第4章-PCR技術(shù)的應(yīng)用-課件

PCR技術(shù)的應(yīng)用PCR技術(shù)的應(yīng)用第4章-PCR技術(shù)的應(yīng)用-課件分子克隆操作的一般步驟：（1）獲得目的基因；（2）與克隆載體連接，形成新的重組DNA分子；（3）用重組DNA分子轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞，并能在受體細(xì)胞中復(fù)制和遺傳；（4）對轉(zhuǎn)化子篩選和鑒定；（5）對獲得外源基因的細(xì)胞或生物體通過培養(yǎng)，獲得所需的遺傳性狀或表達(dá)出所需要的產(chǎn)物。分子克隆操作的一般步驟：（1）獲得目的基因；一、概述

PCR：使用一對寡核苷酸引物，以目的序列為模板，利用DNA合成酶和四種脫氧核糖核酸進行DNA的體外合成反應(yīng)。

PCR技術(shù)具有靈敏度高，特異性高、操作方便和重復(fù)性好等特點，能夠在幾個小時內(nèi)獲得多達(dá)幾百萬拷貝的目的基因。該技術(shù)在上個世紀(jì)80年代中期由美國K.Mullis發(fā)明建立，經(jīng)過近二十年已發(fā)展成包括多種衍生技術(shù)，在很多領(lǐng)域中廣泛使用，K.Mullis也因此獲得1993年度的諾貝爾化學(xué)獎。一、概述PCR：使用一對寡核苷酸引物，以目的序列為模板，利二、PCR基本原理

DNA在細(xì)胞中的復(fù)制是一個復(fù)雜的酶促脫氧核糖核酸聚合過程，是DNA聚合酶、DNA連接酶、引發(fā)酶、RNA引物、四種脫氧核糖核酸、DNA超螺旋酶、離子環(huán)境等多成份參與的過程。

PCR是在試管內(nèi)使用最基本的成份模擬了細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制，所以在一個PCR中必需成分是

1.模板DNA2.DNA聚合酶

3.四種脫氧核糖核酸

4.正向和反向兩條引物

5.適當(dāng)?shù)木彌_體系。二、PCR基本原理DNA在細(xì)胞中的復(fù)制是一個復(fù)雜的酶促脫氧模板序列：待擴增的DNA序列，一般為雙鏈的DNA可包括線形雙螺旋DNA，如基因組DNA，及閉環(huán)雙鏈DNA，如質(zhì)粒；模板的來源很廣，如從細(xì)胞/細(xì)菌中提取基因組DNA、提取mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA、質(zhì)粒、病毒等；每個反應(yīng)中模板的量為1ng～1μg。質(zhì)粒DNA和純化的DNA的量可少一些，而基因組DNA的量應(yīng)多一些。PCR靈敏度很高，所以在操作中注意避免非目的基因序列的污染，否則會導(dǎo)致PCR的非特異性擴增。1、模板DNA模板序列：待擴增的DNA序列，一般為雙鏈的DNA可包括線形雙引物（primer）也稱為寡核苷酸引物，常規(guī)的PCR反應(yīng)需要兩種引物，分別成為5′端引物和3’端引物，或稱為正向引物和反向引物。通常DNA及mRNA序列的寫法為5′→3′，所以5′端引物與目的序列的5′末端序列相同，而3′端引物與目的序列的3′末端序列反向互補。2、引物它們作為DNA擴增的起始部分，能限定待擴增DNA序列的長度。為了保證擴增的特異性和有效性，引物與模板相匹配部分應(yīng)至少有15～18bp。5′5′3′3′5′5′3′3′上游引物下游引物引物（primer）也稱為寡核苷酸引物，常規(guī)的PCR反應(yīng)需要DNA聚合酶：以DNA為模板，以脫氧核糖核酸為底物催化合成新的DNA的一種酶。早期的PCR反應(yīng)使用的DNA聚合酶為大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段。但該酶在高溫下容易失活，需要在每次合成反應(yīng)進行時候再加入一份酶。隨著新的耐熱DNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)及在PCR反應(yīng)中的應(yīng)用，使PCR操作更方便，產(chǎn)量更穩(wěn)定。目前商品化的DNA聚合酶有TaqDNA聚合酶和PfuDNA聚合酶。TaqDNA聚合酶最適工作溫度為75-80℃。該酶具有5′→3′聚合酶活性，在鎂離子存在情況下可催化核苷酸沿5′→3′方向發(fā)生聚合反應(yīng)。3、DNA聚合酶DNA聚合酶：以DNA為模板，以脫氧核糖核酸為底物催化合成新4、脫氧核糖核酸四種脫氧核苷三磷酸即dATP、dTTP、dCTP和dGTP，為PCR反應(yīng)中DNA合成原料。在新的一個反應(yīng)體系中，這四種脫氧核糖核酸的起始濃度應(yīng)該都相等，如果其中一種的濃度明顯不同于其他的就會誘發(fā)錯配，并降低新鏈合成速度。4、脫氧核糖核酸四種脫氧核苷三磷酸即dATP、dTTP、dC緩沖液提供PCR反應(yīng)所必需的合適酸堿度與離子環(huán)境。主要成分有KCl、Tris-Cl和MgCl2。其中Mg2＋的濃度最重要，它能影響DNA聚合酶的活性，以及模板與PCR產(chǎn)物的解鏈溫度。5、緩沖液緩沖液提供PCR反應(yīng)所必需的合適酸堿度與離子環(huán)境。主要成分有變性：是指模板的熱變性，雙螺旋模版DNA成為單鏈的DNA分子；在應(yīng)用TaqDNA聚合酶進行PCR反應(yīng)時，變性往往在94℃～95℃條件下進行。這也是TaqDNA聚合酶進行30個左右的PCR循環(huán)而活力不致受到過多損失時所能耐受的最適溫度。退火：是指引物和模板在局部形成互補的雜交鏈的過程。退火溫度比兩條寡核苷酸引物的熔解溫度低5～10℃，PCR實驗要對退火溫度進行優(yōu)化。三、PCR基本步驟變性：是指模板的熱變性，雙螺旋模版DNA成為單鏈的DNA分子延伸：在鎂離子存在條件下，DNA聚合酶按堿基互補原則，催化四種脫氧核糖核酸加在引物的3′端，使引物沿5′→3′方向生成與模版DNA互補的新DNA鏈。雙鏈模版DNA變性退火5′3′5′3′5′5′3′3′5′5′3′3′5′5′3′3′上游引物下游引物延伸3′5′5′3′3′5′5′3′多次循環(huán)（2n拷貝）延伸：在鎂離子存在條件下，DNA聚合酶按堿基互補原則，催化四下面為一個典型的PCR循環(huán)參數(shù)設(shè)置：備注：*比兩條引物的Tm值低5~10℃。94℃5min94℃30sX℃*30s72℃1kb/min72℃5min25-35個循環(huán)下面為一個典型的PCR循環(huán)參數(shù)設(shè)置：備注：*比兩條引物的T四、影響PCR因素

雖然PCR操作很方便，但影響因素也很多，從而影響PCR的特異性和高效性。引物變性溫度和時間退火溫度和時間延伸溫度和時間循環(huán)次數(shù)四、影響PCR因素雖然PCR操作很方便，但影響因素也很多，引物決定了PCR產(chǎn)物的長度和特異性。引物的設(shè)計要求請看本實驗講義“引物設(shè)計”部分。1、引物引物決定了PCR產(chǎn)物的長度和特異性。1、引物在PCR反應(yīng)剛開始時，為保證作為模板的雙鏈DNA完全變性成單鏈DNA，一般設(shè)為95℃、5min；在隨后的循環(huán)中，可設(shè)為95℃、30s。有些模板DNA的G+C含量較高，變性溫度就越高。太高的變性溫度和太長的變性時間會影響DNA聚合酶的活性。

2、變性溫度和時間在PCR反應(yīng)剛開始時，為保證作為模板的雙鏈DNA完全變性成單退火溫度與引物的Tm值相關(guān)，一般比Tm值低5~10℃。退火溫度設(shè)置過低，會導(dǎo)致非特異性擴增；退火溫度過高，則影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR效率。在退火時間里，引物與模板相結(jié)合，時間太短會使引物與模板未完全結(jié)合而導(dǎo)致無法延伸；時間過長容易產(chǎn)生引物在模板上的非特異性結(jié)合或形成引物二聚體。退火時間設(shè)置為30s基本上就足夠了。3、退火溫度和時間Tm值的計算一般的公式：Tm=4(G+C)+2(A+T)

退火溫度與引物的Tm值相關(guān)，一般比Tm值低5~10℃。3、退所用DNA聚合酶的最佳活性溫度決定了延伸溫度，如Taq聚合酶的最佳溫度為70～80度，所以延伸溫度設(shè)為72℃即可。在實踐中TaqDNA聚合酶的延伸效率約為500bp/30s，若待擴增的片段較長，可適當(dāng)延長時間，但時間過長又會致非特異性擴增。4、延伸溫度和時間所用DNA聚合酶的最佳活性溫度決定了延伸溫度，如Taq聚合酶在經(jīng)過一定的循環(huán)次數(shù)后，隨著聚合酶活性的降低，引物濃度降低等因素，PCR產(chǎn)物不再呈指數(shù)增加，此時稱為平臺效應(yīng)。循環(huán)次數(shù)設(shè)為25~30次，即可滿足一般的分子生物學(xué)實驗要求。過多的循環(huán)次數(shù)會導(dǎo)致堿基錯配增加和非特異性擴增的出現(xiàn)。5、循環(huán)次數(shù)在經(jīng)過一定的循環(huán)次數(shù)后，隨著聚合酶活性的降低，引物濃度降低等五、PCR引物設(shè)計

引物設(shè)計是PCR技術(shù)中至關(guān)重要的一環(huán)。使用不合適的PCR引物容易導(dǎo)致實驗失?。罕憩F(xiàn)為擴增出目的帶之外的多條帶（如形成引物二聚體帶），不出帶或出帶很弱，等等?，F(xiàn)在PCR引物設(shè)計大都通過計算機軟件進行?？梢灾苯犹峤荒０逍蛄械教囟ňW(wǎng)頁，得到設(shè)計好的引物，也可以在本地計算機上運行引物設(shè)計專業(yè)軟件。五、PCR引物設(shè)計引物設(shè)計是PCR技術(shù)中至關(guān)重引物設(shè)計的原則引物與模板的序列要緊密互補引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)引物不能在模板的非目的位點引發(fā)DNA聚合反應(yīng)(即錯配)引物設(shè)計的原則引物與模板的序列要緊密互補如引物長度（primerlength），產(chǎn)物長度（productlength），序列Tm值(meltingtemperature)，引物與模板形成雙鏈的內(nèi)部穩(wěn)定性(internalstability,用?G值反映)，形成引物二聚體(primerdimer)及發(fā)夾結(jié)構(gòu)（duplexformationandhairpin）的能值，在錯配位點（falseprimingsite）的引發(fā)效率，引物及產(chǎn)物的GC含量（composition），等等。必要時還需對引物進行修飾，如增加限制性內(nèi)切酶位點，引進突變等。具體因素如引物長度（primerlength），產(chǎn)物長度（prod一般原則引物的長度一般為15-30bp，常用的是18-24bp，但不應(yīng)大于38。引物過短又同時會引起錯配現(xiàn)象，一般來說引物長度大于16bp是必要的。例如：一個長度為12bp的引物在人類基因組上存在200個潛在的退火位點(3x109/412=200)。而一個長度為20bp的引物在人基因組上存在的退火位點只有1/400個。較長的引物（28-35bp)一般是用來區(qū)分同源性較高的模板序列或者使用于產(chǎn)生一些突變位點一般原則引物的長度一般為15-30bp，常用的是18-242.引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯配。引物3’端出現(xiàn)3個以上的連續(xù)堿基，如GGG或CCC，也會使錯誤引發(fā)機率增加。

2.引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有相似性較3，引物3’端的末位堿基對Taq酶的DNA合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯配位置導(dǎo)致不同的擴增效率，末位堿基為A的錯配效率明顯高于其他3個堿基，因此應(yīng)當(dāng)避免在引物的3’端使用堿基A。另外，引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR反應(yīng)失敗。5’端序列對PCR影響不太大，因此常用來引進修飾位點或標(biāo)記物。3，引物3’端的末位堿基對Taq酶的DNA4.引物序列的GC含量一般為40-60%，過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大。不同的算法推薦45-55%或50-60%4.引物序列的GC含量一般為40-65.?G值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對的相對穩(wěn)定性。應(yīng)當(dāng)選用3’端?G值較低（絕對值不超過9），而5’端和中間?G值相對較高的引物。引物的3’端的?G值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA聚合反應(yīng)。（能值越高越容易結(jié)合）5.?G值是指DNA雙鏈形成所需的6.對引物的修飾一般是在5’端增加酶切位點，應(yīng)根據(jù)下一步實驗中要插入PCR產(chǎn)物的載體的相應(yīng)序列而確定。

7.引物二級結(jié)構(gòu)對PCR反應(yīng)的影響。盡可能少的引物二聚體。

6.對引物的修飾一般是在5’端增加酶切常用的引物設(shè)計軟件Oligo6（引物評價）*PrimerPremier（自動搜索）*VectorNTISuitDnasisOmigaDnastarPrimer3（在線服務(wù)）*常用的引物設(shè)計軟件Oligo6（引物評價）*PrimerPremier5.0的使用技巧簡介主要功能:1、即引物設(shè)計2、限制性內(nèi)切酶位點分析3、DNA基元(motif)查找4、同源性分析PrimerPremier5.0的使用技巧簡介主要功能PrimerPremier5.0使用介紹(1)PreimerPremier啟動界面LoadsequencePrimerPremier5.0使用介紹(1)Preim基本信息SequencenameOriginalsequenceUsethesetwobuttontotranslatetheDNAseqtoaproteinseqoraproteinseqtoaDANseq8種密碼子偏好Chooseafunction基本信息SequencenameOriginalsequ引物設(shè)計界面FirstyoucandesigntheprimermanuallySensestrandoranti-sensestrandUsefulinformationoftheprimer引物設(shè)計界面Firstyoucandesignthe引物搜索選項設(shè)定引物類型搜索模式5’引物位置范圍3’引物位置范圍產(chǎn)物大小范圍引物長度引物搜索選項設(shè)定引物類型搜索模式5’引物位置范圍3’引物位置搜索結(jié)果28對引物引物分值100分為滿分每對引物的信息雙擊選中一對引物搜索結(jié)果28對引物引物分值每對引物的信息雙擊選中一對引物引物信息回到主窗口引物及產(chǎn)物信息是否出現(xiàn)hairpin,dimer,falseprimingandcrossdimer引物信息回到主窗口引物及產(chǎn)物信息是否出現(xiàn)hairpin,di一對理想的引物應(yīng)當(dāng)不存在任何一種上述結(jié)構(gòu)，因此最好的情況是最下面的分析欄沒有But…一對理想的引物應(yīng)當(dāng)不存在任何一種上述結(jié)構(gòu)，因此最好的情況是最引物編輯引物編輯EditprimerhereAnalysistheeditresultAccepttheeditresultReturntothemainwindowEditprimerhereAnalysistheeOligo6.44使用說明主要功能：專門的引物設(shè)計軟件Oligo6.44使用說明主要功能：專門的引物設(shè)計軟件Oligo6.44啟動界面OpensequencefileOligo6.44啟動界面Opensequencef3個彈出窗口Meltingtemperature3個彈出窗口Meltingtemperature?GInternalStability?GInternalStabilityFrq為鄰近6至7個堿基組成的亞單位在一個指定數(shù)據(jù)庫文件中的出現(xiàn)頻率。該頻率高則可增加錯誤引發(fā)的可能性。Frq為鄰近6至7個堿基組成的亞單位在一個指定數(shù)據(jù)庫文件中用Oligo設(shè)計引物時的3個標(biāo)準(zhǔn)Tm值曲線以選取5’到3’的下降形狀有利于引物引發(fā)聚合反應(yīng)。Frq曲線宜選用3’端Frq值相對較低的片段。ΔG值在5’端和中間值比較高，而在3’端相對低用Oligo設(shè)計引物時的3個標(biāo)準(zhǔn)Tm值曲線以選取5’到3第4章-PCR技術(shù)的應(yīng)用-課件選中引物上游引物下游引物只是示意圖選中引物上游引物下游引物只是示意圖引物分析首先檢查引物二聚體尤其是3’端二聚體形成的可能性；第二項檢查是發(fā)夾結(jié)構(gòu)（hairpin）；與二聚體相同，發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值越低越好；第三項檢查為GC含量，以45-55％為宜；第四項Falsepriming檢查。引物分析首先檢查引物二聚體尤其是3’端二聚體形成的可能性；引物分析KeyinformationofprimerHairpinDimerandcrossDimerGC%TotalPCRinformation引物分析KeyinformationofprimerHFinalPCRinformationFinalPCRinformationSearchforprimerusingOligo6.44SearchprimerSearchforprimerusingOligoOnlineprimer3service/Onlineprimer3servicehttp://

凝膠準(zhǔn)備①稱1g瓊脂糖置三角瓶中，加100ml1×TAE；②微波爐加熱大約2分鐘，熔化瓊脂糖；③熔化的瓊脂糖自然冷卻到60～70℃時，加入EB5μl，并輕輕混勻。膠床準(zhǔn)備①將梳子垂直插入到膠床的小凹槽內(nèi)，梳齒底端和床面有1mm的間隙；②將膠床放在調(diào)整好的水平臺上；鋪膠：將冷卻致60℃的凝膠倒入準(zhǔn)備好的膠床內(nèi)，凝膠厚度約5mm；室溫下靜置30分鐘左右，凝膠固化。將帶凝膠的膠床置于電泳槽中，并使樣品孔位于電場負(fù)極；六、PCR產(chǎn)物電泳鑒定凝膠準(zhǔn)備六、PCR產(chǎn)物電泳鑒定向電泳槽中加入1×TAE電泳緩沖液，越過凝膠表面即可；輕輕拔出固定在凝膠中的梳子；樣品準(zhǔn)備：向核酸樣品中加入約為樣品體積1/6的上樣緩沖液，用加樣器輕輕混勻上樣：用加樣器吸取樣品，輕輕的加入到凝膠的樣品孔中，加樣量為10μl蓋上電泳槽，接通電源，開始電泳；電泳條件：電壓80v；時間20～25分鐘；電泳結(jié)束后，切斷電源，取出凝膠；電泳結(jié)果分析：①紫外檢測儀直接觀察電泳條帶②攝影記錄向電泳槽中加入1×TAE電泳緩沖液，越過凝膠表面即可；瓊脂糖凝膠電泳預(yù)期結(jié)果：500bp560bp瓊脂糖凝膠電泳預(yù)期結(jié)果：500bp560bpPCR產(chǎn)物的直接測序：從瓊脂糖凝膠中回收PCR產(chǎn)物后測序。

PCR產(chǎn)物連接到載體后測序：從瓊脂糖凝膠中回收PCR產(chǎn)物，利用連接酶將PCR產(chǎn)物連接到載體如pGEM-T后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌提取質(zhì)粒后測序。美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司3130基因分析儀

24小時無人監(jiān)控操作儀器設(shè)置更方便更簡單新型自動灌膠系統(tǒng)進行灌膠檢測池加熱器改進了溫度控制通過96孔和384孔板自動進樣多色熒光檢測七、PCR產(chǎn)物測序鑒定PCR產(chǎn)物的直接測序：從瓊脂糖凝膠中回收PCR產(chǎn)物后測序。美觀看測序結(jié)果的軟件Chromas軟件運行界面打開一個測序結(jié)果峰型排列良好，無高大雜峰，說明測序結(jié)果可靠觀看測序結(jié)果的軟件Chromas軟件運行界面打開一個測序結(jié)果將測序結(jié)果輸出為文本文件將測序結(jié)果輸出為文本文件雖然現(xiàn)在的PCR技術(shù)使PCR擴增有很高的真實性，即PCR產(chǎn)物與模板DNA的一致性很高，但由于PCR擴增畢竟是在試管內(nèi)進行的DNA復(fù)制，沒有類似細(xì)胞內(nèi)DNA錯配修復(fù)機制，所以，在PCR產(chǎn)物擴增以后，仍要分析其與模板DNA的是否完全一致。最好的方法是將PCR產(chǎn)物測序，將測序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫作序列比對分析。八、目的基因序列變異分析雖然現(xiàn)在的PCR技術(shù)使PCR擴增有很高的真實性，即PCR產(chǎn)物/

/第4章-PCR技術(shù)的應(yīng)用-課件第4章-PCR技術(shù)的應(yīng)用-課件核酸序列比對/Blast.cgi

核酸序列比對http://blast.ncbi.nlm.niBLAST分析界面輸入測序結(jié)果BLAST分析界面輸入測序結(jié)果結(jié)果界面之一結(jié)果界面之一結(jié)果界面之二結(jié)果界面之二九、PCR污染的產(chǎn)生及防治九、PCR污染的產(chǎn)生及防治

PCR污染的監(jiān)測

PCR強大擴增能力+檢測的敏感性經(jīng)30個周期后，特定DNA片段的數(shù)量在理論上可增加109倍極微量的污染便可導(dǎo)致假陽性，尤其對定量造成很大的問題

NTC(NoTemplateControl):

必須設(shè)置一個不含模板DNA但含有PCR系統(tǒng)中所有其他成分的對照反應(yīng)，這一對照管須在準(zhǔn)備好所有其他PCR以后才進行吸加。

PCR污染的監(jiān)測常見的PCRcontamination常規(guī)PCR熒光定量PCRNTC432176598NTC常見的PCRcontamination常規(guī)PCRNTC4引起PCR污染的原因模板間交叉污染容器被污染模板放置時,由于密封不嚴(yán)溢于容器外容器外粘有模板而造成相互間交叉污染模板吸取過程中,因氣溶膠（aerosol）或其他原因引起移液器污染，從而導(dǎo)致交叉污染引起PCR污染的原因模板間交叉污染引起PCR污染的原因PCR試劑污染PCR試劑配制過程中,移液器、容器、水等原因造成試劑被PCR核酸模板污染。引起PCR污染的原因PCR試劑污染引起PCR污染的原因PCR產(chǎn)物污染-最主要最常見PCR產(chǎn)物拷貝量大，極微量的PCR產(chǎn)物污染,就可形成假陽性。移液器吸取PCR產(chǎn)物進行電泳檢測，同一支移液器去準(zhǔn)備PCRmixPCR產(chǎn)物的氣溶膠污染：一個氣溶膠顆?？赡芎瑤兹f個拷貝氣溶膠（aerosol）：懸浮于氣體介質(zhì)中粒徑一般為0.001μm~1000μm的固體、液體微小粒子形成的膠溶狀態(tài)散體系。

空氣與液體面摩擦?xí)r就可形成氣溶膠,在操作時比較劇烈地?fù)u動反應(yīng)管,開蓋時、吸樣時及移液器的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠引起PCR污染的原因PCR產(chǎn)物污染-最主要最常見氣溶膠（ae引起PCR污染的原因?qū)嶒炇抑锌寺≠|(zhì)粒的污染克隆質(zhì)粒濃度高,另外在純化過程中需用較多的用具及試劑,其污染可能性也很大引起PCR污染的原因?qū)嶒炇抑锌寺≠|(zhì)粒的污染防止PCR污染首要原則永遠(yuǎn)要設(shè)置NTC對照如果不能在污染出現(xiàn)的第一時間發(fā)現(xiàn)，會導(dǎo)致嚴(yán)重的后果：一大段時間的數(shù)據(jù)不可信準(zhǔn)備PCR的移液器要專用

千萬不能用吸取PCR產(chǎn)物/克隆質(zhì)粒的移液器去準(zhǔn)備PCR體系防止PCR污染首要原則防止PCR污染空間：合理分隔實驗區(qū)域:將樣品的處理、配制PCR反應(yīng)液、PCR循環(huán)擴增及PCR產(chǎn)物的鑒定等步驟分區(qū)進行，特別注意樣本處理及PCR產(chǎn)物的鑒定應(yīng)與其它步驟嚴(yán)格分開。理想狀態(tài)：各個區(qū)域?qū)嶒炗闷芳耙埔浩鲗Ｓ茫瑢嶒炃皯?yīng)將該區(qū)域用紫外線消毒，破壞殘留的DNA或RNA。防止PCR污染空間：防止PCR污染操作一旦進入吸加PCR試劑的專用場所并開始工作，就應(yīng)戴上一副新手套，并應(yīng)勤于更換。準(zhǔn)備專供自己使用的PCR試劑，分裝為小份。不要與樣品存放在一起。選擇質(zhì)量好的Eppendorf管--密封性好且開管不需要太大力氣。打開離心管前應(yīng)先離心，將管壁及管蓋上的液體甩至管底部。開管動作要輕，以防管內(nèi)液體濺出。實驗結(jié)束后及時清理臺面。防止PCR污染操作防止PCR污染移液器操作由于操作時不慎將模板吸入槍內(nèi)或粘上槍頭是一個嚴(yán)重的污染源，因而加樣時要十分小心。1）準(zhǔn)備PCR的移液器專用2）吸樣要慢，吸樣時盡量一次性完成，忌多次抽吸，切勿形成噴霧，以免交叉污染或產(chǎn)生氣溶膠污染。3）最好在加完所有其他反應(yīng)成分后才吸加模板。4）推薦在準(zhǔn)備PCR過程中使用濾芯槍頭防止PCR污染移液器操作出現(xiàn)污染后解決辦法更換試劑更換新的試劑和水，用確保無污染的移液器分裝備用清潔所有可能的污染源：實驗臺面、小離心機、冰箱門把手等等

1）實驗臺面、超凈工作臺用現(xiàn)配的3%雙氧水或10%次氯酸鈉溶液擦拭清潔。

2）或者用10%漂白粉溶液擦拭

3)紫外光照射，照射距離應(yīng)不超過90cm，照射時間最好過夜。實驗過程中更加小心，采用前面提到的各種防止污染的辦法出現(xiàn)污染后解決辦法更換試劑十、ColonyPCR十、ColonyPCRCloningCloningisthewayinwhichwecantakeasinglemolecule,andmakelotsofbacterialcellsthatcontainanidenticalmolecule.Thesecellsareclones,hencethenameThisusedtobetheonlywaytoamplifyDNA.Itisstillbyfarthemostaccurate.CloningCloningisthewayinw第4章-PCR技術(shù)的應(yīng)用-課件ImperfectscienceMostoftheplasmid/insertcombinationswillnotligateMostofthebacteriawillnotbetransformedWeonlyneedonemoleculetogetintoonebacteriumtomakeonecolonyImperfectscienceMostofthepPCRfromclonesOftencloneswillreligatecontaininganyoldDNA(egprimerdimers)..TheDNAcangoinineitherorientationWecanusethePCRtotellwhichcolonieshavetheinsertwewant,andwhichorientationitisin.PCRfromclonesOftencloneswiSite-mutationPCRSite-mutationPCR第4章-PCR技術(shù)的應(yīng)用-課件第4章-PCR技術(shù)的應(yīng)用-課件第4章-PCR技術(shù)的應(yīng)用-課件PrimerDesignGuidelinesBothmutagenicprimersmustcontainthedesiredmutationandannealtothesamesequenceonoppositestrandsoftheplasmid.Primersshouldbebetween25and45basesinlength,withameltingtemperature(Tm)of≥78°C.PrimerDesignGuidelinesBothm第4章-PCR技術(shù)的應(yīng)用-課件Thedesiredmutation(deletionorinsertion)shouldbeinthemiddleoftheprimerwith~10–15basesofcorrectsequenceonbothsides.TheprimersoptimallyshouldhaveaminimumGCcontentof40%andshouldterminateinoneormoreCorGbases.Thedesiredmutation(deletionPrimersneednotbe5′phosphorylatedbutmustbepurifiedeitherbyfastpolynucleotideliquidchromatography(FPLC)orbypolyacrylamidegelelectrophoresis(PAGE).Failuretopurifytheprimersresultsinasignificantdecreaseinmutationefficiency.Primersneednotbe5′phospho?Itisimportanttokeepprimerconcentrationinexcess.Stratagenesuggestsvaryingtheamountoftemplatewhilekeepingtheconcentrationoftheprimerconstantlyinexcess.?ItisimportanttokeepprimOverlapPCROverlapPCR第4章-PCR技術(shù)的應(yīng)用-課件GenesplicingandmutagenesisbyPCR-drivenoverlapextensionKarinLHeckman&LarryRPeaseNatureVol2:924-928GenesplicingandmutagenesisPCR技術(shù)的應(yīng)用PCR技術(shù)的應(yīng)用第4章-PCR技術(shù)的應(yīng)用-課件分子克隆操作的一般步驟：（1）獲得目的基因；（2）與克隆載體連接，形成新的重組DNA分子；（3）用重組DNA分子轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞，并能在受體細(xì)胞中復(fù)制和遺傳；（4）對轉(zhuǎn)化子篩選和鑒定；（5）對獲得外源基因的細(xì)胞或生物體通過培養(yǎng)，獲得所需的遺傳性狀或表達(dá)出所需要的產(chǎn)物。分子克隆操作的一般步驟：（1）獲得目的基因；一、概述

PCR：使用一對寡核苷酸引物，以目的序列為模板，利用DNA合成酶和四種脫氧核糖核酸進行DNA的體外合成反應(yīng)。

PCR技術(shù)具有靈敏度高，特異性高、操作方便和重復(fù)性好等特點，能夠在幾個小時內(nèi)獲得多達(dá)幾百萬拷貝的目的基因。該技術(shù)在上個世紀(jì)80年代中期由美國K.Mullis發(fā)明建立，經(jīng)過近二十年已發(fā)展成包括多種衍生技術(shù)，在很多領(lǐng)域中廣泛使用，K.Mullis也因此獲得1993年度的諾貝爾化學(xué)獎。一、概述PCR：使用一對寡核苷酸引物，以目的序列為模板，利二、PCR基本原理

DNA在細(xì)胞中的復(fù)制是一個復(fù)雜的酶促脫氧核糖核酸聚合過程，是DNA聚合酶、DNA連接酶、引發(fā)酶、RNA引物、四種脫氧核糖核酸、DNA超螺旋酶、離子環(huán)境等多成份參與的過程。

PCR是在試管內(nèi)使用最基本的成份模擬了細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制，所以在一個PCR中必需成分是

1.模板DNA2.DNA聚合酶

3.四種脫氧核糖核酸

4.正向和反向兩條引物

5.適當(dāng)?shù)木彌_體系。二、PCR基本原理DNA在細(xì)胞中的復(fù)制是一個復(fù)雜的酶促脫氧模板序列：待擴增的DNA序列，一般為雙鏈的DNA可包括線形雙螺旋DNA，如基因組DNA，及閉環(huán)雙鏈DNA，如質(zhì)粒；模板的來源很廣，如從細(xì)胞/細(xì)菌中提取基因組DNA、提取mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA、質(zhì)粒、病毒等；每個反應(yīng)中模板的量為1ng～1μg。質(zhì)粒DNA和純化的DNA的量可少一些，而基因組DNA的量應(yīng)多一些。PCR靈敏度很高，所以在操作中注意避免非目的基因序列的污染，否則會導(dǎo)致PCR的非特異性擴增。1、模板DNA模板序列：待擴增的DNA序列，一般為雙鏈的DNA可包括線形雙引物（primer）也稱為寡核苷酸引物，常規(guī)的PCR反應(yīng)需要兩種引物，分別成為5′端引物和3’端引物，或稱為正向引物和反向引物。通常DNA及mRNA序列的寫法為5′→3′，所以5′端引物與目的序列的5′末端序列相同，而3′端引物與目的序列的3′末端序列反向互補。2、引物它們作為DNA擴增的起始部分，能限定待擴增DNA序列的長度。為了保證擴增的特異性和有效性，引物與模板相匹配部分應(yīng)至少有15～18bp。5′5′3′3′5′5′3′3′上游引物下游引物引物（primer）也稱為寡核苷酸引物，常規(guī)的PCR反應(yīng)需要DNA聚合酶：以DNA為模板，以脫氧核糖核酸為底物催化合成新的DNA的一種酶。早期的PCR反應(yīng)使用的DNA聚合酶為大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段。但該酶在高溫下容易失活，需要在每次合成反應(yīng)進行時候再加入一份酶。隨著新的耐熱DNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)及在PCR反應(yīng)中的應(yīng)用，使PCR操作更方便，產(chǎn)量更穩(wěn)定。目前商品化的DNA聚合酶有TaqDNA聚合酶和PfuDNA聚合酶。TaqDNA聚合酶最適工作溫度為75-80℃。該酶具有5′→3′聚合酶活性，在鎂離子存在情況下可催化核苷酸沿5′→3′方向發(fā)生聚合反應(yīng)。3、DNA聚合酶DNA聚合酶：以DNA為模板，以脫氧核糖核酸為底物催化合成新4、脫氧核糖核酸四種脫氧核苷三磷酸即dATP、dTTP、dCTP和dGTP，為PCR反應(yīng)中DNA合成原料。在新的一個反應(yīng)體系中，這四種脫氧核糖核酸的起始濃度應(yīng)該都相等，如果其中一種的濃度明顯不同于其他的就會誘發(fā)錯配，并降低新鏈合成速度。4、脫氧核糖核酸四種脫氧核苷三磷酸即dATP、dTTP、dC緩沖液提供PCR反應(yīng)所必需的合適酸堿度與離子環(huán)境。主要成分有KCl、Tris-Cl和MgCl2。其中Mg2＋的濃度最重要，它能影響DNA聚合酶的活性，以及模板與PCR產(chǎn)物的解鏈溫度。5、緩沖液緩沖液提供PCR反應(yīng)所必需的合適酸堿度與離子環(huán)境。主要成分有變性：是指模板的熱變性，雙螺旋模版DNA成為單鏈的DNA分子；在應(yīng)用TaqDNA聚合酶進行PCR反應(yīng)時，變性往往在94℃～95℃條件下進行。這也是TaqDNA聚合酶進行30個左右的PCR循環(huán)而活力不致受到過多損失時所能耐受的最適溫度。退火：是指引物和模板在局部形成互補的雜交鏈的過程。退火溫度比兩條寡核苷酸引物的熔解溫度低5～10℃，PCR實驗要對退火溫度進行優(yōu)化。三、PCR基本步驟變性：是指模板的熱變性，雙螺旋模版DNA成為單鏈的DNA分子延伸：在鎂離子存在條件下，DNA聚合酶按堿基互補原則，催化四種脫氧核糖核酸加在引物的3′端，使引物沿5′→3′方向生成與模版DNA互補的新DNA鏈。雙鏈模版DNA變性退火5′3′5′3′5′5′3′3′5′5′3′3′5′5′3′3′上游引物下游引物延伸3′5′5′3′3′5′5′3′多次循環(huán)（2n拷貝）延伸：在鎂離子存在條件下，DNA聚合酶按堿基互補原則，催化四下面為一個典型的PCR循環(huán)參數(shù)設(shè)置：備注：*比兩條引物的Tm值低5~10℃。94℃5min94℃30sX℃*30s72℃1kb/min72℃5min25-35個循環(huán)下面為一個典型的PCR循環(huán)參數(shù)設(shè)置：備注：*比兩條引物的T四、影響PCR因素

雖然PCR操作很方便，但影響因素也很多，從而影響PCR的特異性和高效性。引物變性溫度和時間退火溫度和時間延伸溫度和時間循環(huán)次數(shù)四、影響PCR因素雖然PCR操作很方便，但影響因素也很多，引物決定了PCR產(chǎn)物的長度和特異性。引物的設(shè)計要求請看本實驗講義“引物設(shè)計”部分。1、引物引物決定了PCR產(chǎn)物的長度和特異性。1、引物在PCR反應(yīng)剛開始時，為保證作為模板的雙鏈DNA完全變性成單鏈DNA，一般設(shè)為95℃、5min；在隨后的循環(huán)中，可設(shè)為95℃、30s。有些模板DNA的G+C含量較高，變性溫度就越高。太高的變性溫度和太長的變性時間會影響DNA聚合酶的活性。

2、變性溫度和時間在PCR反應(yīng)剛開始時，為保證作為模板的雙鏈DNA完全變性成單退火溫度與引物的Tm值相關(guān)，一般比Tm值低5~10℃。退火溫度設(shè)置過低，會導(dǎo)致非特異性擴增；退火溫度過高，則影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR效率。在退火時間里，引物與模板相結(jié)合，時間太短會使引物與模板未完全結(jié)合而導(dǎo)致無法延伸；時間過長容易產(chǎn)生引物在模板上的非特異性結(jié)合或形成引物二聚體。退火時間設(shè)置為30s基本上就足夠了。3、退火溫度和時間Tm值的計算一般的公式：Tm=4(G+C)+2(A+T)

退火溫度與引物的Tm值相關(guān)，一般比Tm值低5~10℃。3、退所用DNA聚合酶的最佳活性溫度決定了延伸溫度，如Taq聚合酶的最佳溫度為70～80度，所以延伸溫度設(shè)為72℃即可。在實踐中TaqDNA聚合酶的延伸效率約為500bp/30s，若待擴增的片段較長，可適當(dāng)延長時間，但時間過長又會致非特異性擴增。4、延伸溫度和時間所用DNA聚合酶的最佳活性溫度決定了延伸溫度，如Taq聚合酶在經(jīng)過一定的循環(huán)次數(shù)后，隨著聚合酶活性的降低，引物濃度降低等因素，PCR產(chǎn)物不再呈指數(shù)增加，此時稱為平臺效應(yīng)。循環(huán)次數(shù)設(shè)為25~30次，即可滿足一般的分子生物學(xué)實驗要求。過多的循環(huán)次數(shù)會導(dǎo)致堿基錯配增加和非特異性擴增的出現(xiàn)。5、循環(huán)次數(shù)在經(jīng)過一定的循環(huán)次數(shù)后，隨著聚合酶活性的降低，引物濃度降低等五、PCR引物設(shè)計

引物設(shè)計是PCR技術(shù)中至關(guān)重要的一環(huán)。使用不合適的PCR引物容易導(dǎo)致實驗失?。罕憩F(xiàn)為擴增出目的帶之外的多條帶（如形成引物二聚體帶），不出帶或出帶很弱，等等?，F(xiàn)在PCR引物設(shè)計大都通過計算機軟件進行?？梢灾苯犹峤荒０逍蛄械教囟ňW(wǎng)頁，得到設(shè)計好的引物，也可以在本地計算機上運行引物設(shè)計專業(yè)軟件。五、PCR引物設(shè)計引物設(shè)計是PCR技術(shù)中至關(guān)重引物設(shè)計的原則引物與模板的序列要緊密互補引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)引物不能在模板的非目的位點引發(fā)DNA聚合反應(yīng)(即錯配)引物設(shè)計的原則引物與模板的序列要緊密互補如引物長度（primerlength），產(chǎn)物長度（productlength），序列Tm值(meltingtemperature)，引物與模板形成雙鏈的內(nèi)部穩(wěn)定性(internalstability,用?G值反映)，形成引物二聚體(primerdimer)及發(fā)夾結(jié)構(gòu)（duplexformationandhairpin）的能值，在錯配位點（falseprimingsite）的引發(fā)效率，引物及產(chǎn)物的GC含量（composition），等等。必要時還需對引物進行修飾，如增加限制性內(nèi)切酶位點，引進突變等。具體因素如引物長度（primerlength），產(chǎn)物長度（prod一般原則引物的長度一般為15-30bp，常用的是18-24bp，但不應(yīng)大于38。引物過短又同時會引起錯配現(xiàn)象，一般來說引物長度大于16bp是必要的。例如：一個長度為12bp的引物在人類基因組上存在200個潛在的退火位點(3x109/412=200)。而一個長度為20bp的引物在人基因組上存在的退火位點只有1/400個。較長的引物（28-35bp)一般是用來區(qū)分同源性較高的模板序列或者使用于產(chǎn)生一些突變位點一般原則引物的長度一般為15-30bp，常用的是18-242.引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯配。引物3’端出現(xiàn)3個以上的連續(xù)堿基，如GGG或CCC，也會使錯誤引發(fā)機率增加。

2.引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有相似性較3，引物3’端的末位堿基對Taq酶的DNA合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯配位置導(dǎo)致不同的擴增效率，末位堿基為A的錯配效率明顯高于其他3個堿基，因此應(yīng)當(dāng)避免在引物的3’端使用堿基A。另外，引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR反應(yīng)失敗。5’端序列對PCR影響不太大，因此常用來引進修飾位點或標(biāo)記物。3，引物3’端的末位堿基對Taq酶的DNA4.引物序列的GC含量一般為40-60%，過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大。不同的算法推薦45-55%或50-60%4.引物序列的GC含量一般為40-65.?G值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對的相對穩(wěn)定性。應(yīng)當(dāng)選用3’端?G值較低（絕對值不超過9），而5’端和中間?G值相對較高的引物。引物的3’端的?G值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA聚合反應(yīng)。（能值越高越容易結(jié)合）5.?G值是指DNA雙鏈形成所需的6.對引物的修飾一般是在5’端增加酶切位點，應(yīng)根據(jù)下一步實驗中要插入PCR產(chǎn)物的載體的相應(yīng)序列而確定。

7.引物二級結(jié)構(gòu)對PCR反應(yīng)的影響。盡可能少的引物二聚體。

6.對引物的修飾一般是在5’端增加酶切常用的引物設(shè)計軟件Oligo6（引物評價）*PrimerPremier（自動搜索）*VectorNTISuitDnasisOmigaDnastarPrimer3（在線服務(wù)）*常用的引物設(shè)計軟件Oligo6（引物評價）*PrimerPremier5.0的使用技巧簡介主要功能:1、即引物設(shè)計2、限制性內(nèi)切酶位點分析3、DNA基元(motif)查找4、同源性分析PrimerPremier5.0的使用技巧簡介主要功能PrimerPremier5.0使用介紹(1)PreimerPremier啟動界面LoadsequencePrimerPremier5.0使用介紹(1)Preim基本信息SequencenameOriginalsequenceUsethesetwobuttontotranslatetheDNAseqtoaproteinseqoraproteinseqtoaDANseq8種密碼子偏好Chooseafunction基本信息SequencenameOriginalsequ引物設(shè)計界面FirstyoucandesigntheprimermanuallySensestrandoranti-sensestrandUsefulinformationoftheprimer引物設(shè)計界面Firstyoucandesignthe引物搜索選項設(shè)定引物類型搜索模式5’引物位置范圍3’引物位置范圍產(chǎn)物大小范圍引物長度引物搜索選項設(shè)定引物類型搜索模式5’引物位置范圍3’引物位置搜索結(jié)果28對引物引物分值100分為滿分每對引物的信息雙擊選中一對引物搜索結(jié)果28對引物引物分值每對引物的信息雙擊選中一對引物引物信息回到主窗口引物及產(chǎn)物信息是否出現(xiàn)hairpin,dimer,falseprimingandcrossdimer引物信息回到主窗口引物及產(chǎn)物信息是否出現(xiàn)hairpin,di一對理想的引物應(yīng)當(dāng)不存在任何一種上述結(jié)構(gòu)，因此最好的情況是最下面的分析欄沒有But…一對理想的引物應(yīng)當(dāng)不存在任何一種上述結(jié)構(gòu)，因此最好的情況是最引物編輯引物編輯EditprimerhereAnalysistheeditresultAccepttheeditresultReturntothemainwindowEditprimerhereAnalysistheeOligo6.44使用說明主要功能：專門的引物設(shè)計軟件Oligo6.44使用說明主要功能：專門的引物設(shè)計軟件Oligo6.44啟動界面OpensequencefileOligo6.44啟動界面Opensequencef3個彈出窗口Meltingtemperature3個彈出窗口Meltingtemperature?GInternalStability?GInternalStabilityFrq為鄰近6至7個堿基組成的亞單位在一個指定數(shù)據(jù)庫文件中的出現(xiàn)頻率。該頻率高則可增加錯誤引發(fā)的可能性。Frq為鄰近6至7個堿基組成的亞單位在一個指定數(shù)據(jù)庫文件中用Oligo設(shè)計引物時的3個標(biāo)準(zhǔn)Tm值曲線以選取5’到3’的下降形狀有利于引物引發(fā)聚合反應(yīng)。Frq曲線宜選用3’端Frq值相對較低的片段。ΔG值在5’端和中間值比較高，而在3’端相對低用Oligo設(shè)計引物時的3個標(biāo)準(zhǔn)Tm值曲線以選取5’到3第4章-PCR技術(shù)的應(yīng)用-課件選中引物上游引物下游引物只是示意圖選中引物上游引物下游引物只是示意圖引物分析首先檢查引物二聚體尤其是3’端二聚體形成的可能性；第二項檢查是發(fā)夾結(jié)構(gòu)（hairpin）；與二聚體相同，發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值越低越好；第三項檢查為GC含量，以45-55％為宜；第四項Falsepriming檢查。引物分析首先檢查引物二聚體尤其是3’端二聚體形成的可能性；引物分析KeyinformationofprimerHairpinDimerandcrossDimerGC%TotalPCRinformation引物分析KeyinformationofprimerHFinalPCRinformationFinalPCRinformationSearchforprimerusingOligo6.44SearchprimerSearchforprimerusingOligoOnlineprimer3service/Onlineprimer3servicehttp://

凝膠準(zhǔn)備①稱1g瓊脂糖置三角瓶中，加100ml1×TAE；②微波爐加熱大約2分鐘，熔化瓊脂糖；③熔化的瓊脂糖自然冷卻到60～70℃時，加入EB5μl，并輕輕混勻。膠床準(zhǔn)備①將梳子垂直插入到膠床的小凹槽內(nèi)，梳齒底端和床面有1mm的間隙；②將膠床放在調(diào)整好的水平臺上；鋪膠：將冷卻致60℃的凝膠倒入準(zhǔn)備好的膠床內(nèi)，凝膠厚度約5mm；室溫下靜置30分鐘左右，凝膠固化。將帶凝膠的膠床置于電泳槽中，并使樣品孔位于電場負(fù)極；六、PCR產(chǎn)物電泳鑒定凝膠準(zhǔn)備六、PCR產(chǎn)物電泳鑒定向電泳槽中加入1×TAE電泳緩沖液，越過凝膠表面即可；輕輕拔出固定在凝膠中的梳子；樣品準(zhǔn)備：向核酸樣品中加入約為樣品體積1/6的上樣緩沖液，用加樣器輕輕混勻上樣：用加樣器吸取樣品，輕輕的加入到凝膠的樣品孔中，加樣量為10μl蓋上電泳槽，接通電源，開始電泳；電泳條件：電壓80v；時間20～25分鐘；電泳結(jié)束后，切斷電源，取出凝膠；電泳結(jié)果分析：①紫外檢測儀直接觀察電泳條帶②攝影記錄向電泳槽中加入1×TAE電泳緩沖液，越過凝膠表面即可；瓊脂糖凝膠電泳預(yù)期結(jié)果：500bp560bp瓊脂糖凝膠電泳預(yù)期結(jié)果：500bp560bpPCR產(chǎn)物的直接測序：從瓊脂糖凝膠中回收PCR產(chǎn)物后測序。

PCR產(chǎn)物連接到載體后測序：從瓊脂糖凝膠中回收PCR產(chǎn)物，利用連接酶將PCR產(chǎn)物連接到載體如pGEM-T后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌提取質(zhì)粒后測序。美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司3130基因分析儀

24小時無人監(jiān)控操作儀器設(shè)置更方便更簡單新型自動灌膠系統(tǒng)進行灌膠檢測池加熱器改進了溫度控制通過96孔和384孔板自動進樣多色熒光檢測七、PCR產(chǎn)物測序鑒定PCR產(chǎn)物的直接測序：從瓊脂糖凝膠中回收PCR產(chǎn)物后測序。美觀看測序結(jié)果的軟件Chromas軟件運行界面打開一個測序結(jié)果峰型排列良好，無高大雜峰，說明測序結(jié)果可靠觀看測序結(jié)果的軟件Chromas軟件運行界面打開一個測序結(jié)果將測序結(jié)果輸出為文本文件將測序結(jié)果輸出為文本文件雖然現(xiàn)在的PCR技術(shù)使PCR擴增有很高的真實性，即PCR產(chǎn)物與模板DNA的一致性很高，但由于PCR擴增畢竟是在試管內(nèi)進行的DNA復(fù)制，沒有類似細(xì)胞內(nèi)DNA錯配修復(fù)機制，所以，在PCR產(chǎn)物擴增以后，仍要分析其與模板DNA的是否完全一致。最好的方法是將PCR產(chǎn)物測序，將測序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫作序列比對分析。八、目的基因序列變異分析雖然現(xiàn)在的PCR技術(shù)使PCR擴增有很高的真實性，即PCR產(chǎn)物/

/第4章-PCR技術(shù)的應(yīng)用-課件第4章-PCR技術(shù)的應(yīng)用-課件核酸序列比對/Blast.cgi

核酸序列比對http://blast.ncbi.nlm.niBLAST分析界面輸入測序結(jié)果BLAST分析界面輸入測序結(jié)果結(jié)果界面之一結(jié)果界面之一結(jié)果界面之二結(jié)果界面之二九、PCR污染的產(chǎn)生及防治九、PCR污染的產(chǎn)生及防治

PCR污染的監(jiān)測

PCR強大擴增能力+檢測的敏感性經(jīng)30個周期后，特定DNA片段的數(shù)量在理論上可增加109倍極微量的污染便可導(dǎo)致假陽性，尤其對定量造成很大的問題

NTC(NoTemplateControl):

必須設(shè)置一個不含模板DNA但含有PCR系統(tǒng)中所有其他成分的對照反應(yīng)，這一對照管須在準(zhǔn)備好所有其他PCR以后才進行吸加。

PCR污染的監(jiān)測常見的PCRcontamination常規(guī)PCR熒光定量PCRNTC432176598NTC常見的PCRcontamination常規(guī)PCRNTC4引起PCR污染的原因模板間交叉污染容器被污染模板放置時,由于密封不嚴(yán)溢于容器外容器外粘有模板而造成相互間交叉污染模板吸取過程中,因氣溶膠（aerosol）或其他原因引起移液器污染，從而導(dǎo)致交叉污染引起PCR污染的原因模板間交叉污染引起PCR污染的原因PCR試劑污染PCR試劑配制過程中,移液器、容器、水等原因造成試劑被PCR核酸模板污染。引起PCR污染的原因PCR試劑污染引起PCR污染的原因PCR產(chǎn)物污染-最主要最常見PCR產(chǎn)物拷貝量大，極微量的PCR產(chǎn)物污染,就可形成假陽性。移液器吸取PCR產(chǎn)物進行電泳檢測，同一支移液器去準(zhǔn)備PCRmixPCR產(chǎn)物的氣溶膠污染：一個氣溶膠顆?？赡芎瑤兹f個拷貝氣溶膠（aerosol）：懸浮于氣體介質(zhì)中粒徑一般為0.001μm~1000μm的固體、液體微小粒子形成的膠溶狀態(tài)散體系。

空氣與液體面摩擦?xí)r就可形成氣溶膠,在操作時比較劇烈地?fù)u動反應(yīng)管,開蓋時、吸樣時及移液器的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠引起PCR污染的原因PCR產(chǎn)物污染-最主要最常見氣溶膠（ae引起PCR污染的原因?qū)嶒炇抑锌寺≠|(zhì)粒的污染克隆質(zhì)粒濃度高,另外在純化過程中需用較多的用具及試劑,其污染可能性也很大引起PCR污染的原因?qū)嶒炇抑锌寺≠|(zhì)粒的污染防止PCR污染首要原則永遠(yuǎn)要設(shè)置NTC對照如果不能在污染出現(xiàn)的第一時間發(fā)現(xiàn)，會導(dǎo)致嚴(yán)重的后果：一大段時間的數(shù)據(jù)不可信準(zhǔn)備PCR的移液器要專用

千萬不能用吸取PCR產(chǎn)物/克隆質(zhì)粒的移液器去準(zhǔn)備PCR體系防止PCR污染首要原則防止PCR污染空間：合理分隔實驗區(qū)域:將樣品的處理、配制PCR反應(yīng)液、PCR循環(huán)擴增及PCR產(chǎn)物的鑒定等步驟分區(qū)進行，特別注意樣本處理及PCR產(chǎn)物的鑒定應(yīng)與其它步驟嚴(yán)格分開。理想狀態(tài)：各個區(qū)域?qū)嶒炗闷芳耙埔浩鲗Ｓ?，實驗前?yīng)將該區(qū)域用紫外線消毒，破壞殘留的DNA或RNA。防止PCR污染空間：防止PCR污染操作一旦進入吸加PCR試劑的專用場所并開始工作，就應(yīng)戴上一副新手套，并應(yīng)勤于更換。準(zhǔn)備專供自己使用的PCR試劑，分裝為小份。不要與樣品存放在一起。選擇質(zhì)量好的Eppendorf管--密封性好且開管不需要太大力氣。打開離心管前應(yīng)先離心，將管壁及管蓋上的液體甩至管底部。開管動作要輕，以防管內(nèi)液體濺出。實驗結(jié)束后及時清理臺面。防止PCR污