分子熒光分析方法教材課件

分子熒光分析方法制作人：楊文麗分子熒光分析方法制作人：楊文麗1第一節(jié)概述一、分子熒光的定義及發(fā)展二、分子熒光的特點(diǎn)及應(yīng)用三、分子熒光與紫外—可見分光光度法的異同第一節(jié)概述一、分子熒光的定義及發(fā)展2第二節(jié)分子熒光法的基本原理一、熒光的產(chǎn)生二、激發(fā)光譜和熒光光譜三、熒光與物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)第二節(jié)分子熒光法的基本原理一、熒光的產(chǎn)生3

已經(jīng)知道，熒光是在一定波長光照射下，某些分子受到激發(fā)后發(fā)出光量子所致。對一種特定的分子來說：哪些波長光使之激發(fā)產(chǎn)生熒光？哪個(gè)波長激發(fā)后所產(chǎn)生的熒光最強(qiáng)？——激發(fā)光譜一定波長的激發(fā)光使其產(chǎn)生的熒光哪個(gè)波長下最強(qiáng)？——熒光光譜可由實(shí)驗(yàn)測定物質(zhì)分子的激發(fā)光譜與熒光光譜來說明。已經(jīng)知道，熒光是在一定波長光照射下，4激發(fā)光譜與熒光（發(fā)射）光譜一、熒光的檢測光源發(fā)出的紫外可見光通過激發(fā)單色器分出不同波長的激發(fā)光，照射到樣品溶液上，激發(fā)樣品產(chǎn)生熒光。樣品發(fā)出的熒光為寬帶光譜，需通過發(fā)射單色器分光后再進(jìn)入檢測器，檢測不同發(fā)射波長下的熒光強(qiáng)度F。由于激發(fā)光不可能完全被吸收，可透過溶液，為了防止透射光對熒光測定的干擾，常在與激發(fā)光垂直的方向檢測熒光（因熒光是向各個(gè)方向發(fā)射的）。

吸收池光源檢測器單色器信號(hào)顯示系統(tǒng)單色器激發(fā)光譜與熒光（發(fā)射）光譜一、熒光的檢測吸收池光源檢測器單色5熒光激發(fā)光譜與熒光（發(fā)射）光譜1.激發(fā)光譜excitationspectrum：將激發(fā)熒光的光源用單色器分光，連續(xù)改變激發(fā)光波長，固定熒光發(fā)射波長，測定不同波長激發(fā)光下物質(zhì)溶液發(fā)射的熒光強(qiáng)度(F)，作F—λ光譜圖稱激發(fā)光譜。從激發(fā)光譜圖上可找到發(fā)生熒光強(qiáng)度最強(qiáng)的激發(fā)波長λex，選用λex可得到強(qiáng)度最大的熒光。二、激發(fā)光譜和熒光光譜

熒光激發(fā)光譜與熒光（發(fā)射）光譜1.激發(fā)光譜excitatio6熒光激發(fā)光譜與熒光（發(fā)射）光譜2.熒光光譜fluorescencespectrum：選擇λex作激發(fā)光源，用另一單色器將物質(zhì)發(fā)射（發(fā)射光譜）的熒光分光，記錄每一波長下的F，作F-λ光譜圖稱為熒光光譜。熒光光譜中熒光強(qiáng)度最強(qiáng)的波長為λem。

λex

與λem一般為定量分析中所選用的最靈敏的波長。熒光激發(fā)光譜與熒光（發(fā)射）光譜2.熒光光譜fluoresc7分子熒光分析方法教材課件8激發(fā)光譜:固定測量波長(選最大發(fā)射波長),化合物發(fā)射的熒光(磷光)強(qiáng)度與照射光波長的關(guān)系曲線（圖中曲線I）

激發(fā)光譜形狀與吸收光譜形狀完全相似，經(jīng)校正后二者完全相同！發(fā)射光譜：固定激發(fā)光波長(選最大激發(fā)波長),化合物發(fā)射的熒光(或磷光強(qiáng)度)與發(fā)射光波長關(guān)系曲線(圖中曲線II或III)。激發(fā)光譜:固定測量波長(選最大發(fā)射波長),化合物發(fā)射的熒光(9熒光激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的特征a.Stokes位移—熒光波長比激發(fā)光譜的波長較長在溶液中，分子熒光的發(fā)射相對于吸收位移到較長的波長，稱為Stokes位移。這是由于受激分子通過振動(dòng)弛豫而失去轉(zhuǎn)動(dòng)能，也由于溶液中溶劑分子與受激分子的碰撞，也會(huì)有能量的損失。因此，在激發(fā)和發(fā)射之間產(chǎn)生了能量損失。b.發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān)分子被激發(fā)到高于S1的電子態(tài)的更高振動(dòng)能級(jí)，然而由于內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動(dòng)弛豫的速率很快，很快損失多余的能量而衰變到S1電子態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)盡管分子受激到達(dá)不同能級(jí)的激發(fā)態(tài)，不管激發(fā)波長如何，電子都是從第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能層躍遷到基態(tài)的各個(gè)振動(dòng)能層，而與熒光體被激發(fā)至哪一個(gè)電子態(tài)無關(guān)。無論激發(fā)波長是λ1還是λ2，熒光的波長都是λ?2激發(fā)光譜的形狀與發(fā)射波長也無關(guān)熒光激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的特征a.Stokes位移—熒光波長比10ex=290nm(MAX)固定em=620nm(MAX)固定ex=290nm(MAX)em=620nm(MAX)S04321S143211→

41→

31→

21→11

→41

→41

→21

→1c.

鏡像規(guī)則

通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜（與激發(fā)光譜形狀一樣）成鏡像對稱關(guān)系。

基態(tài)上的各振動(dòng)能級(jí)分布與第一激發(fā)態(tài)上的各振動(dòng)能級(jí)分布類似；基態(tài)上的零振動(dòng)能級(jí)與第一激發(fā)態(tài)的各振動(dòng)能級(jí)之間的躍遷和反躍遷幾率相等ex=290nm(MAX)固定em=620nm(MA11200250300350400450500熒光激發(fā)光譜熒光發(fā)射光譜nm蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜200250300350400450500熒光激發(fā)光譜熒光發(fā)12

熒光光譜與激發(fā)光譜形狀極為相似，且二者成鏡像對稱熒光光譜與激發(fā)光譜形狀極為相似，且二者成鏡像對稱13激光光譜與熒光光譜的應(yīng)用1、定性分析將熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜和熒光光譜圖的形狀、位置與標(biāo)準(zhǔn)溶液的光譜圖進(jìn)行比較。跟紫外可見吸收光譜法相比，因參照圖更多，可靠性更好。2、定量分析根據(jù)熒光光譜中最大激發(fā)波長λex和最大熒光波長λem，可得到定量分析的最佳條件。激光光譜與熒光光譜的應(yīng)用1、定性分析14熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系分子熒光產(chǎn)生的必備條件分子必須能夠吸收激發(fā)光分子必須具有一定的熒光量子產(chǎn)率影響因素：熒光產(chǎn)生過程中，輻射和無輻射過程；與每一過程的速率常數(shù)有關(guān)；kf

分子結(jié)構(gòu)決定（內(nèi)因）；主要取決于化學(xué)結(jié)構(gòu)和化學(xué)環(huán)境和結(jié)構(gòu)共同決定。熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系分子熒光產(chǎn)生的必備條件分子必須能夠吸收激15n振動(dòng)弛豫激發(fā)

n熒光（1）躍遷類型：具有電子躍遷類型的結(jié)構(gòu)

躍遷是產(chǎn)生熒光的主要躍遷類型特點(diǎn)：較大的摩爾吸光系數(shù)較短的激發(fā)態(tài)壽命10-7~10-9s串越至三重態(tài)幾率小振動(dòng)弛豫激發(fā)熒光（1）躍遷類型：具有16（2）具有大的共軛π鍵結(jié)構(gòu)共軛度越大，熒光越強(qiáng)。原因：共軛體系越大，離域大π鍵的電子越容易激發(fā)，熒光與磷光越容易產(chǎn)生?；衔锉捷凛於∈∥焓ˇ薳xmax(nm)205286365390580λemmax

(nm)278321400480640F0.110.290.460.600.52苯萘蒽丁省戊省苯萘蒽丁省戊省（2）具有大的共軛π鍵結(jié)構(gòu)共軛度越大，熒光越強(qiáng)。化合物苯萘蒽17（3）具在剛性平面結(jié)構(gòu)

0.9210.18（3）具在剛性平面結(jié)構(gòu)0.9210.18181）給電子取代劑加強(qiáng)熒光（4）取代基效應(yīng)—HN2，—NHR，—NR2，—OH，—OR，—CN產(chǎn)生p→π共軛二苯甲酮：弱熒光、強(qiáng)磷光S1→T1的系間竄躍產(chǎn)率接近1化合物苯苯酚苯胺苯基氰苯甲醚λemmax(nm)278~310285~365310~405280~390285~345相對熒光強(qiáng)度10182020202）吸電子取代基減弱熒光、加強(qiáng)磷光—C=0，—COOH，—NO2不產(chǎn)生p→π共軛硝基苯：不產(chǎn)生熒光、弱磷光1）給電子取代劑加強(qiáng)熒光（4）取代基效應(yīng)—HN2，—NH19空間位阻對熒光發(fā)射的影響3）取代基的位置反式二苯乙烯強(qiáng)熒光物質(zhì)F=0.75F=0.03立體異構(gòu)體對熒光發(fā)射的影響順式二苯乙烯非熒光物質(zhì)空間位阻對熒光發(fā)射的影響3）取代基的位置反式二苯乙烯F=020含有重原子的溶劑，由于重原子效應(yīng)熒光減弱、磷光增強(qiáng)。（5）重原子取代基效應(yīng)—Cl，—Br，—IS1→T1的系間竄躍由于重原子的存在增強(qiáng)含有重原子的溶劑，由于重原子效應(yīng)熒光減弱、磷光增強(qiáng)。（5）重21分子熒光分析方法教材課件22思考題：一、什么是分子發(fā)光？分子發(fā)光有哪幾類？二、分子熒光或磷光是如何產(chǎn)生的？三、什么是熒光激發(fā)光譜？什么是熒光發(fā)射光譜？各有何特點(diǎn)和作用？四、為什么熒光發(fā)射光譜與激發(fā)光波長無關(guān)？五、何謂Stokes位移？Stokes位移是如何產(chǎn)生的？六、分子產(chǎn)生熒光的必備條件是什么？七、分子熒光光譜儀由哪幾部分組成？各部分功能如何？與UV-Vis有何不同？九、分子熒光光譜儀的激發(fā)和發(fā)射光路為何設(shè)計(jì)呈直角？思考題：23謝謝觀賞！小組成員：201124005楊文麗201124010張南煬201124012尹偉謝謝觀賞！小組成員：24分子熒光分析方法制作人：楊文麗分子熒光分析方法制作人：楊文麗25第一節(jié)概述一、分子熒光的定義及發(fā)展二、分子熒光的特點(diǎn)及應(yīng)用三、分子熒光與紫外—可見分光光度法的異同第一節(jié)概述一、分子熒光的定義及發(fā)展26第二節(jié)分子熒光法的基本原理一、熒光的產(chǎn)生二、激發(fā)光譜和熒光光譜三、熒光與物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)第二節(jié)分子熒光法的基本原理一、熒光的產(chǎn)生27

已經(jīng)知道，熒光是在一定波長光照射下，某些分子受到激發(fā)后發(fā)出光量子所致。對一種特定的分子來說：哪些波長光使之激發(fā)產(chǎn)生熒光？哪個(gè)波長激發(fā)后所產(chǎn)生的熒光最強(qiáng)？——激發(fā)光譜一定波長的激發(fā)光使其產(chǎn)生的熒光哪個(gè)波長下最強(qiáng)？——熒光光譜可由實(shí)驗(yàn)測定物質(zhì)分子的激發(fā)光譜與熒光光譜來說明。已經(jīng)知道，熒光是在一定波長光照射下，28激發(fā)光譜與熒光（發(fā)射）光譜一、熒光的檢測光源發(fā)出的紫外可見光通過激發(fā)單色器分出不同波長的激發(fā)光，照射到樣品溶液上，激發(fā)樣品產(chǎn)生熒光。樣品發(fā)出的熒光為寬帶光譜，需通過發(fā)射單色器分光后再進(jìn)入檢測器，檢測不同發(fā)射波長下的熒光強(qiáng)度F。由于激發(fā)光不可能完全被吸收，可透過溶液，為了防止透射光對熒光測定的干擾，常在與激發(fā)光垂直的方向檢測熒光（因熒光是向各個(gè)方向發(fā)射的）。

吸收池光源檢測器單色器信號(hào)顯示系統(tǒng)單色器激發(fā)光譜與熒光（發(fā)射）光譜一、熒光的檢測吸收池光源檢測器單色29熒光激發(fā)光譜與熒光（發(fā)射）光譜1.激發(fā)光譜excitationspectrum：將激發(fā)熒光的光源用單色器分光，連續(xù)改變激發(fā)光波長，固定熒光發(fā)射波長，測定不同波長激發(fā)光下物質(zhì)溶液發(fā)射的熒光強(qiáng)度(F)，作F—λ光譜圖稱激發(fā)光譜。從激發(fā)光譜圖上可找到發(fā)生熒光強(qiáng)度最強(qiáng)的激發(fā)波長λex，選用λex可得到強(qiáng)度最大的熒光。二、激發(fā)光譜和熒光光譜

熒光激發(fā)光譜與熒光（發(fā)射）光譜1.激發(fā)光譜excitatio30熒光激發(fā)光譜與熒光（發(fā)射）光譜2.熒光光譜fluorescencespectrum：選擇λex作激發(fā)光源，用另一單色器將物質(zhì)發(fā)射（發(fā)射光譜）的熒光分光，記錄每一波長下的F，作F-λ光譜圖稱為熒光光譜。熒光光譜中熒光強(qiáng)度最強(qiáng)的波長為λem。

λex

與λem一般為定量分析中所選用的最靈敏的波長。熒光激發(fā)光譜與熒光（發(fā)射）光譜2.熒光光譜fluoresc31分子熒光分析方法教材課件32激發(fā)光譜:固定測量波長(選最大發(fā)射波長),化合物發(fā)射的熒光(磷光)強(qiáng)度與照射光波長的關(guān)系曲線（圖中曲線I）

激發(fā)光譜形狀與吸收光譜形狀完全相似，經(jīng)校正后二者完全相同！發(fā)射光譜：固定激發(fā)光波長(選最大激發(fā)波長),化合物發(fā)射的熒光(或磷光強(qiáng)度)與發(fā)射光波長關(guān)系曲線(圖中曲線II或III)。激發(fā)光譜:固定測量波長(選最大發(fā)射波長),化合物發(fā)射的熒光(33熒光激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的特征a.Stokes位移—熒光波長比激發(fā)光譜的波長較長在溶液中，分子熒光的發(fā)射相對于吸收位移到較長的波長，稱為Stokes位移。這是由于受激分子通過振動(dòng)弛豫而失去轉(zhuǎn)動(dòng)能，也由于溶液中溶劑分子與受激分子的碰撞，也會(huì)有能量的損失。因此，在激發(fā)和發(fā)射之間產(chǎn)生了能量損失。b.發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān)分子被激發(fā)到高于S1的電子態(tài)的更高振動(dòng)能級(jí)，然而由于內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動(dòng)弛豫的速率很快，很快損失多余的能量而衰變到S1電子態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)盡管分子受激到達(dá)不同能級(jí)的激發(fā)態(tài)，不管激發(fā)波長如何，電子都是從第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能層躍遷到基態(tài)的各個(gè)振動(dòng)能層，而與熒光體被激發(fā)至哪一個(gè)電子態(tài)無關(guān)。無論激發(fā)波長是λ1還是λ2，熒光的波長都是λ?2激發(fā)光譜的形狀與發(fā)射波長也無關(guān)熒光激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的特征a.Stokes位移—熒光波長比34ex=290nm(MAX)固定em=620nm(MAX)固定ex=290nm(MAX)em=620nm(MAX)S04321S143211→

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鏡像規(guī)則

通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜（與激發(fā)光譜形狀一樣）成鏡像對稱關(guān)系。

基態(tài)上的各振動(dòng)能級(jí)分布與第一激發(fā)態(tài)上的各振動(dòng)能級(jí)分布類似；基態(tài)上的零振動(dòng)能級(jí)與第一激發(fā)態(tài)的各振動(dòng)能級(jí)之間的躍遷和反躍遷幾率相等ex=290nm(MAX)固定em=620nm(MA35200250300350400450500熒光激發(fā)光譜熒光發(fā)射光譜nm蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜200250300350400450500熒光激發(fā)光譜熒光發(fā)36

熒光光譜與激發(fā)光譜形狀極為相似，且二者成鏡像對稱熒光光譜與激發(fā)光譜形狀極為相似，且二者成鏡像對稱37激光光譜與熒光光譜的應(yīng)用1、定性分析將熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜和熒光光譜圖的形狀、位置與標(biāo)準(zhǔn)溶液的光譜圖進(jìn)行比較。跟紫外可見吸收光譜法相比，因參照圖更多，可靠性更好。2、定量分析根據(jù)熒光光譜中最大激發(fā)波長λex和最大熒光波長λem，可得到定量分析的最佳條件。激光光譜與熒光光譜的應(yīng)用1、定性分析38熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系分子熒光產(chǎn)生的必備條件分子必須能夠吸收激發(fā)光分子必須具有一定的熒光量子產(chǎn)率影響因素：熒光產(chǎn)生過程中，輻射和無輻射過程；與每一過程的速率常數(shù)有關(guān)；kf

分子結(jié)構(gòu)決定（內(nèi)因）；主要取決于化學(xué)結(jié)構(gòu)和化學(xué)環(huán)境和結(jié)構(gòu)共同決定。熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系分子熒光產(chǎn)生的必備條件分子必須能夠吸收激39n振動(dòng)弛豫激發(fā)

n熒光（1）躍遷類型：具有電子躍遷類型的結(jié)構(gòu)

躍遷是產(chǎn)生熒光的主要躍遷類型特點(diǎn)：較大的摩爾吸光系數(shù)較短的激發(fā)態(tài)壽命10-7~10-9s串越至三重態(tài)幾率小振動(dòng)弛豫激發(fā)熒光（1）躍遷類型：具有40（2）具有大的共軛π鍵結(jié)構(gòu)共軛度越大，熒光越強(qiáng)。原因：共軛體系越大，離域大π鍵的電子越容易激發(fā)，熒光與磷光越容易產(chǎn)生。化合物苯萘蒽丁省戊省λexmax(nm)205286365390580λemmax

(nm)278321400480640F0.110.290.460.600.52苯萘蒽丁省戊省苯萘蒽丁省戊?。?）具有大的共軛π鍵結(jié)構(gòu)共軛度越大，熒光越強(qiáng)?；衔锉捷凛?1（3）具在剛性平面結(jié)構(gòu)

0.9210.18（3）具在剛性平面結(jié)構(gòu)0.9210.18421）給電子取代劑加強(qiáng)熒光（4）取代基效應(yīng)—HN2，