細胞總蛋白檢測干細胞及分化細胞標(biāo)志蛋白表達水平。檢測并比較二維和三維培養(yǎng)的神經(jīng)、心肌和成肌干細胞在分化過程中亞細胞結(jié)構(gòu)水平的變化，用針對integrin等細胞表面標(biāo)記以及細胞骨架蛋白的特異性抗體，通過免疫熒光染色比較二維和三維環(huán)境中干細胞及其定向分化細胞的細胞形態(tài)、粘附特性及運動特性。通過與課題組四合作，用納米量子點-熒光標(biāo)記結(jié)合活細胞成像技術(shù)記錄和追蹤經(jīng)干細胞誘導(dǎo)分化的神經(jīng)細胞在三維培養(yǎng)介質(zhì)中的粘附、生長、遷移和運動等動態(tài)行為。在亞細胞水平用活體成像技術(shù)觀測參與調(diào)控細胞行為的細胞骨架(如actin或tubulin的熒光融合蛋白)及其他因子的動態(tài)變化。（2）運用生化方法檢測并比較二維和三維培養(yǎng)的干細胞分化過程中受外界信號因子誘導(dǎo)產(chǎn)生的細胞內(nèi)信號通路的動態(tài)變化，并與通過細胞生物學(xué)手段檢測信號通路中各組分激活狀態(tài)的亞細胞分布相結(jié)合，并檢測其下游靶基因的表達水平，分析它們各自信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑整合的特性，解析干細胞對于不同培養(yǎng)條件作出反應(yīng)的分子基礎(chǔ)。其中神經(jīng)細胞的研究將以Erk及mTOR信號通路為主，肌細胞的研究將以PI3K/AKT/GSK3β信號通路為主。此外，我們已發(fā)現(xiàn)哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通過STAT3-p63-Jagged-Notch級聯(lián)調(diào)控細胞維持細胞增殖和分化之間的平衡。功能低下或高度活化的mTOR信號通過影響Notch信號抑制細胞分化。因此計劃探討三維培養(yǎng)條件下干細胞定向分化的分子和細胞機制，闡明在干細胞定向分化中mTOR信號傳導(dǎo)通路是否起關(guān)鍵調(diào)控作用。研究方案如下：分離選擇小鼠條件性mTOR、PTEN或Tsc1基因敲除(mTOR活化)的成體干細胞包括神經(jīng)和成肌干細胞，將干細胞接種于三維支架材料上，然后將TAT-NLS-Cre融合蛋白質(zhì)加入細胞培養(yǎng)液，融合蛋白質(zhì)將會被細胞攝取、入核，敲除mTOR基因或Tsc1基因，從而下調(diào)或上調(diào)mTOR通路的活性，然后檢測比較二維和三維培養(yǎng)的神經(jīng)、心肌和成肌干細胞分化過程中的細胞學(xué)特性，包括細胞形態(tài)變化、標(biāo)志蛋白表達及細胞功能等。還可讓這些小鼠與組織特異性CRE表達小鼠交配，在小鼠體內(nèi)敲除mTOR、PTEN或Tsc1，以明確mTOR在干細胞的定向分化中的作用。小鼠條件性敲除胚胎干細胞(loxp-mTOR-loxp)已從歐洲條件性基因敲除小鼠項目（EuropeanConditionalMouseMutagenesisprogram）得到，將培育loxp-mTOR-loxp轉(zhuǎn)基因小鼠，為條件性敲除mTOR小鼠做準備。已有條件性Pten或Tsc1基因敲除小鼠和神經(jīng)、肌肉CRE表達小鼠。（3）鑒定人胚胎干細胞向心肌前體細胞分化過程中起關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)和關(guān)鍵調(diào)節(jié)通路表達KDR的細胞是心肌細胞的前提細胞。利用我們現(xiàn)有的心肌分化培養(yǎng)體系，將人胚胎干細胞在三維條件下分化成心肌細胞，并在相應(yīng)的時間點，利用流式細胞分離儀分離取得KDR表達的心肌前體細胞和非表達細胞，然后再利用microarray或深度測序技術(shù)獲取這二類細胞的基因表達數(shù)據(jù)，并通過二者之間和與為分化的胚胎干細胞表達譜對比，找到在這一分化過程中上調(diào)和下調(diào)的前500個基因，并通過UCSCmm8得到這些基因的啟動子序列，最后利用CREADpackage的Motifclass來發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)在這些啟動子中的具有代表性的（按出現(xiàn)頻率劃分）轉(zhuǎn)錄因子DNA結(jié)合位點。通過這些轉(zhuǎn)錄因子DNA結(jié)合位點來找到調(diào)節(jié)這一細胞分化過程的轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)。最后，利用可誘導(dǎo)的基因表達系統(tǒng)在胚胎干細胞中驗證這些轉(zhuǎn)錄因子在心肌分化中的功能。6）三維培養(yǎng)干細胞自我更新和定向分化的表觀調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究（1）系統(tǒng)定量地分析在二維和三維培養(yǎng)條件下未分化干細胞和經(jīng)誘導(dǎo)分化細胞之間的總蛋白質(zhì)組和重要的蛋白質(zhì)修飾（包括磷酸化、乙?；头核鼗┑牟町悾瑥亩页鲈谌S培養(yǎng)條件下控制干細胞自我更新與定向分化的特異性的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。研究方案包括下圖所示七個步驟：①從三維和二維培養(yǎng)條件下未分化的干細胞和經(jīng)誘導(dǎo)分化的細胞制備蛋白質(zhì)樣品。這樣一共有四個樣品，分別標(biāo)記為三維未分化，三維分化，二維分化，二維未分化。②從每個樣品中分出等量的蛋白樣品進行胰蛋白酶（Trypsin)酶解，產(chǎn)生多肽混合物。③利用商業(yè)化的iTraq試劑，分別標(biāo)記以上四個不同的樣品。iTraq試劑有四個不同的標(biāo)記物。這四個標(biāo)記物在MS/MS圖譜上所顯示的峰其質(zhì)量/電荷比分別為113，114，115，116。如果某一個多肽在四個樣品中都存在，那么這個多肽就會被這四個標(biāo)記物分別標(biāo)記上。將這四個標(biāo)記過的樣品等量混合并進行LC-MS/MS分析，根據(jù)這四個標(biāo)記物在MS/MS圖譜上特異峰的信號強度，我們就可以對這個多肽在四個樣品中的相對含量進行定量。④對于總蛋白質(zhì)組的分析，我們從每個標(biāo)記的樣品中取等量的樣品加以混合。讓后利用多維的液相層析和質(zhì)譜聯(lián)用的技術(shù)（LC-MS/MS),同時對四個樣品中的蛋白進行鑒定和定量。⑤對于磷酸蛋白質(zhì)組的分析，我們從第三步標(biāo)記好的四個樣品中分別拿出等量樣品并合并，然后先后用固定化金屬離子親和層析法(IMAC)和二氧化鈦(TiO2)親和層析法富集不同的磷酸肽亞群(Bodenmilleretal.,2007)，并將收集到的磷酸肽合并到一起。同樣，對與乙?；头核鼗?，我們將分別利用已發(fā)表的免疫沉降法和親和層析法對被修飾的多肽進行富集。⑥利用多維LC-MS/MS進行蛋白質(zhì)修飾位點的鑒定和定量。我們將利用最先進的帶有ETD功能的LTQ-Orbitrap-Velos質(zhì)譜儀來分析這些樣品。這個質(zhì)譜儀是目前世界上進行大規(guī)模蛋白質(zhì)組研究的最好的儀器，具有高靈敏度，高分辨率，以及高精確度的特點。同時，附加的ETD（ElectronTransferDissociation）功能是專門用來分析蛋白質(zhì)修飾的。我們可以利用ETD方法和傳統(tǒng)的CID(CollisionInducedDissociation)方法來進行蛋白質(zhì)修飾位點的分析，以求獲得更高的位點鑒定覆蓋率。⑦利用生物信息學(xué)和計算生物學(xué)的方法對產(chǎn)生的蛋白質(zhì)組和蛋白質(zhì)修飾數(shù)據(jù)進行信號通路和網(wǎng)絡(luò)的分析，找出與干細胞自我更新或定向分化相關(guān)的調(diào)控通路或網(wǎng)絡(luò)。同時，我們將會找出一些與干細胞更新與定向分化特異相關(guān)的蛋白和修飾位點，進行進一步的功能研究。（2）利用microRNA芯片進行高通量篩選。確定microRNA在三維干細胞自我更新和定向分化過程中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，具體途徑如下：①非編碼RNA序列的篩選和生物信息學(xué)分析獲得二維和三維培養(yǎng)狀態(tài)下的干細胞，提取細胞RNA，利用microRNA芯片進行高通量篩選。通過生物信息學(xué)分析，對非編碼RNA進行功能分類、確認可能的新類別非編碼RNA；分析非編碼RNA的基因組定位、尋找可能的非編碼RNA特異的上游調(diào)控元件。②報告基因系統(tǒng)確定非編碼RNA基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件和轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子通過生物信息學(xué)方法分析非編碼RNA基因的上游調(diào)控元件，進一步分析其中可能的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子結(jié)合位點，針對不同的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子結(jié)合位點構(gòu)建缺失或點突變的報告基因（Luciferase）重組質(zhì)粒，確定影響非編碼RNA基因表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子及結(jié)合序列。③非編碼RNA對干細胞自我更新、分化的影響分別構(gòu)建正義和反義非編碼RNA重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細胞或肌肉干細胞，觀察超表達或Knockdown特定非編碼RNA對其生物學(xué)功能的影響。進一步采用Northern和Western方法檢測細胞增殖分化相關(guān)的標(biāo)志基因（proliferationordifferentiationmarker）的表達情況，分析非編碼RNA的功能。7）模式動物體內(nèi)干細胞維持分化與功能研究將從基因、蛋白質(zhì)、細胞與組織以及活體動物水平研究體內(nèi)干細胞自我更新與分化。具體途徑如下：（1）基因水平的研究：全基因組RNAi篩選和化學(xué)誘變，基因定位、克隆找到細胞分化調(diào)控因子。（2）蛋白質(zhì)水平的研究：利用雙向電泳、質(zhì)譜、顯微注射、酵母雙雜交和免疫共沉淀等技術(shù)研究蛋白質(zhì)功能及蛋白質(zhì)間的相互作用。（3）細胞與組織水平的研究：利用建立的各種細胞和組織培養(yǎng)模型和流式細胞分離、激光共聚焦成像、顯微注射、RNA干擾和過表達等技術(shù)，深入研究基因/蛋白質(zhì)的功能及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。（4）活體動物研究：利用轉(zhuǎn)基因疾病動物模型、干細胞移植等技術(shù)研究體內(nèi)神經(jīng)干細胞的自我更新與定向分化。8）干細胞的納米示蹤與成像技術(shù)研究將以高量子效率、高生物相容性量子點的制備為基礎(chǔ)，通過對量子點的特異性修飾，實現(xiàn)對干細胞的特異性標(biāo)記，利用熒光成像技術(shù)和核磁共振成像手段，對三維培養(yǎng)的干細胞和活體干細胞進行三維示蹤成像。具體研究途徑如下：（1）納米粒子的制備研究：a.高量子效率、高生物相容性量子點：對目前實驗室已有的量子點合成技術(shù)進行改進，使量子點在光穩(wěn)定性、化學(xué)穩(wěn)定性、低毒性、熒光量子產(chǎn)率、熒光半峰全寬等各個參數(shù)上滿足后續(xù)應(yīng)用的需要。選取恰當(dāng)?shù)呐潴w，對量子點表面進行功能化修飾，提高其生物相容性。b.采用高溫分解鐵前驅(qū)體的方法合成磁性納米粒子，通過優(yōu)化前驅(qū)體濃度、回流時間、加熱速率等反應(yīng)條件，借助晶種生長法來控制粒徑的大小。選用合適的鐵前驅(qū)體和過渡金屬前驅(qū)體進行熱解，控制磁性納米粒子的化學(xué)組成。通過表面配體置換對納米粒子表面進行改性和修飾。（2）量子點的特異性修飾：結(jié)合其它子課題的研究需求，利用特異性的識別分子對量子點、磁性顆粒通過共價或非共價的方式進行修飾，實現(xiàn)對細胞及其亞結(jié)構(gòu)組分的特異性標(biāo)記。（3）活體干細胞的標(biāo)記：將近紅外量子點或磁性納米粒子標(biāo)記的干細胞在體外進行標(biāo)記，然后導(dǎo)入小鼠體內(nèi)，利用熒光信號或核磁信號對干細胞在小鼠體內(nèi)的行為進行示蹤。（4）納米示蹤與成像：a.通過量子點和生物分子標(biāo)記對象的雙色熒光共定位成像，可以在單分子水平研究近紅外量子點對干細胞結(jié)構(gòu)的特異性標(biāo)記技術(shù)。b.采用共聚焦掃描技術(shù)實現(xiàn)干細胞三維成像與示蹤。根據(jù)紅外量子點的激發(fā)與發(fā)射波長的特點，選用合適波長的激光光源構(gòu)建共聚焦熒光顯微系統(tǒng)，可以有效降低本底信號強度，實現(xiàn)較高成像精度的三維紅外熒光成像，滿足對不同生長環(huán)境下干細胞的亞細胞結(jié)構(gòu)對比研究。c.近紅外光具有較大的組織穿透深度，利用近紅外量子點構(gòu)建活體熒光成像系統(tǒng)，可以在小動物尺度對干細胞的維持和分化進行示蹤成像。d.直接將磁性納米粒子標(biāo)記的神經(jīng)干細胞注射到包裹小鼠紋狀體的腦室側(cè)壁神經(jīng)干細胞的niche區(qū)，將小鼠于不同時間點置入11.7T磁共振微成像儀中，分別采用自旋回波和梯度回波兩種對鐵敏感性不同的磁共振影像方法，設(shè)計優(yōu)化脈沖系列，對小鼠腦部進行掃描，針對移植部位進行圖像采集，研究外源性神經(jīng)干細胞在體內(nèi)的增殖、遷移、分化等。以磁共振影像技術(shù)作為核心技術(shù)，對比研究三維培養(yǎng)與二維培養(yǎng)干細胞在體內(nèi)維持分化與功能的差異，支撐課題1、2、3的相關(guān)研究。3)創(chuàng)新點與特色：（1）三維培養(yǎng)體系中細胞的行為學(xué)特性更近似于體內(nèi)細胞的環(huán)境。本項目模擬體內(nèi)干細胞自我更新和定向分化的三維環(huán)境，建立干細胞的三維培養(yǎng)分化體系，在此基礎(chǔ)上對干細胞自我更新和定向分化的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進行研究。這是本項目重要創(chuàng)新點。（2）活體細胞納米示蹤與成像技術(shù)作為生物醫(yī)學(xué)研究的基本手段在干細胞的自我更新與分化的體內(nèi)外研究中發(fā)揮著日益重要的作用。納米標(biāo)記與成像技術(shù)作為非損傷性的新型標(biāo)記技術(shù)將獲得傳統(tǒng)二維細胞研究技術(shù)難以攝取的信息。（3）系統(tǒng)定量地分析在二維和三維培養(yǎng)條件下干細胞自我更新和定向分化過程中蛋白質(zhì)組和磷酸蛋白質(zhì)組的差異，找出更接近體內(nèi)環(huán)境中干細胞自我更新與分化的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。（4）本項目既有體外三維培養(yǎng)干細胞自我更新和分化的研究，又有模式動物體內(nèi)干細胞自我更新和分化的研究，可以驗證三維培養(yǎng)體系與體內(nèi)環(huán)境的相似性。4）可行性分析：（1）項目申請人主持了2006-2010年國家重大科學(xué)研究計劃中“調(diào)控干細胞自我更新能力的分子網(wǎng)絡(luò)研究”的項目，項目組對干細胞的自我更新和定向分化及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進行了較為深入的研究，取得了一些重要的研究結(jié)果，豐富和發(fā)展了以O(shè)ct4和Nanog等轉(zhuǎn)錄因子為核心的干細胞自我更新的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。這些工作為進一步在三維培養(yǎng)條件下研究干細胞自我更新的調(diào)控機制奠定了基礎(chǔ)。（2）項目組成員在三維培養(yǎng)體系建立、干細胞定向分化研究、定量蛋白質(zhì)組學(xué)、細胞遷移與粘附、納米示蹤與成像技術(shù)等研究以及模式動物實驗體系建立等方面已有較好的積累（詳見研究基礎(chǔ)）。（3）參加本項目的課題組來自中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所、中國科學(xué)院動物研究所、中國科學(xué)院生物物理所、中國科學(xué)院蘇州納米技術(shù)與納米仿生研究所、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所、大連醫(yī)科大學(xué)，課題組依托單位和重點實驗室都具備先進的實驗條件，為該項目的實施提供了充分必要的條件。（4）本項目所設(shè)置的四個課題組的研究內(nèi)容相互聯(lián)系，研究成員之間已經(jīng)建立了緊密的協(xié)作關(guān)系。（5）項目申請人戴建武研究員是中國科學(xué)院“百人計劃”入選者、國家杰出青年基金獲得者、國家重大科學(xué)研究計劃“調(diào)控干細胞自我更新能力的分子網(wǎng)絡(luò)研究”（2006-2010）項目首席科學(xué)家，為本項目的運行積累了組織和協(xié)調(diào)經(jīng)驗。項目課題負責(zé)人均為相關(guān)研究領(lǐng)域的優(yōu)秀學(xué)科帶頭人。學(xué)術(shù)骨干隊伍由精力充沛的優(yōu)秀青年科研人員組成。5）課題設(shè)置本項目利用細胞示蹤和成像技術(shù)，研究三維培養(yǎng)干細胞和體內(nèi)干細胞自我更新與定向分化的調(diào)控機理。本項目設(shè)置四個課題：課題1干細胞三維培養(yǎng)與自我更新調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究課題2三維培養(yǎng)干細胞的定向分化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究課題3干細胞體內(nèi)維持分化與功能研究課題4干細胞的納米示蹤與成像技術(shù)四個課題相互獨立又相互聯(lián)系，其中課題4建立的納米示蹤與成像技術(shù)在課題1、課題2、課題3的研究過程中均會得到應(yīng)用。課題1和課題2的研究為體外研究，其分別研究三維培養(yǎng)干細胞的自我更新和定向分化調(diào)控。自我更新和定向分化的調(diào)控機制既相互區(qū)別又相互聯(lián)系。課題3為模式動物體內(nèi)干細胞自我更新與定向分化研究，其體內(nèi)的研究結(jié)果可與課題1、課題2體外干細胞自我更新和定向分化的研究結(jié)果相互驗證。課題1：干細胞三維培養(yǎng)與自我更新調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究研究目標(biāo)：制備出適合干細胞生長分化的三維膠原支架材料；建立多潛能干細胞和成體干細胞的三維培養(yǎng)體系，闡釋三維培養(yǎng)條件下胚胎干細胞的發(fā)育潛能與自我更新的分子機制；結(jié)合蛋白質(zhì)組和磷酸蛋白質(zhì)組以及microRNA分析結(jié)果探討三維培養(yǎng)條件下干細胞自我更新表觀調(diào)控機制，闡明在干細胞自我更新起關(guān)鍵調(diào)控作用的表觀遺傳網(wǎng)絡(luò)。研究內(nèi)容：1）適合不同類型干細胞培養(yǎng)的三維支架的構(gòu)建分離純化膠原蛋白，制備不同類型的三維支架材料，使其具有良好的生物相容性，適宜的硬度和孔隙結(jié)構(gòu)，建立適合不同類型干細胞培養(yǎng)的三維膠原支架材料。2）三維膠原支架材料的修飾、優(yōu)化在膠原支架材料的基礎(chǔ)上，將微環(huán)境中調(diào)控干細胞自我更新和分化的其它細胞外基質(zhì)成份、信號分子或支持細胞等因素整合到膠原支架材料上，對三維膠原支架材料進行修飾優(yōu)化，以最大限度的模擬體內(nèi)干細胞自我更新和分化的環(huán)境。3）干細胞三維培養(yǎng)體系的建立干細胞選擇多潛能干細胞ES細胞和iPS細胞，將干細胞接種于三維支架材料上，檢測并比較二維和三維培養(yǎng)的干細胞細胞學(xué)特性，包括細胞形態(tài)變化、標(biāo)志蛋白表達能等。檢測并比較二維和三維培養(yǎng)的干細胞在生長和分化過程中的亞細胞結(jié)構(gòu)水平的變化。4）三維培養(yǎng)胚胎干細胞發(fā)育潛能研究在建立胚胎干細胞三維培養(yǎng)體系的基礎(chǔ)上，探索三維培養(yǎng)胚胎干細胞的發(fā)育潛能。利用嵌合以及四倍體補償?shù)确椒ㄨb定三維培養(yǎng)胚胎干細胞體內(nèi)發(fā)育潛能及細胞多能性，并與二維培養(yǎng)體系下干細胞的發(fā)育潛能相比較。5）三維培養(yǎng)干細胞的自我更新研究建立ES細胞和iPS細胞三維培養(yǎng)體系基礎(chǔ)上，研究調(diào)控細胞多能性的這些因子之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，解析其如何相互協(xié)同共同控制多能性細胞的不分化狀態(tài)。6）三維培養(yǎng)干細胞自我更新的表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)用基因組學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)方法檢測并比較二維和三維培養(yǎng)的干細胞在在自我更新過程中的表觀遺傳學(xué)變化，包括蛋白質(zhì)組和磷酸蛋白質(zhì)組、非編碼RNA表達譜等。承擔(dān)單位：中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所中國科學(xué)院動物研究所大連醫(yī)科大學(xué)課題負責(zé)人：戴建武學(xué)術(shù)骨干：汪迎春、劉蕾、丁文勇、林琳、田余祥經(jīng)費比例：34%課題2：三維培養(yǎng)干細胞的定向分化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究研究目標(biāo)：綜合運用細胞生物學(xué)、生物化學(xué)、材料科學(xué)及系統(tǒng)生物學(xué)研究方法，檢測三維培養(yǎng)中干細胞自我更新和分化狀態(tài)的各項指標(biāo)，以建立一套完善有效的干細胞三維培養(yǎng)的評價體系。結(jié)合蛋白質(zhì)組和磷酸蛋白質(zhì)組分析結(jié)果探討三維培養(yǎng)條件下干細胞定向分化的分子和細胞機制，闡明在干細胞定向分化中起關(guān)鍵調(diào)控作用的信號通路和信號網(wǎng)絡(luò)及表觀遺傳網(wǎng)絡(luò)。研究內(nèi)容：1）選擇成體干細胞包括神經(jīng)、心肌和成肌干細胞，將干細胞接種于三維支架材料上，檢測比較二維和三維培養(yǎng)的神經(jīng)、心肌和成肌干細胞分化過程中的細胞學(xué)特性，包括細胞形態(tài)變化、標(biāo)志蛋白表達及細胞功能等。檢測并比較二維和三維培養(yǎng)的神經(jīng)、心肌和成肌干細胞在分化過程中亞細胞結(jié)構(gòu)水平的變化，包括用免疫染色及活細胞成像技術(shù)等觀測細胞粘附特性及細胞骨架結(jié)構(gòu)、細胞遷移和運動特性等。2）運用生化方法檢測并比較二維和三維培養(yǎng)的干細胞分化過程中受外界信號因子誘導(dǎo)產(chǎn)生的細胞內(nèi)信號通路的動態(tài)變化，分析它們各自信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑整合的特性。3）用基因組學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)方法檢測并比較二維和三維培養(yǎng)的干細胞在生長和分化過程中的表觀遺傳學(xué)變化，包括蛋白質(zhì)組和磷酸蛋白質(zhì)組、microRNA表達譜等。4）利用已建立的人胚胎干細胞向心肌分化的體外培養(yǎng)模型,在三維培養(yǎng)條件下利用基因芯片或深度測序的方法取得基因表達譜，進行生物信息學(xué)分析，構(gòu)建三維條件下心肌分化的轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)。承擔(dān)單位：中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所中國科學(xué)院生物物理研究所課題負責(zé)人：劉佳佳學(xué)術(shù)骨干：馬躍、張宏冰、張蕾、楊艷蕊經(jīng)費比例：31%課題3：干細胞體內(nèi)維持分化與功能研究研究目標(biāo)：通過模式動物體內(nèi)干細胞自我更新與分化研究，發(fā)現(xiàn)并鑒定與神經(jīng)干細胞的維持、分化相關(guān)的一些新基因，闡明其作用機制。明確三維培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞在體內(nèi)的自我更新能力與分化潛能，并對其導(dǎo)入體內(nèi)后的有效性、安全性進行評估。分析三維培養(yǎng)干細胞與體內(nèi)干細胞維持與分化機制的異同，獲得干細胞調(diào)控的真實信息。研究內(nèi)容：1）線蟲內(nèi)源神經(jīng)干細胞維持與分化的關(guān)鍵因子首先建立線蟲神經(jīng)干細胞體內(nèi)觀察體系，利用線蟲容易進行大規(guī)模篩選的特性，進行全基因組RNAi篩選和化學(xué)誘變。然后通過內(nèi)源啟動子融合熒光實驗，探明相應(yīng)調(diào)控因子的組織表達譜。運用細胞自主性拯救實驗探明該因子調(diào)控內(nèi)源神經(jīng)干細胞維持與分化的分子機制。2）同源干細胞分化調(diào)控因子在哺乳動物干細胞分化中的作用研究哺乳動物中相對應(yīng)的同源干細胞分化調(diào)控因子，利用RNAi和基因敲除技術(shù)研究這些調(diào)控因子如何影響哺乳動物干細胞的維持與分化。3）三維培養(yǎng)神經(jīng)干細胞在小鼠紋狀體區(qū)的維持、分化與神經(jīng)回路的重建將使用近紅外量子點和磁性納米顆粒對三維培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞在體外進行標(biāo)記。經(jīng)納米材料示蹤標(biāo)記的神經(jīng)干細胞將通過立體定位的方法直接注入到包裹小鼠紋狀體的腦室側(cè)壁，即神經(jīng)干細胞的niche區(qū)。在細胞導(dǎo)入后不同時間分別使用增殖細胞、神經(jīng)前體細胞、分化細胞、成熟神經(jīng)元、神經(jīng)突觸等特異的分子標(biāo)記，系統(tǒng)地檢測外源神經(jīng)干細胞在體內(nèi)的維持、分化行為以及功能回路的建立。同時使用核磁共振活體成像技術(shù)，對干細胞移植動物后進行三維、非破壞性納米技術(shù)示蹤以分析外源神經(jīng)干細胞在體內(nèi)的增殖、定位、遷移、分化等。4)外源神經(jīng)干細胞參與神經(jīng)功能的恢復(fù)使用神經(jīng)退行性疾病模型小鼠—舞蹈病模型小鼠作為外源神經(jīng)干細胞的受體。干細胞移植后通過檢測舞蹈病模型小鼠的運動協(xié)調(diào)能力可以直接從功能上評估外源干細胞參與神經(jīng)組織修復(fù)的能力。承擔(dān)單位：中國科學(xué)院動物研究所中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所課題負責(zé)人：唐鐵山學(xué)術(shù)骨干：丁梅、關(guān)麗英、

李夏

、陳倩經(jīng)費比例：18%課題4：干細胞的納米示蹤與成像技術(shù)研究目標(biāo)：建立干細胞納米示蹤與成像新技術(shù)，包括制備出高生物相容性、高量子產(chǎn)率的量子點，建立量子點標(biāo)記活細胞及亞細胞組分的方法，實現(xiàn)對三維培養(yǎng)干細胞以及活體干細胞的特異性標(biāo)記，建立三維培養(yǎng)干細胞和活體干細胞的三維、非損傷性的納米示蹤與成像技術(shù)。研究內(nèi)容：1）高量子效率、高生物相容性量子點的制備（1）高量子效率、高生物相容性量子點的制備：在我們已有工作的基礎(chǔ)上，進一步改進量子點合成技術(shù)，開發(fā)高量子效率的、熒光范圍從可見光區(qū)到近紅外光區(qū)的量子點，并提高量子點的生物相容性，滿足三維培養(yǎng)的干細胞和活體干細胞標(biāo)記和成像。（2）高生物相容性和高弛豫率磁性納米顆粒的制備：通過控制納米粒的粒徑、化學(xué)成分以及表面性質(zhì)使其具有良好的弛豫性能和生物相容性。2）三維培養(yǎng)干細胞的特異性標(biāo)記：與課題1和2進行合作，針對三維培養(yǎng)的干細胞及其亞細胞結(jié)構(gòu)，分別用相應(yīng)的識別分子（如抗體、適配體、信號肽等）對量子點進行特異性修飾，對細胞骨架組分、細胞因子（如Wnt、FGF、BMP、Notch和TGF-β等）及相關(guān)受體、細胞內(nèi)信號通路中蛋白質(zhì)磷酸化相關(guān)蛋白、非編碼RNA進行特異性標(biāo)記。3）活體干細胞的特異性標(biāo)記：用近紅外量子點或磁性納米粒子對三維培養(yǎng)的干細胞在體外進行標(biāo)記，采用立體定位注射的方法導(dǎo)入小鼠體內(nèi)，利用近紅外量子點的熒光信號或磁性納米粒子的核磁信號對活體內(nèi)的干細胞進行定位與跟蹤，為研究其在體內(nèi)生理環(huán)境下的增殖與分化機制提供證據(jù)。4）三維培養(yǎng)干細胞的近紅外熒光成像技術(shù)：利用單分子/單量子點熒光共定位技術(shù)，研究修飾后的近紅外量子點對細胞骨架組分、細胞因子等的特異性標(biāo)記性能。針對紅外量子點的激發(fā)與發(fā)射光譜特性，研究適合近紅外成像的激光共聚焦顯微技術(shù)；研究近紅外量子點在三維培養(yǎng)干細胞中的示蹤技術(shù)，發(fā)展基于熒光成像的二維、三維培養(yǎng)干細胞分化過程定量分析手段。5）活體干細胞的三維、非損傷性示蹤技術(shù)：研究近紅外光在活體干細胞中的散射與吸收性質(zhì)，開發(fā)利用近紅外量子點標(biāo)記的活體動物熒光成像系統(tǒng)；并且利用活體動物熒光成像系統(tǒng)，對移植體內(nèi)的近紅外量子點標(biāo)記的干細胞進行三維示蹤；結(jié)合納米磁性粒子造影技術(shù)，通過核磁共振成像對磁性納米粒子標(biāo)記的干細胞在活體內(nèi)的維持和分化進行成像示蹤。承擔(dān)單位：中國科學(xué)院蘇州納米技術(shù)與納米仿生研究所課題負責(zé)人：王強斌學(xué)術(shù)骨干：鄧宗武、吳東岷、李曉然經(jīng)費比例：17%

四、年度計劃年度研究內(nèi)容預(yù)期目標(biāo)第一年構(gòu)建適合不同類型干細胞培養(yǎng)的三維支架，建立干細胞三維培養(yǎng)體系。三維培養(yǎng)體系下干細胞表型研究，并與二維培養(yǎng)體系相比較。建立三維培養(yǎng)條件下干細胞定向分化的研究體系，檢測比較二維和三維培養(yǎng)的神經(jīng)、心肌和成肌干細胞分化過程中的細胞學(xué)特性，包括細胞形態(tài)變化及細胞功能等。用二維培養(yǎng)的細胞作為實驗材料，建立穩(wěn)定的蛋白質(zhì)/磷酸化蛋白質(zhì)分離、純化、質(zhì)譜學(xué)鑒定、以及生物信息學(xué)分析的實驗和數(shù)據(jù)分析體系。模式動物干細胞體內(nèi)觀察體系和小鼠腦內(nèi)立體定位細胞導(dǎo)入的方法研究。制備熒光光譜從可見光區(qū)到近紅外區(qū)的量子點和超順磁納米顆粒，對其表面進行功能化修飾，對量子點熒光性能研究。選擇適宜干細胞培養(yǎng)的三維培養(yǎng)材料，建立干細胞三維培養(yǎng)體系。獲得三維培養(yǎng)干細胞形態(tài)、增殖情況、凋亡情況等細胞表型結(jié)果。初步建立三維培養(yǎng)條件下干細胞定向分化體系。建立成熟的能鑒定超過3000個干細胞總蛋白和1000個磷酸化位點的實驗體系。獲得多個穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因線蟲株系，并完成系統(tǒng)跟蹤神經(jīng)干細胞及其分化子細胞在體內(nèi)的生成、遷移以及分化過程；得到小鼠腦內(nèi)細胞導(dǎo)入的立體定位參數(shù)。制備得到高質(zhì)量的量子點和磁性粒子，并對其表面進行生物相容性修飾；完成單分子/單量子點熒光成像系統(tǒng)搭建。發(fā)表論文3-5篇第二年1．三維膠原支架材料的修飾、優(yōu)化2．三維培養(yǎng)干細胞的自我更新相關(guān)基因的表達研究。3．三維培養(yǎng)干細胞定向分化的研究4．制備二維和三維培養(yǎng)條件下干細胞的蛋白質(zhì)樣品，并應(yīng)用IMAC技術(shù)和免疫親和層析技術(shù)純化磷酸化蛋白，乙酰化蛋白、以及泛素化蛋白，并進行初步的質(zhì)譜學(xué)分析。5．獲得二維和三維不同培養(yǎng)狀態(tài)下的干細胞，提取細胞RNA，利用microRNA芯片進行高通量篩選。對篩選到的序列進行生物信息學(xué)分析。6．檢測以Wnt，Notch為代表的信號分子對神經(jīng)干細胞體內(nèi)維持及定向分化的影響。開展全基因組RNAi篩選，確定與體內(nèi)干細胞定向分化相關(guān)的潛在靶基因。7．優(yōu)化近紅外量子點和磁性納米顆粒對三維培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞在體外進行標(biāo)記的條件，并將經(jīng)納米材料示蹤標(biāo)記的神經(jīng)干細胞將通過立體定位的方法直接導(dǎo)入到包裹小鼠紋狀體的腦室側(cè)壁，即神經(jīng)干細胞的niche區(qū)。8．利用特異性的識別分子對量子點進行修飾，制備特異性修飾量子點，通過單分子/單量子點熒光共定位技術(shù)研究量子點對細胞及其亞結(jié)構(gòu)組分的特異性標(biāo)記，并進行體外干細胞誘導(dǎo)分化及標(biāo)記；優(yōu)化磁共振影像技術(shù)中磁共振影像脈沖序列、空間分辨率和以細胞數(shù)量為基準的信號靈敏度等系統(tǒng)指標(biāo)。1．初步獲得二維、三維培養(yǎng)干細胞自我更新和定向分化相關(guān)基因表達差異。2．制備能夠進行5次重復(fù)實驗的二維和三維干細胞總蛋白樣品。其中每個總蛋白樣品不少于1毫克，每個蛋白質(zhì)修飾的樣品不少于500微克。3．確定二維和三維培養(yǎng)的干細胞在生長和分化過程中microRNA的時空表達譜。系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)和鑒定一批二維和三維培養(yǎng)條件下未分化干細胞和經(jīng)誘導(dǎo)分化細胞中有表達差異的microRNA。4．探明以Wnt，Notch為代表的信號分子在神經(jīng)干細胞體內(nèi)維持及定向分化中的作用，確定幾個與體內(nèi)神經(jīng)干細胞定向分化相關(guān)的靶基因。5．完成三位培養(yǎng)神經(jīng)干細胞體外納米材料標(biāo)記的適宜條件和干細胞腦內(nèi)導(dǎo)入。6．實現(xiàn)量子點對細胞及其亞結(jié)構(gòu)的特異性標(biāo)記，實現(xiàn)單分子水平雙色熒光共定位測量，定位精度<20nm；完成對磁共振影像技術(shù)的各種優(yōu)化指標(biāo)。發(fā)表論文5-8篇第三年1．三維培養(yǎng)干細胞發(fā)育潛能鑒定。2．三維培養(yǎng)干細胞自我更新的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究。3．三維培養(yǎng)干細胞定向分化的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究。4．大規(guī)模的定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析。系統(tǒng)地鑒定并比較二維和三維培養(yǎng)條件下細胞內(nèi)蛋白質(zhì)表達和翻譯后修飾的差異。5．microRNA基因結(jié)構(gòu)和表達調(diào)控研究：microRNA基因結(jié)構(gòu)分析，包括啟動子、轉(zhuǎn)錄起始位點、可能的內(nèi)含子等；重點分析獨立轉(zhuǎn)錄的microRNA基因的上游調(diào)控元件；用報告基因系統(tǒng)研究microRNA基因的啟動子和轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。6．對RNAi篩選獲得的靶基因進行初步表達圖譜分析，解析其在神經(jīng)干細胞定向分化中可能的細胞自主或非自主性行為，并獲得相應(yīng)突變體，進一步分析該靶基因功能，開展以EMS為主的化學(xué)誘變，分離神經(jīng)干細胞定向分化有缺陷的突變株系。7．小鼠體內(nèi)納米示蹤標(biāo)記，系統(tǒng)地檢測外源神經(jīng)干細胞在體內(nèi)的維持、分化行為。同時使用核磁共振活體成像技術(shù)，分析外源神經(jīng)干細胞在體內(nèi)的增殖、定位、遷移、分化等。8．將近紅外量子點或磁性納米粒子標(biāo)記的干細胞在體外進行標(biāo)記，研究適合近紅外成像的激光共聚焦顯微技術(shù)，然后利用熒光信號進行二維培養(yǎng)干細胞在老鼠體內(nèi)行為示蹤，實現(xiàn)活體干細胞的標(biāo)記；利用磁共振影像示蹤技術(shù)系統(tǒng)研究二維培養(yǎng)干細胞移植小鼠腦部后的維持分化過程及其功能。1．獲得二維、三維培養(yǎng)胚胎干細胞發(fā)育潛能差異結(jié)果。2．確定二維、三維培養(yǎng)干細胞調(diào)控網(wǎng)絡(luò)差異。3．明確mTOR信號通路在干細胞定向分化中的作用4．確定新發(fā)現(xiàn)的microRNA的基因結(jié)構(gòu)；確定一些microRNA的啟動子元件和轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。5．揭示某些細胞因子、小分子化合物在人類心肌分化上的作用機制。6．通過5次重復(fù)實驗，定量鑒定出超過3000/1000個二維和三維培養(yǎng)干細胞的總蛋白/磷酸化位點，以及不少于50個乙酰化和泛素化位點。7．進一步確認與神經(jīng)干細胞維持分化有關(guān)的幾個靶基因的功能，并分離神經(jīng)干細胞定向分化缺陷株系。8．完成約60-80只小鼠的腦內(nèi)神經(jīng)干細胞導(dǎo)入，系統(tǒng)地分析外源神經(jīng)干細胞在小鼠腦內(nèi)的定位、遷移、維持與分化。9．實現(xiàn)二維培養(yǎng)干細胞的近紅外量子點標(biāo)記三維熒光成像技術(shù)和磁性納米粒子的活體磁共振成像。發(fā)表論文5-8篇第四年1．三維培養(yǎng)干細胞自我更新和定向分化的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進一步研究。生物信息學(xué)分析，找出三維培養(yǎng)條件下干細胞自我更新和定向分化的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并用生物化學(xué)和分子生物學(xué)的手段對蛋白質(zhì)組學(xué)和生物信息學(xué)的研究結(jié)果進行獨立驗證。microRNA在干細胞自我更新和定向分化中的功能研究和靶基因的鑒定。利用多種蛋白標(biāo)記，深入分析化學(xué)誘變獲得的突變體其表型產(chǎn)生的根源，開展基因克隆，表達譜建立等工作，結(jié)合遺傳互作，蛋白質(zhì)互作，找到哺乳動物中相對的同源蛋白，通過RNAi等基因敲除手段研究其在三維培養(yǎng)干細胞中調(diào)控干細胞維持和分化的作用。將三位培養(yǎng)神經(jīng)干細胞將通過立體定位的方法移植到舞蹈病模型小鼠腦內(nèi)，功能上評估外源干細胞參與神經(jīng)組織修復(fù)的能力。利用活體熒光成像手段或者核磁共振成像技術(shù)對三維培養(yǎng)的干細胞和活體干細胞進行示蹤。建立基于熒光成像的三維培養(yǎng)干細胞分化過程的定量分析手段；利用磁共振影像示蹤技術(shù)系統(tǒng)研究三維培養(yǎng)干細胞移植體內(nèi)后的維持分化過程及其功能，在單納米粒子水平研究干細胞結(jié)構(gòu)的特異性標(biāo)記技術(shù)，實現(xiàn)納米示蹤與成像。爭取確定15-20個重要的磷酸化位點，找出調(diào)控三維培養(yǎng)干細胞自我更新信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵分子。2.闡明在干細胞定向分化中mTOR信號傳導(dǎo)通路是否起關(guān)鍵調(diào)控作用。3.篩選多個影響干增殖分化的microRNA；鑒定多個microRNA調(diào)控的靶基因并進行相關(guān)功能研究。4.揭示某些細胞因子、小分子化合物在人類心肌分化上的作用機制。5．通過系統(tǒng)地研究與神經(jīng)干細胞維持分化有關(guān)的幾個靶基因，確定靶基因間的相互調(diào)控關(guān)系以及在哺乳動物三位培養(yǎng)干細胞中的作用6．完成約60只舞蹈病模型小鼠的腦內(nèi)神經(jīng)干細胞導(dǎo)入，系統(tǒng)地從功能上分析外源神經(jīng)干細胞參與神經(jīng)退行性疾病模型小鼠腦內(nèi)神經(jīng)組織的修復(fù)。7．實現(xiàn)三維培養(yǎng)干細胞的近紅外量子點標(biāo)記三維熒光成像技術(shù)和磁性納米粒子的活體磁共振成像。發(fā)表論文5-10篇。第五年1．確定調(diào)控三維培養(yǎng)干細胞自我更新和定向分化信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵分子的基礎(chǔ)上，對其上下游的調(diào)控因子及調(diào)控機制進行深入研究。2．進一步確定神經(jīng)干細胞體內(nèi)維持、定向分化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。進一步從病理學(xué)上分析外源神經(jīng)干細胞移植后的維持與分化。3．預(yù)備結(jié)題。1．建立干細胞三維培養(yǎng)體系和干細胞納米示蹤成像方法。2．豐富和完善干細胞自我更新的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，建立調(diào)控三維培養(yǎng)干細胞自我更新信號和定向分化的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。2．確定神經(jīng)干細胞體內(nèi)維持、定向分化相關(guān)的幾個靶基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；完成外源神經(jīng)干細胞參與神經(jīng)退行性疾病損傷組織修復(fù)的功能評估。發(fā)表論文5-10篇。

一、研究內(nèi)容本項目的主要研究內(nèi)容如下：（一）干細胞三維培養(yǎng)體系的建立1）干細胞培養(yǎng)三維支架材料的制備分離純化膠原蛋白，制備三維支架材料，使其具有良好的生物相容性、適宜的硬度和孔隙結(jié)構(gòu)，制備適合干細胞培養(yǎng)的三維膠原支架材料。細胞外基質(zhì)成份膠原蛋白本身為機體內(nèi)細胞所處三維環(huán)境中的固有成份，其具有良好的細胞相容性，可最大限度地在體外模擬體內(nèi)干細胞生活的環(huán)境。2）三維膠原支架材料的修飾、優(yōu)化在膠原支架材料的基礎(chǔ)上，考慮多方因子和因素，將微環(huán)境中調(diào)控干細胞自我更新和定向分化的其它細胞外基質(zhì)成份、信號分子或支持細胞等因素整合到膠原支架材料上，對三維膠原支架材料進行修飾優(yōu)化，以最大限度的模擬體內(nèi)干細胞自我更新和定向分化的環(huán)境。3）干細胞三維培養(yǎng)體系的建立將干細胞接種于三維支架材料上，檢測并比較二維和三維培養(yǎng)的干細胞的自我更新、代謝、形態(tài)學(xué)及亞細胞結(jié)構(gòu)的變化，包括用免疫染色及活細胞成像技術(shù)等觀察細胞粘附特性及細胞骨架結(jié)構(gòu)、細胞遷移和運動特性等。干細胞選擇多潛能干細胞（ES細胞和iPS細胞）和成體干細胞（神經(jīng)干細胞、心肌干細胞、骨骼肌干細胞）。（二）三維培養(yǎng)干細胞的發(fā)育潛能與自我更新調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究1）ES細胞是最為人們熟知的多能性細胞，iPS細胞具有ES細胞相似的多能性。我們2）在建立在建立胚胎干細胞三維培養(yǎng)體系的基礎(chǔ)上，探索三維培養(yǎng)胚胎干細胞的發(fā)育潛能，利用嵌合以及四倍體補償?shù)确椒ㄨb定三維培養(yǎng)胚胎干細胞體內(nèi)發(fā)育潛能及細胞多能性，并與二維培養(yǎng)體系下干細胞的發(fā)育潛能相比較。2）細胞多能性的維持受到內(nèi)源的轉(zhuǎn)錄因子Oct4和Nanog等調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的控制，外源信號和內(nèi)源的轉(zhuǎn)錄因子之間協(xié)同作用共同維持ES細胞的不分化狀態(tài)。我們擬在建立ES細胞和iPS細胞三維培養(yǎng)體系基礎(chǔ)上，研究調(diào)控細胞多能性的這些因子之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，解析其如何相互協(xié)同共同控制多能性細胞的不分化狀態(tài)。并與二維培養(yǎng)體系下干細胞的自我更新調(diào)控網(wǎng)絡(luò)相比較。（三）三維培養(yǎng)干細胞的定向分化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究研究將以向神經(jīng)、心肌、骨骼肌的分化研究為主，主要內(nèi)容如下：1）檢測并比較二維和三維培養(yǎng)的神經(jīng)、心肌、成肌干細胞分化過程中的細胞學(xué)屬性，包括細胞形態(tài)變化、標(biāo)志蛋白表達及細胞功能等。檢測并比較干細胞定向分化過程中亞細胞結(jié)構(gòu)水平的變化，用免疫染色及活細胞成像技術(shù)等觀測細胞粘附特性及細胞骨架結(jié)構(gòu)、細胞遷移和運動特性等。2）運用生化方法檢測并比較二維和三維培養(yǎng)的干細胞在分化過程中受外界信號因子誘導(dǎo)產(chǎn)生的細胞內(nèi)信號通路的動態(tài)變化，分析它們各自信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑整合的特性。其中神經(jīng)細胞研究將以Erk及mTOR信號通路為主。心肌細胞研究利用已建立的人胚胎干細胞向心肌分化的體外培養(yǎng)模型，在三維培養(yǎng)條件下利用基因芯片或深度測序的方法取得基因表達譜，進行生物信息學(xué)分析，構(gòu)建三維條件下心肌分化的轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)。骨骼肌細胞的研究將以PI3K/AKT/GSK3β信號通路為主。（四）三維培養(yǎng)干細胞自我更新與定向分化的表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究1）外界的誘導(dǎo)物如生長因子或其它一些小分子可以和細胞表面的受體結(jié)合并在細胞內(nèi)引起級聯(lián)放大的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)反應(yīng)。這些級聯(lián)放大的信號可以控制或調(diào)節(jié)一系列參與細胞生長、增殖和分化的細胞內(nèi)反應(yīng)，如基因表達的上調(diào)或下調(diào)以及蛋白質(zhì)的合成，修飾和降解。蛋白質(zhì)激酶是介導(dǎo)細胞外刺激引起的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)的最重要的分子，干細胞的自我更新是受磷酸化蛋白嚴密調(diào)控的。我們將系統(tǒng)而定量地分析在二維和三維培養(yǎng)條件下多潛能細胞與成體干細胞自我更新和定向分化過程中蛋白質(zhì)組和磷酸蛋白質(zhì)組的差異，從而找出在三維培養(yǎng)條件下控制干細胞自我更新與定向分化的特異性的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。2）microRNA作為表觀遺傳調(diào)控的重要手段在干細胞自我更新和定向分化調(diào)控過程中發(fā)揮著重要作用。我們將用microRNA芯片進行高通量篩選，利用生物信息學(xué)方法，比較二維和三維培養(yǎng)的條件下多潛能細胞與成體干細胞的非編碼RNA的表達差異，發(fā)現(xiàn)共同及特異表達的非編碼RNA；對這些非編碼RNA基因的基因組位置、結(jié)構(gòu)等基因組特征進行分析并利用實驗生物學(xué)方法探討其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制。（五）干細胞體內(nèi)維持分化與功能研究1）線蟲內(nèi)源神經(jīng)干細胞維持與分化的關(guān)鍵因子神經(jīng)干細胞在體內(nèi)受到niche微環(huán)境內(nèi)多種因子、信號通路的調(diào)控。我們將首先建立線蟲神經(jīng)干細胞體內(nèi)觀察體系，進行全基因組RNAi篩選和化學(xué)誘變。然后通過內(nèi)源啟動子融合熒光實驗，探明相應(yīng)調(diào)控因子的組織表達譜。運用細胞自主性拯救實驗探明該調(diào)控因子信號是如何調(diào)控內(nèi)源神經(jīng)干細胞的維持與分化。2）同源干細胞分化調(diào)控因子在哺乳動物干細胞分化中的作用研究哺乳動物中相對應(yīng)的同源干細胞分化調(diào)控因子，利用RNAi和基因敲除技術(shù)研究這些調(diào)控因子如何影響二維和三維培養(yǎng)干細胞的維持與分化。3）三維培養(yǎng)神經(jīng)干細胞在小鼠紋狀體區(qū)的維持、分化與神經(jīng)回路的重建三維培養(yǎng)神經(jīng)干細胞將具有更好的自我更新潛能和分化潛能。我們將使用近紅外量子點和磁性納米顆粒對三維培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞在體外進行標(biāo)記。經(jīng)納米材料示蹤標(biāo)記的神經(jīng)干細胞將通過立體定位的方法直接注入到包裹小鼠紋狀體的腦室側(cè)壁，即神經(jīng)干細胞的niche區(qū)。在細胞導(dǎo)入后不同時間分別使用增殖細胞、神經(jīng)前體細胞、分化細胞、成熟神經(jīng)元、神經(jīng)突觸等特異的分子標(biāo)記，系統(tǒng)地檢測外源神經(jīng)干細胞在體內(nèi)的增殖、分化行為以及功能回路的建立。同時使用核磁共振活體成像技術(shù)，對干細胞移植動物后進行三維、非破壞性納米技術(shù)示蹤以分析外源神經(jīng)干細胞在體內(nèi)的自我更新、定位、遷移、分化等。4）外源神經(jīng)干細胞參與神經(jīng)功能的恢復(fù)外源神經(jīng)干細胞在體內(nèi)的分化是否可以產(chǎn)生有功能的神經(jīng)元，并參與神經(jīng)功能的恢復(fù)？我們將使用神經(jīng)退行性疾病模型小鼠—舞蹈病模型小鼠作為外源神經(jīng)干細胞的受體，這樣干細胞移植后通過檢測舞蹈病模型小鼠的運動協(xié)調(diào)能力可以直接從功能上評估外源干細胞參與神經(jīng)組織修復(fù)的能力。我們將使用Rotarod、Beam-balance、Gaitanalyis等方法評估外源神經(jīng)干細胞參與神經(jīng)功能的恢復(fù)能力。（六）干細胞的納米示蹤與成像技術(shù)1）高量子效率、高生物相容性量子點的制備（1）高量子效率、高生物相容性量子點的制備：在我們已有工作的基礎(chǔ)上，進一步改進量子點合成技術(shù)，開發(fā)高量子效率的、熒光范圍從可見光區(qū)到近紅外光區(qū)的量子點，并提高量子點的生物相容性，滿足三維培養(yǎng)的干細胞和活體干細胞標(biāo)記和成像。（2）高生物相容性和高弛豫率磁性納米顆粒的制備：通過控制納米粒子的粒徑、化學(xué)成分以及表面性質(zhì)使其具有良好的弛豫性能和生物相容性。2）三維培養(yǎng)干細胞的特異性標(biāo)記：與課題1和2進行合作，針對三維培養(yǎng)的干細胞及其亞細胞結(jié)構(gòu)，分別用相應(yīng)的識別分子（如抗體、適配體、信號肽等）對量子點進行特異性修飾，對細胞骨架組分、細胞因子（如Wnt、FGF、BMP、Notch和TGF-β等）及相關(guān)受體、細胞內(nèi)信號通路中蛋白質(zhì)磷酸化相關(guān)蛋白、非編碼RNA進行特異性標(biāo)記。3）活體干細胞的特異性標(biāo)記：用近紅外量子點或磁性納米粒子對三維培養(yǎng)的干細胞在體外進行標(biāo)記，采用立體定位注射的方法導(dǎo)入小鼠體內(nèi)，利用近紅外量子點的熒光信號或磁性納米粒子的核磁信號對活體內(nèi)的干細胞進行定位與跟蹤，為研究其在體內(nèi)生理環(huán)境下的增殖與分化機制提供證據(jù)。4）三維培養(yǎng)干細胞的近紅外熒光成像技術(shù)：利用單分子/單量子點熒光共定位技術(shù)，研究修飾后的近紅外量子點對細胞骨架組分、細胞因子等的特異性標(biāo)記性能。針對紅外量子點的激發(fā)與發(fā)射光譜特性，研究適合近紅外成像的激光共聚焦顯微技術(shù)；研究近紅外量子點在三維培養(yǎng)干細胞中的示蹤技術(shù)，發(fā)展基于熒光成像的二維、三維培養(yǎng)干細胞分化過程定量分析手段。5）活體干細胞的三維、非損傷性示蹤技術(shù)：研究近紅外光在活體干細胞中的散射與吸收性質(zhì)，開發(fā)利用近紅外量子點標(biāo)記的活體動物熒光成像系統(tǒng)；并且利用活體動物熒光成像系統(tǒng)，對移植體內(nèi)的近紅外量子點標(biāo)記的干細胞進行三維示蹤；結(jié)合納米磁性粒子造影技術(shù)，通過核磁共振成像對磁性納米粒子標(biāo)記的干細胞在活體內(nèi)的維持和分化進行成像示蹤。內(nèi)容總結(jié)

（1）二、預(yù)期目標(biāo)

本項目的總體目標(biāo)：

通過本項目的實施，建立干細胞三維培養(yǎng)和完善干細胞納米示蹤技術(shù)，解析干細胞自我更新與分化過程中遺傳與表觀遺傳的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為干細胞的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)

（2）此外，我們已發(fā)現(xiàn)哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通過STAT3-p63-Jagged-Notch級聯(lián)調(diào)控細胞維持細胞增殖和分化之間的平衡

附錄資料:不需要的可以自行刪除中西藥養(yǎng)護技術(shù)與方法藥品養(yǎng)護-藥品養(yǎng)護的概念

藥品養(yǎng)護是運用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)與方法，研究藥品儲存養(yǎng)護技術(shù)和儲存藥品質(zhì)量變化規(guī)律，防止藥品變質(zhì)，保證藥品質(zhì)量，確保用藥安全、有效的一門實用性技術(shù)科學(xué)。

藥品養(yǎng)護-藥品養(yǎng)護的基本要求

各種藥品的功能是由藥物本身性質(zhì)所決定的，每種藥物的內(nèi)在成分與其他物質(zhì)一樣，時刻在不斷運動和變化，這就構(gòu)成了它在貯藏期間引起變化的內(nèi)在因素，加上自然條件的影響，必然發(fā)生物理、化學(xué)以及生物學(xué)等變化。而這些相互影響又互為關(guān)聯(lián)的變化，要求人們不僅要了解掌握藥品內(nèi)在質(zhì)變的形式。同時還需要了解自然條件（如溫度、濕度、空氣等）變化的規(guī)律。

藥品養(yǎng)護的各項工作內(nèi)容都應(yīng)圍繞保證藥品儲存質(zhì)量為目標(biāo)。其主要工作內(nèi)容有：檢查控制在庫藥品的儲存條件，對藥品進行定期質(zhì)量檢查，對發(fā)現(xiàn)的問題及時采取有效的處理措施。

藥品養(yǎng)護是一項涉及到質(zhì)量管理、倉儲保管、業(yè)務(wù)經(jīng)營等方面的綜合性工作，按照工作性質(zhì)及崗位職責(zé)的不同，要求各相關(guān)崗位必須相互協(xié)調(diào)與配合，保證藥品養(yǎng)護工作的有效開展。

質(zhì)量管理人員負責(zé)對藥品養(yǎng)護人員進行業(yè)務(wù)指導(dǎo)，審定藥品養(yǎng)護工作計劃，確定重點養(yǎng)護品種，對藥品養(yǎng)護人員上報的質(zhì)量問題進行分析并確定處理措施，對養(yǎng)護工作的開展情況實施監(jiān)督考核。

養(yǎng)護人員負責(zé)指導(dǎo)保管人員對藥品進行合理儲存，定期檢查在庫藥品儲存條件及庫存藥品質(zhì)量，針對藥品的儲存特性采取科學(xué)有效的養(yǎng)護方法，定期匯總、分析和上報藥品養(yǎng)護質(zhì)量信息，負責(zé)驗收養(yǎng)護儲存儀器設(shè)備的管理工作，建立藥品養(yǎng)護檔案。

藥品的儲存質(zhì)量是受儲存環(huán)境和藥品性狀的制約和影響。在實際工作中，應(yīng)根據(jù)經(jīng)營藥品的品種結(jié)構(gòu)、藥品儲存條件的要求、自然環(huán)境的變化、監(jiān)督管理的要求，在確保日常養(yǎng)護工作有效開展的基礎(chǔ)上，將部分藥品確定為重點養(yǎng)護品種，采取有針對性的養(yǎng)護方法。

重點養(yǎng)護品種范圍一般包括：主營品種、首營品種、質(zhì)量性狀不穩(wěn)定的品種、有特殊儲存要求的品種、儲存時間較長的品種、近期內(nèi)發(fā)生過質(zhì)量問題的品種及藥監(jiān)部門重點監(jiān)控的品種。

養(yǎng)護員按照“三三四”原則，每月對在庫藥品質(zhì)量（藥店陳列藥品）進行巡回檢查，并做好養(yǎng)護檢查記錄。

（三三四原則全稱應(yīng)該叫做：三三四藥品質(zhì)量循環(huán)檢查法。方法是將在庫藥品分為A、B、C3類，每類分別占總庫存的30%、30%、40%左右，然后每個月檢查一類，3個月就可將在庫藥品檢查完一遍，總計1年檢查4遍。）

中藥的采購與貯藏與養(yǎng)護

第一節(jié)中藥飲片的采購和驗收

驗收藥品應(yīng)當(dāng)做好驗收記錄，包括藥品的通用名稱、劑型、規(guī)格、批準文號、批號、生產(chǎn)日期、有效期、生產(chǎn)廠商、供貨單位、到貨數(shù)量、到貨日期、驗收合格數(shù)量、驗收結(jié)果等內(nèi)容。驗收人員應(yīng)當(dāng)在驗收記錄上簽署姓名和驗收日期。

中藥材驗收記錄應(yīng)當(dāng)包括品名、產(chǎn)地、供貨單位、到貨數(shù)量、驗收合格數(shù)量等內(nèi)容。中藥飲片驗收記錄應(yīng)當(dāng)包括品名、規(guī)格、批號、產(chǎn)地、生產(chǎn)日期、生產(chǎn)廠商、供貨單位、到貨數(shù)量、驗收合格數(shù)量等內(nèi)容，實施批準文號管理的中藥飲片還應(yīng)當(dāng)記錄批準文號。

第二節(jié)中藥的質(zhì)量變異現(xiàn)象

一、飲片貯存中常見的質(zhì)量變異現(xiàn)象

1.蟲蛀：含淀粉、糖、脂肪、蛋白質(zhì)

大黃、白芷、桑螵蛸、北沙參、娑羅子、前胡

蟲蛀大白紙，桑蛸殺娑湖

2.泛油：含揮發(fā)油：當(dāng)歸、丁香

含脂肪油：柏子仁、桃仁、杏仁

含糖：牛膝、麥冬、天冬、熟地、黃精

白（柏）杏歸香桃，二冬贖（熟）精牛

3.霉變：陳皮、獨活、前胡、佛手

4.變色

由淺變深：澤瀉、白芷、山藥、天花粉

由深變淺：黃芪、黃柏

由鮮艷變暗淡：紅花、菊花、金銀花、臘梅花

5.氣味散失：肉桂、沉香、豆蔻、砂仁

6.風(fēng)化：膽礬、硼砂、芒硝

7.潮解：青鹽、咸秋石、芒硝

8.粘連：蘆薈、沒藥、乳香、阿魏、鹿角膠、龜甲膠

9.腐爛：鮮類藥

二、中成藥貯存中常見質(zhì)量變異現(xiàn)象

蟲蛀：蜜丸、水丸、散劑、茶曲劑

霉變：蜜丸、膏滋、片劑

酸?。汉蟿?、酒劑、煎膏劑、糖漿劑、軟膏劑

揮發(fā)：芳香水劑、酊劑

沉淀：藥酒、口服液、針劑

第三節(jié)引起中藥質(zhì)量變異的因素

一、自身因素（6個）

1.水分---高：蟲蛀、霉?fàn)€、潮解、軟化、粘連

低：風(fēng)化、走味、泛油、干裂、脆化

2.淀粉---蟲蛀、霉變

3.黏液質(zhì)---發(fā)霉、生蟲

4.油脂---產(chǎn)生異味：桃仁、杏仁

引起酸敗現(xiàn)象：刺猬皮、狗腎

5.揮發(fā)油---氣味散失：白芷、當(dāng)歸、荊芥、薄荷、肉桂、樟腦、姜黃、山奈

6.色素---發(fā)霉變色：月季花、玫瑰花

二、環(huán)境因素（8個）

1.溫度---生蟲、發(fā)霉；水分蒸發(fā)；氣味散失；成分變化；酸敗泛油；黏結(jié)成塊

2.濕度---貯存?zhèn)}庫的相對濕度最好控制在70%以下

---高：吸潮變質(zhì)；低：風(fēng)化

3.日光---變色、氣味散失、揮發(fā)、風(fēng)化、泛油

4.空氣---泛油、蟲蛀、霉變

5.霉菌---霉變、腐爛變質(zhì)

6.害蟲---蟲蛀

7.包裝容器

8.貯存時間

第四節(jié)中藥的貯存與養(yǎng)護

一、中藥材和飲片的貯藏

■飲片庫房室溫控制在25℃以下，相對濕度75%以下

■陰涼干燥處：含揮發(fā)油類（薄荷、當(dāng)歸、川芎、荊芥）

■涼爽處：礦物類（硼砂、芒硝）

■石灰保存：牛黃、人參

■易燃物品：硫黃、火硝、樟腦

■毒性藥品：單獨存放

■密封保存：動物類、礦物類

二、中藥材和飲片的養(yǎng)護

1.傳統(tǒng)養(yǎng)護技術(shù)（6個）

清潔養(yǎng)護法、除濕養(yǎng)護法、密封（密閉）養(yǎng)護法、低溫養(yǎng)護法、對抗同貯法、高溫養(yǎng)護法

■清潔養(yǎng)護法：清潔衛(wèi)生是防止倉蟲入侵的最基本和最有效的方法

■除濕養(yǎng)護法：

1.通風(fēng)法

2.吸濕防潮法：生石灰塊、無水氯化鈣

■密封（密閉）養(yǎng)護法：是貯藏的基本方法

■低溫養(yǎng)護法：2～10℃，具有防霉、防蟲、防變色、防走油，主要用于貴重藥材保存，如哈蟆油、銀耳、人參、菊花、陳皮、山藥、枸杞子（＜-4℃可使害蟲致死）

■高溫同貯法：可有效防治蟲害的侵襲。高于40℃害蟲停止發(fā)育，高于50℃，害蟲將在短時間死亡。含揮發(fā)油的飲片烘烤溫度不宜超過60℃

對抗同貯法

2.現(xiàn)代養(yǎng)護技術(shù)（8個）

干燥養(yǎng)護技術(shù)

氣調(diào)養(yǎng)護技術(shù)

60Co-γ射線輻射殺蟲滅菌養(yǎng)護技術(shù)

包裝防霉養(yǎng)護法

氣幕防潮養(yǎng)護技術(shù)

蒸氣加熱養(yǎng)護技術(shù)

氣體滅菌養(yǎng)護技術(shù)

中藥揮發(fā)油熏蒸防霉技術(shù)

三、中成藥的養(yǎng)護

應(yīng)密閉貯存：散劑、膠劑、膏藥、軟膏、鼻用制劑、栓劑、凝膠劑

應(yīng)密封貯存：丸劑、片劑、煎膏劑、合劑、顆粒劑、膠囊劑、糖漿劑、注射劑、酒劑、露劑

溫度低于30℃的劑型：膠囊劑、栓劑

遮光：軟膏劑、注射劑、酊劑、流浸膏與浸膏劑、凝膠劑、眼用制劑

四、中國藥典凡例

遮光：用不透光的容器包裝

密閉：防止塵土及異物進入

密封：防止風(fēng)化、吸潮、揮發(fā)或異物進入

熔封或嚴封：防止空氣和水分侵入，防止污染

陰涼處：不超過20℃

涼暗處：避光并不超過20℃

冷處：2～10℃

常溫：10～30℃

檢查日期、藥品名稱、劑型、規(guī)格、單位、數(shù)量、生產(chǎn)廠家、批號、批準文號、有效期、質(zhì)量狀況、養(yǎng)護措施、處理結(jié)果。

養(yǎng)護員：

表格中除：檢查日期、質(zhì)量狀況、養(yǎng)護措施、處理結(jié)果、養(yǎng)護員欄要手工填寫外，其余電腦自動可生成。

檢查日期：從打印時間開始填寫至下月幾號為止，看有多少頁平均后連續(xù)填寫時間也可，但不能填寫一樣的時間；

質(zhì)量狀況：填寫“無異常”；

養(yǎng)護措施：可填寫“效期催銷”、“翻垛”、“通風(fēng)”等，視具體需要養(yǎng)護情況而定；

處理結(jié)果：“繼續(xù)銷售”；

養(yǎng)護員：要簽完整名字。

二）養(yǎng)護工作的具體實施

1、養(yǎng)護儲存的合理性

藥品養(yǎng)護員在日常管理過程中，應(yīng)對在庫藥品的分類儲存、貨垛碼放、垛位間距、色標(biāo)管理等工作內(nèi)容進行巡查，及時糾正發(fā)現(xiàn)的問題，確保藥品按規(guī)定的要求合理儲存。

2、倉儲條件監(jiān)測與控制

藥品倉儲條件的監(jiān)測與控制內(nèi)容主要包括：庫內(nèi)溫濕度、藥品儲存設(shè)備的適宜性，藥品避光和防鼠等措施的有效性、安全措施的運行狀態(tài)。

為保證各類庫房的溫、濕度符合規(guī)定的要求，倉庫保管人員要在養(yǎng)護員的指導(dǎo)下，有效地對庫房溫、濕度條件進行動態(tài)監(jiān)測和管理，發(fā)現(xiàn)庫房溫濕度超出規(guī)定范圍或接近臨界值時，或接近臨界值時，應(yīng)及時采取通風(fēng)、降溫、除濕、保溫等措施進行有效調(diào)控，并予以記錄。對庫房的溫、濕度條件應(yīng)定時進行觀察記錄，一般每日上、下午各一次。

為確保倉庫溫濕度條件的全天候監(jiān)控，藥品控制企業(yè)在節(jié)假日也應(yīng)安排值班人員，對倉庫的儲存條件進行監(jiān)控。

3、庫存藥品質(zhì)量的循環(huán)檢查

養(yǎng)護員應(yīng)按照規(guī)定的方法和要求，定期對庫存藥品的質(zhì)量狀況進行循環(huán)檢查，循環(huán)養(yǎng)護檢查一般按季度進行。購進藥品應(yīng)在入庫后三個月起進行第一次庫存藥品檢查。養(yǎng)護時應(yīng)做好養(yǎng)護記錄，對養(yǎng)護中的藥品質(zhì)量狀況進行準確的記錄。

當(dāng)氣候條件出現(xiàn)異常變化，遇高溫、嚴寒、雨季或發(fā)現(xiàn)藥品有質(zhì)量變化跡象時，應(yīng)由質(zhì)量管理部組織有關(guān)人員或全面檢查；為避免漏查，應(yīng)嚴格規(guī)定檢查順序，如：按每個貨架、貨垛順時針檢查等；主要檢查內(nèi)容包括包裝情況、外觀性狀，對易變質(zhì)藥品、儲存期較長、近效期不足一年的藥品或其它應(yīng)檢查的藥品，應(yīng)按規(guī)定的程序和要求進行有效的管理。

4、養(yǎng)護中發(fā)現(xiàn)質(zhì)量問題的處理

藥品養(yǎng)護中發(fā)現(xiàn)的問題一般包括技術(shù)操作、設(shè)施設(shè)備、藥品質(zhì)量等方面的內(nèi)容，養(yǎng)護員應(yīng)對發(fā)現(xiàn)的問題進行認真的分析，及時上報質(zhì)量管理部核實、處理，按照質(zhì)量管理部的要求，采取措施對質(zhì)量管理過程實施改進，從而有效地控制藥品儲存質(zhì)量。

養(yǎng)護員對養(yǎng)護過程中發(fā)現(xiàn)的藥品質(zhì)量問題，應(yīng)懸掛醒目的黃色標(biāo)牌，并暫停發(fā)貨，上報質(zhì)量管理機構(gòu)進行處理。

（三）藥品養(yǎng)護檔案與信息

為給藥品養(yǎng)護工作提供系統(tǒng)、全面的管理依據(jù)，不斷提高藥品養(yǎng)護的技術(shù)水平，企業(yè)應(yīng)針對重點養(yǎng)護品種建立藥品養(yǎng)護檔案，收集、分析、傳遞養(yǎng)護過程中的信息資料，從而保證藥品養(yǎng)護質(zhì)量系統(tǒng)的有效運行。

1、藥品養(yǎng)護檔案

企業(yè)應(yīng)結(jié)合倉儲管理的實際，本著"以保證藥品質(zhì)量為前提，以服務(wù)業(yè)務(wù)經(jīng)營需要為目標(biāo)"的原則，針對重點養(yǎng)護品種建立藥品重點養(yǎng)護品種建立藥品養(yǎng)護檔案。藥品養(yǎng)護檔案是在一定的經(jīng)營周期內(nèi)，對藥品儲存質(zhì)量的穩(wěn)定性進行連續(xù)觀察與監(jiān)控，總結(jié)養(yǎng)護經(jīng)驗，改進養(yǎng)護方法，積累技術(shù)資料的管理手段。其內(nèi)容包括藥品的基本質(zhì)量信息、觀察周期內(nèi)對藥品儲存質(zhì)量的追蹤記錄、有關(guān)問題的處理情況等。藥品養(yǎng)護檔案的品種應(yīng)根據(jù)業(yè)務(wù)經(jīng)營活動的變化，及時調(diào)整，一般應(yīng)按年度調(diào)整確定。

2、養(yǎng)護質(zhì)量信息

按照GSP規(guī)定，藥品養(yǎng)護人員應(yīng)定期匯總、分析和上報養(yǎng)護檢查、近效期或長時間儲存的藥品的質(zhì)量信息。以便質(zhì)量管理部門和業(yè)務(wù)部門及時、全面地掌握儲存藥品質(zhì)量信息，合理調(diào)節(jié)庫存藥品的數(shù)量，保證經(jīng)營藥品符合質(zhì)量要求，其報告內(nèi)容應(yīng)匯總該經(jīng)營周期內(nèi)經(jīng)營品種的結(jié)構(gòu)、數(shù)量、批次等項目，統(tǒng)計并分析儲存養(yǎng)護工程中發(fā)現(xiàn)的質(zhì)量問題的相關(guān)指標(biāo)，如質(zhì)量問題產(chǎn)生的原因、比率，進而提出養(yǎng)護工作改進的措施及目標(biāo)。

（四）、影響藥品質(zhì)量的因素

1、影響藥品質(zhì)量的內(nèi)在因素

a、易水解的藥品當(dāng)藥品的化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有酯、酰胺、酰肼、醚、苷鍵時，易發(fā)生水解反應(yīng)。如青霉素的分子中含有β-內(nèi)酰胺環(huán)，在酸性、中性或堿性溶液中易發(fā)生分解反應(yīng)和分子重排反應(yīng)，其分解產(chǎn)物與分子重排物均無抗菌作用。故青霉素只能制成粉末，嚴封于容器中貯藏。

b、易被氧化的藥品當(dāng)藥品的化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有酚羥基、巰基、香胺、不飽和碳鍵、醇、醚、醛、吡唑酮、吩噻嗪等基團時，易發(fā)生氧化反應(yīng)。如氯丙嗪屬于吩噻嗪類化合物，在日光、空氣、濕氣的作用下易變質(zhì)失效，故應(yīng)遮光，密封保存。

2、藥品的物理性質(zhì)與質(zhì)量的關(guān)系

a、揮發(fā)性系指液態(tài)藥品能變?yōu)闅鈶B(tài)擴散到空氣中的性質(zhì)。具有揮發(fā)性的藥品如果包裝不嚴或貯存時的溫度過高，可造成揮發(fā)減量，如乙醇、薄荷等在常溫下即有強烈的揮發(fā)性，還可以引起燃燒和爆炸。

b、吸濕性系指藥品自外界空氣中不同程度地吸附水蒸氣的性質(zhì)。藥品的吸濕性并不限于水溶性藥品，某些高分子藥品和水不溶性藥品同樣可以吸濕,但當(dāng)含有少量的氯化鎂等雜質(zhì)時，則表現(xiàn)出顯著的吸濕性。

c、吸附性藥品能夠吸收空氣中的有害氣體或特殊臭氣的性質(zhì)被稱為藥品的吸附性。例如淀粉、藥用碳、滑石粉等因表面積大而具有顯著的吸附作用從而使本身具有被吸附氣體的氣味，亦稱"串味"。

d、凍結(jié)性以水或乙醇作溶劑的一些液體藥品遇冷可凝結(jié)成固體，這種固體會導(dǎo)致藥品的體積膨脹而引起容器破裂。

e、風(fēng)化性有些含結(jié)晶水的藥品在干燥空氣中易失去全部或部分結(jié)晶水，變成白色不透明的晶體或粉末，稱為"風(fēng)化"。風(fēng)化后的藥品的藥效雖然未變，但影響使用的準確性,尤其是一些毒性較大的藥品可因此而超過劑量，造成醫(yī)療事故。

f、色、嗅、味藥品色、嗅、味是藥品重要的外觀性狀，也是藥品的物理性質(zhì)之一，當(dāng)色、嗅、味發(fā)生變化時，經(jīng)常意味著藥品性質(zhì)發(fā)生了變化，所以它們是保管人員實施感官檢查的重要根據(jù)。如維生素C片由白變黃，是由于發(fā)生了氧化反應(yīng)；阿司匹林片出現(xiàn)針狀結(jié)晶或濃厚的醋酸味，是由于因吸濕而發(fā)生水解反應(yīng)，產(chǎn)生了水楊酸和乙酸；某些藥品的異臭、異味可能是微生物所引起發(fā)酵、腐敗等。

此外，藥品的熔化性、溶解性等均是影響藥品質(zhì)量的內(nèi)在因素。

2、影響藥品質(zhì)量的外在因素

影響藥品質(zhì)量的外在因素很多，這些因素對藥品的影響往往是幾種因素同時進行或交叉進行，互相促進、互相作用而加速藥品的變質(zhì)和失效。因此，我們所采取的保管措施也應(yīng)是綜合性的。

（1）、空氣

空氣是不同氣體的混合物，主要成分是氮、氧、二氧化碳以及氬、氖、氪、氙等稀有元素。此外，空氣中還含有水蒸氣、二氧化碳和塵埃等。在被污染的空氣中還混雜有二氧化硫、硫化氫、氨、氯化氫等有害氣體。與藥品的質(zhì)量有關(guān)的主要是氧、二氧化碳。

a、氧

許多具有還原性藥品，可被空氣中的氧所氧化，發(fā)生分解、變色、變質(zhì)，甚至產(chǎn)生毒性。如異丙腎上腺素被氧化后，可由白色變?yōu)榉奂t色，此時即不可供藥用。

b、二氧化碳

空氣中的二氧化碳可使某些藥品因發(fā)生碳酸化而變質(zhì)。如某些氫氧化物和氧化物易吸收二氧化碳而生成碳酸鹽；磺胺類鈉鹽與二氧化碳作用后，可生成難溶于水的游離磺胺而結(jié)晶析出。

（2）、溫度

溫度在藥品的保管養(yǎng)護中是重要條件之一，它與濕度有密切的關(guān)系，干燥的固體藥品受溫度影響的程度遠比吸潮或呈液體狀態(tài)的藥品小的多。

a、溫度升高可加速藥品的變質(zhì)如生物制品、血液制品在室溫下保管容易失效，需要低溫冷藏（2~10℃）；可加速藥品的揮發(fā)與風(fēng)化如咖啡因可失去分子中的結(jié)晶水；可破壞藥品的劑型如可使栓劑、膠囊劑軟化變形，使糖衣片粘連，使軟膏劑熔化分層等。

b、溫度過低可使一些生物制品、含蛋白制劑、乳劑及膠體制劑析出沉淀或變性分層，如甲醛溶液在9℃以下易聚合成為多聚甲醛而使溶液呈現(xiàn)混濁或析出白色沉淀；可使許多液體制劑析出結(jié)晶，其中一些藥品因結(jié)晶而失效，如葡萄糖酸鈣注射液等飽和溶液久置冷處易析出結(jié)晶不再溶解，而不能藥用；可致容器因藥液體積增加而破裂等。

（3）、濕度

濕度是藥品養(yǎng)護的重要條件之一，濕度過高或過低均引起許多藥品發(fā)生變性。

a、潮解

如鈉鹽吸濕性較大，最易發(fā)生潮解；一些不溶于水的藥品如活性碳及干燥氫氧化鋁等也可因物理吸附作用而潮解；胃蛋白酶、胰酶等易于吸濕結(jié)成團塊。

b、稀釋

一些具有吸水性的液體藥品如甘油、乳酸等再潮濕環(huán)境匯總易吸收水分而被稀釋，從而使?jié)舛冉档?，影響藥效?/p>

c、水解

有些藥品因吸潮而分解變質(zhì)，如阿司匹林易吸濕而水解生成乙酸和水楊酸，不但毒性增加，而且對胃腸道的刺激也增加。

（4）、光線

紫外線是藥品發(fā)生分解、氧化、還原、水解等化學(xué)反應(yīng)的催化劑之一。如腎上腺素受到光照的影響可發(fā)生氧化反應(yīng)逐漸變成紅色至棕色，使療效降低或失效；又如氧化氫溶液分解為氧和水等。在很多情況下，光線并不是孤立的發(fā)生作用，而是經(jīng)常伴隨空氣中的氧、水分、溫度等因素同時進行。所以，對光敏感的藥品，應(yīng)密閉于涼暗處保存。

（5）、微生物于昆蟲

微生物（細菌、霉菌、酵母菌）和昆蟲，很容易進入包裝不嚴的藥品內(nèi)，它們的生長、繁殖是造成藥品腐敗、發(fā)酵、蛀蝕等變質(zhì)現(xiàn)象的一個主要原因。尤其是一些含有營養(yǎng)物質(zhì)（如淀粉、糖、蛋白質(zhì)、脂肪等）的制劑，如糖漿劑、片劑幾一些中草藥制劑更易發(fā)生霉變和蟲蛀。

（6）、時間

藥品貯存一定時間以后就會變質(zhì)。尤其是一些有效期藥品，即使貯存條件適宜，久存也易降低效價，如抗生素、生物制品等；一些暫時沒有制定有效期的藥品，如乳劑、水劑、栓劑等一些性質(zhì)不穩(wěn)定的藥品，時間長了也會變質(zhì)。有的藥品貯存一段時間后，外觀上無變化，但含量或效價降低而不能藥用。

除了上述因素以外，尚有藥品的包裝容器及材料等因素也可對藥品的質(zhì)量發(fā)生影響

中藥重點養(yǎng)護品種目錄

易生蟲飲片如下：

黨參，人參，南沙參，冬蟲夏草，當(dāng)歸，獨活，白芷，防風(fēng)，板藍根，甘遂，生地，澤瀉，全瓜蔞，枸杞子，大皂角，桑椹，龍眼肉，核桃仁，蓮子芯，苡米，杏仁，青風(fēng)藤，桑白皮，鹿茸，蘄蛇，雞內(nèi)金，菊花，金銀花，凌霄花，北沙參，防己，莪術(shù)，貝母，金果欖，佛手，陳皮，砂仁，酸棗仁，紅花，鬧羊花，蒲黃，芫花，蟬蛻，黃柏，狗腎，廣地龍，甘草，黃芪，山藥，天花粉，桔梗，靈芝，豬苓，茯苓，水蛭，僵蠶，蜈蚣，烏藥，葛根，丹參，何首烏，赤芍，苦參，延胡索，升麻，大黃，肉豆蔻，淡豆豉，柴胡，地榆

易發(fā)霉飲片：

天門冬，懷牛膝，獨活，玉竹，黃精，白果，橘絡(luò)，全瓜蔞，山萸肉，蓮子芯，枸杞子，大棗，馬齒筧，大小薊，大青葉，桑葉，蛤士蟆，鹿筋，狗腎，水獺肝，哈蚧，黃柏，白鮮皮，川槿皮，人參，黨參，當(dāng)歸，毛知母，紫箢，菊花，紅花，金銀花，白及，云木香，五味子，洋金花，螻蛄，地龍，蘄蛇，蜈蚣，甘草，葛根，山奈，青皮，芡實，薏苡仁，梔子

易泛油飲片：

獨活，火麻仁，核桃仁，榧子，千金子，當(dāng)歸，懷牛膝，巴豆，狗腎，云木香，龍眼肉，桔核，杏仁，螻蛄，紫河車，前胡，川芎，白術(shù)，蒼術(shù)

易變色飲片：

月季花，梅花，玫瑰花，款冬花，紅花，山茶花，金銀花，扁豆花，橘絡(luò)，佛手，通草，麻黃

易失去氣味飲片：

藿香，香薷，紫蘇，薄荷，佩蘭，荊芥，細辛肉桂，花椒，月季花，玫瑰花，吳茱萸，八角茴香，丁香，檀香，沉香，厚撲，獨活，當(dāng)歸。

易升華，軟化融化類飲片：

（1）易升華類：樟腦，薄荷腦，冰片

（2）易軟化融化類：松香，蘆薈，阿魏，豬膽膏，安息香，乳香，沒藥

（3）蘇合香。

易風(fēng)化，潮解類飲片：

易風(fēng)化類：硼砂，白礬，綠礬，芒硝，膽礬

易潮解類：芒硝，火青鹽，綠礬，硼砂，咸秋石，鹽附子，全蝎，海藻，昆布內(nèi)容總結(jié)

（1）藥品養(yǎng)護-藥品養(yǎng)護的概念

藥品養(yǎng)護是運用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)與方法，研究藥品儲存養(yǎng)護技術(shù)和儲存藥品質(zhì)量變化規(guī)律，防止藥品變質(zhì)，保證藥品質(zhì)量，確保用藥安全、有效的一門實用性技術(shù)科學(xué)

（2）中藥材驗收記錄應(yīng)當(dāng)包括品名、產(chǎn)地、供貨單位、到貨數(shù)量、驗收合格數(shù)量等內(nèi)容

附錄資料:不需要的可以自行刪除中西藥養(yǎng)護技術(shù)與方法藥品養(yǎng)護-藥品養(yǎng)護的概念

藥品養(yǎng)護是運用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)與方法，研究藥品儲存養(yǎng)護技術(shù)和儲存藥品質(zhì)量變化規(guī)律，防止藥品變質(zhì)，保證藥品質(zhì)量，確保用藥安全、有效的一門實用性技術(shù)科學(xué)。

藥品養(yǎng)護-藥品養(yǎng)護的基本要求

各種藥品的功能是由藥物本身性質(zhì)所決定的，每種藥物的內(nèi)在成分與其他物質(zhì)一樣，時刻在不斷運動和變化，這就構(gòu)成了它在貯藏期間引起變化的內(nèi)在因素，加上自然條件的影響，必然發(fā)生物理、化學(xué)以及生物學(xué)等變化。而這些相互影響又互為關(guān)聯(lián)的變化，要求人們不僅要了解掌握藥品內(nèi)在質(zhì)變的形式。同時還需要了解自然條件（如溫度、濕度、空氣等）變化的規(guī)律。

藥品養(yǎng)護的各項工作內(nèi)容都應(yīng)圍繞保證藥品儲存質(zhì)量為目標(biāo)。其主要工作內(nèi)容有：檢查控制在庫藥品的儲存條件，對藥品進行定期質(zhì)量檢查，對發(fā)