基因工程原理與技術(shù)

基因工程原理與技術(shù)授課教師：參考書(shū)：

1、《基因工程原理》吳乃虎主編

2、《植物基因工程原理與技術(shù)》王關(guān)林主編第一章緒論第一節(jié)基因工程的概念基因工程(geneengineering)是現(xiàn)代生物技術(shù)的核心內(nèi)容。

基因工程是在分子水平上進(jìn)行的遺傳操作，是指將一種或多種生物體的基因分離出來(lái)或人工合成基因，按照人們的愿望，進(jìn)行嚴(yán)密的設(shè)計(jì)和體外加工重組，轉(zhuǎn)移到另一種生物體的細(xì)胞內(nèi)，使之能在受體細(xì)胞中遺傳表達(dá)并獲得新的遺傳性狀而形成新的生物類(lèi)型的生物技術(shù)。

基因工程的核心內(nèi)容是基因體外重組(DNA體外重組)?；蚬こ痰乃拇笠?或基本條件)：目的基因、載體、工具酶、受體。

相關(guān)名詞：遺傳工程、基因工程、基因操作、重組DNA技術(shù)、分子克隆、基因克隆、基因無(wú)性繁殖?；蚬こ痰耐怀鎏攸c(diǎn)：打破物種間基因交流的界限。

第二節(jié)基因工程的誕生與發(fā)展

基因工程誕生于1973年。一、基因工程誕生的理論和技術(shù)基礎(chǔ)1、理論基礎(chǔ)

①DNA是遺傳物質(zhì)；

②DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)和半保留復(fù)制；

③遺傳密碼的通用性和遺傳信息傳遞的方式。2、技術(shù)基礎(chǔ)

①限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)與DNA的切割；

②DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)與DNA片段的連接；

③基因工程載體的構(gòu)建與應(yīng)用。

二、基因工程的誕生1972年，美國(guó)斯坦福大學(xué)P.Berg研究小組的DNA體外重組實(shí)驗(yàn)。

1973年，斯坦福大學(xué)的S.Cohen研究小組的DNA體外重組和大腸桿菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。(見(jiàn)下兩張幻燈片)同年，加利福尼亞大學(xué)的H.Boyer也進(jìn)行了類(lèi)似的實(shí)驗(yàn)。這一實(shí)驗(yàn)的成功標(biāo)志著基因工程的誕生，因此，1973年被定為基因工程誕生的元年。

pSC101抗四環(huán)素pR6-5抗卡那霉素DNA連接酶重組DNA分子EcoRI抗卡那霉素基因培養(yǎng)平皿卡那霉素平板四環(huán)素\卡那霉素平板大腸桿菌四環(huán)素平板三、基因工程的發(fā)展

分為艱難階段、逐漸成熟階段、迅速發(fā)展階段、鼎盛發(fā)展階段。1、基因工程的艱難階段(1973~1976，載體和受體系統(tǒng)的安全性改造)

基因工程的安全性問(wèn)題，導(dǎo)致許多國(guó)家限制基因重組的實(shí)驗(yàn)。2、基因工程的逐漸成熟階段(1976~1982，基因工程藥物的研制)1976年,Genentech(GeneticEngineeringTechnology)公司成立(byRobertSwansonandHerbBoyer)。

1977年Boyer等首先將人工合成的生長(zhǎng)激素釋放抑制因子14肽的基因重組入質(zhì)粒，成功地在大腸桿菌中合成得到這14肽(見(jiàn)下圖)；1978年Itakura（板倉(cāng)）等使人生長(zhǎng)激素191肽在大腸桿菌中表達(dá)成功；1979年美國(guó)基因技術(shù)公司用人工合成的人胰島素基因重組轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，并通過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)人胰島素。從而揭開(kāi)了基因工程產(chǎn)業(yè)化的序幕。

大腸桿菌生長(zhǎng)激素釋放抑制因子重組體+SS基因目的基因基因載體從動(dòng)物腦中提取5mg---50萬(wàn)只羊腦9升工程大腸桿菌培養(yǎng)液3、基因工程的迅速發(fā)展階段(1982~2000，動(dòng)植物基因工程育種與基因治療)

發(fā)展了一系列新的基因工程操作技術(shù)，構(gòu)建了多種轉(zhuǎn)化原核生物和動(dòng)物、植物細(xì)胞的載體。

1982年首次通過(guò)顯微注射培育出世界上第一個(gè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物——轉(zhuǎn)基因小鼠。

1983年采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法培育出世界上第一例轉(zhuǎn)基因植物——轉(zhuǎn)基因煙草。1990年美國(guó)政府首次批準(zhǔn)一項(xiàng)人體基因治療臨床研究計(jì)劃，對(duì)一名因腺苷脫氨酶基因缺陷而患有重度聯(lián)合免疫缺陷癥的兒童進(jìn)行基因治療獲得成功。1991年，美國(guó)提出人類(lèi)基因組計(jì)劃并實(shí)施。4、鼎盛發(fā)展階段(21世紀(jì))

2005年完成人類(lèi)基因組計(jì)劃。至今，基因工程藥物上市的有幾十種，上百種正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)。

轉(zhuǎn)基因植物迅速發(fā)展，目前至少有150種轉(zhuǎn)基因植物問(wèn)世。自從1986年抗除草劑轉(zhuǎn)基因煙草被首次批準(zhǔn)進(jìn)入田間試驗(yàn)以來(lái),至今國(guó)際上已有30個(gè)國(guó)家批準(zhǔn)上千例轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)入田間試驗(yàn),涉及的植物種類(lèi)達(dá)50多種。自從1994年轉(zhuǎn)基因延熟西紅柿獲準(zhǔn)上市以來(lái)，目前至少有51種轉(zhuǎn)基因植物上市。

雖然轉(zhuǎn)基因動(dòng)動(dòng)物比轉(zhuǎn)基因因植物誕生早早，但其發(fā)展展比轉(zhuǎn)基因植植物要慢得多多！主要原因是動(dòng)動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技技術(shù)操作煩瑣瑣、困難，動(dòng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)養(yǎng)要求高，不不易再生出個(gè)個(gè)體。荷蘭的GenPharm公司用轉(zhuǎn)基基因牛生產(chǎn)乳乳鐵蛋白，預(yù)預(yù)計(jì)每年從牛牛奶生產(chǎn)出來(lái)來(lái)營(yíng)養(yǎng)奶粉的的銷(xiāo)售額是50億美元。。英國(guó)羅斯林研研究所研制成成功的轉(zhuǎn)基因因羊，其乳汁汁中含有α[1]-抗抗胰蛋白酶，，可治療肺氣氣腫病。這種種病在北美比比較常見(jiàn)，病病人以前只能能依賴(lài)于注射射人的α[1]-抗胰蛋蛋白酶做替代代療法，價(jià)價(jià)格昂貴，而而現(xiàn)在用轉(zhuǎn)基基因羊來(lái)生產(chǎn)產(chǎn)，每升這種種羊奶可售6000美元元。中國(guó)工程院院院士曾溢濤教教授研究小組組獲得5只轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基因山羊。。其中一只奶奶山羊的乳汁汁中，含有堪堪稱(chēng)血友病人人救星的藥物物蛋白——有有活性的人凝凝血因子Ⅸ。。第三節(jié)基基因工程研研究的主要內(nèi)內(nèi)容一、基因工程程研究的主要要內(nèi)容主要包括：基礎(chǔ)研究（載體的研究究、受體系統(tǒng)統(tǒng)的研究、目目的基因研究究、工具酶的的研究、轉(zhuǎn)化化方法的研究究、生物基因因組學(xué)研究））和應(yīng)用研究等。1、載體的研研究構(gòu)建各種用途途載體及提高高外源基因表表達(dá)的效率。。2、受體系統(tǒng)統(tǒng)的研究包括細(xì)菌、真真菌、植物、、動(dòng)物。受體系統(tǒng)的安安全性及轉(zhuǎn)化化效率。3、目的基因因研究目的基因的分分離、克隆及及改造。4、工具酶的的研究開(kāi)發(fā)新的工具具酶。5、轉(zhuǎn)化方法法的研究開(kāi)發(fā)各種受體細(xì)胞胞的高效轉(zhuǎn)化化方法。6、生物基因因組學(xué)研究具有重要經(jīng)濟(jì)濟(jì)價(jià)值的各種種生物的基因因組測(cè)序、挖挖掘新的基因因等。7、應(yīng)用研究包括基因工程程藥物研究、、基因疫苗研研究、轉(zhuǎn)基因因植物研究、、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物物研究以及在在酶制劑工業(yè)業(yè)、食品工業(yè)業(yè)、化學(xué)與能能源工業(yè)及環(huán)環(huán)境保護(hù)等方方面的應(yīng)用。。二、基因工程程的基本操作作程序①分離獲得帶帶有目的基因因的DNA片片段及載體選選擇與構(gòu)建。。②限制性核酸酸內(nèi)切酶分別別切割外源DNA和載體體。③通過(guò)DNA連接酶將外外源基因DNA片段連接接到載體上，，形成重組DNA分子。。④將重組DNA分子引引入到受體細(xì)細(xì)胞(轉(zhuǎn)化)。⑤帶有重組體體細(xì)胞(轉(zhuǎn)化體)的擴(kuò)增及選選擇培養(yǎng)。⑥轉(zhuǎn)化體的鑒鑒定，獲得外外源基因高效效穩(wěn)定表達(dá)的的基因工程菌菌或細(xì)胞。⑦目的基因的的進(jìn)一步研究究分析，并設(shè)設(shè)法使之實(shí)現(xiàn)現(xiàn)功能蛋白的的表達(dá)(基因因功能研究或或基因改造研研究)。三、基因工程程的基本操作作內(nèi)容基因工程的主主體戰(zhàn)略思想想是外源基因因的穩(wěn)定高效效表達(dá)。為達(dá)達(dá)到此目的，，可從以下幾幾個(gè)方面進(jìn)行行操作。①選用高拷貝貝載體，增加加外源基因在在受體細(xì)胞中中的劑量；②篩選、修飾飾和重組啟動(dòng)動(dòng)子、增強(qiáng)子子、終止子等等基因的轉(zhuǎn)錄錄調(diào)控元件，，并將這些元元件與外源基基因精細(xì)拼接接，強(qiáng)化外源源基因的轉(zhuǎn)錄錄水平。③選擇、修飾飾和重組核糖糖體結(jié)合位點(diǎn)點(diǎn)及密碼子等等mRNA的的翻譯調(diào)控元元件，強(qiáng)化受受體細(xì)胞中蛋蛋白質(zhì)的生物物合成過(guò)程。。④構(gòu)建融合表表達(dá)載體或分分泌表達(dá)載體體，增加外源源蛋白的可溶溶性。第四節(jié)基基因工程的的意義與發(fā)展展前景一、基因工程程研究的意義義①大規(guī)模生產(chǎn)產(chǎn)其他生物體內(nèi)內(nèi)含量極微但但卻具有較高高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的的生物分子；②設(shè)計(jì)構(gòu)建新新物種(新性狀乃至全全新物種)；③搜尋、分離離和鑒定生物物體尤其是人人體內(nèi)的遺傳傳信息資源(基因)。。二、基因工程程發(fā)展前景基因工程問(wèn)世世以來(lái)短短的的三十年，顯顯示出了巨大大的活力，基基因工程的前前景將更加燦燦爛輝煌。今今后，基因工工程的重點(diǎn)研研究方向是基基因組學(xué)、基基因工程藥物物、動(dòng)植物生生物反應(yīng)器和和環(huán)保等方面面。第二章基基因工程程的工具酶工具酶是指基因工程程操作中所使使用的核酸酶酶類(lèi)。根據(jù)其其用途分為四四類(lèi)：限制性?xún)?nèi)切酶酶、連接酶、聚合酶、修飾酶。第一節(jié)限限制性核核酸內(nèi)切酶一、宿主的的限制-修修飾現(xiàn)象(見(jiàn)下圖)限制作用(restriction)：指一定定類(lèi)型的細(xì)細(xì)菌可以通通過(guò)限制酶酶的作用，，破壞入侵侵的噬菌體體DNA，，導(dǎo)致噬菌菌體的寄主主幅度受到到限制。這這是維護(hù)宿主遺遺傳穩(wěn)定的的保護(hù)機(jī)制制。修飾作用(modification)：指寄寄主本身的的DNA，，由于在合合成后通過(guò)過(guò)甲基化酶酶的作用得得以甲基化化，使DNA得以修修飾，從而而免遭自身身限制性酶酶的破壞。。這是宿主細(xì)胞識(shí)識(shí)別自身遺遺傳物質(zhì)和和外來(lái)遺傳傳物質(zhì)的作作用機(jī)制。。R/M系統(tǒng)統(tǒng)①DNA甲基基化酶②限制性核酸酸內(nèi)切酶R/M系統(tǒng)統(tǒng)的作用①限制作用②修飾作用1953年年，Arber發(fā)現(xiàn)現(xiàn)限制-修修飾現(xiàn)象，，預(yù)見(jiàn)限制制性核酸內(nèi)內(nèi)切酶的存存在；1970年年，H.O.Smith從流流感嗜血桿桿菌中分離離出第一個(gè)個(gè)II型限限制性核酸酸內(nèi)切酶HindII。。Nathans首次次用限制性性酶切割SV40DNA。根據(jù)限制-修飾系統(tǒng)統(tǒng)的遺傳分分析，大腸腸桿菌K12有以下下4種表型型：①rk+mk+：野生型，，具有完整整的限制和和修飾功能能。②rk-mk+：限制缺陷陷型，不能能降解外源源DNA，，但具有修修飾功能，，這類(lèi)突變變株經(jīng)常用用于基因工工程的受體體。③rk-mk-：限制和修修飾缺陷型型，既無(wú)限限制功能，，又無(wú)修飾飾功能，也也常用于基因工程的的受體。④rk+mk-：修飾缺陷陷型，缺乏乏修飾自身身DNA的的功能，但但具有限制制功能，故故也稱(chēng)為““自殺性表表型”(suicidephenotype)。特性Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型酶分子結(jié)構(gòu)功能輔助因子識(shí)別序列切割位點(diǎn)切割方式應(yīng)用價(jià)值舉例異源三聚體限制與修飾ATPMg2+SAM非對(duì)稱(chēng)序列距識(shí)別序列1kb處隨機(jī)性切割無(wú)EcoK、EcoB同源三聚體限制Mg2+

4-6bp回文序列識(shí)別序列內(nèi)或附近特異切割廣泛EcoRI、HindIII…異源二聚體限制與修飾ATPMg2+SAM非對(duì)稱(chēng)序列識(shí)別序列下游24-26bp處隨機(jī)性切割小EcoPI三、限制性性核酸內(nèi)切切酶的命名名1973年年H.O.Smith和D.Nathams提提出命名系系統(tǒng)，1980年Roberts在此此基礎(chǔ)上進(jìn)進(jìn)行了修改改。①限制性核核酸內(nèi)切酶酶第一個(gè)字字母(大寫(xiě)，斜體體)代表該酶酶的宿主菌菌屬名(genus)第一個(gè)個(gè)字母；第第二、三個(gè)個(gè)字母(小寫(xiě)，斜體體)代表宿主主菌種名(species)前兩個(gè)字字母。②第四個(gè)字字母代表宿宿主菌的菌菌株名的第第一個(gè)字母母(小寫(xiě)，正體體)或染色體體外成分(質(zhì)?；蚴墒删w，大寫(xiě)，正體體)。③若從一種種菌株中發(fā)發(fā)現(xiàn)了幾種種限制性核核酸內(nèi)切酶酶，即根據(jù)據(jù)發(fā)現(xiàn)和分分離的先后后順序用羅羅馬字母表表示(正體)。Haemophilusinfluenzaed流感嗜血桿桿菌d株HindⅡHindⅢ四、II型限制性核核酸內(nèi)切酶酶的基本特特性1、II型型限制性?xún)?nèi)內(nèi)切酶的識(shí)識(shí)別序列一般為4～～6bp的的回文序列列。也有6bp以上上的，如NotI，稱(chēng)為稀有切割限限制酶。有些為反向重復(fù)序序列(間斷斷回文序列列)，如SfiI。有些II型型限制酶的的識(shí)別序列列中，某一一位或二位位堿基并非非嚴(yán)格專(zhuān)一一，如HindII可可識(shí)別4種核苷酸酸序列。酶識(shí)別序列酶識(shí)別序列BamHIG↓GATCCPstICTGCA↓GBglIIA↓GATCTSalIG↓TCGACEcoRIG↓AATTCSau3AI↓GATCHindIIGTPy↓PuACSfiIGGCCNNNN↓NGGCCHindIIIA↓AGCTTSmaICCC↓GGGKpnIGGTAC↓CXbaIT↓CTAGANotIGC↓GGCCGCXhoIC↓TCGAG2、II型型限制性核核酸內(nèi)切酶酶的切割方方式大多數(shù)II型限制性性核酸內(nèi)切切酶均在其其識(shí)別位點(diǎn)點(diǎn)內(nèi)部切割割雙鏈DNA，水解解磷酸二酯酯鍵中3’’位的酯鍵鍵，產(chǎn)生3’端為羥羥基、5’’端為磷酸酸基團(tuán)的片片段。有三三種切割方方式：①在識(shí)別序序列的對(duì)稱(chēng)稱(chēng)軸的5’’末端切割割，產(chǎn)生5’黏性末末端，如EcoRI②在識(shí)別序序列的對(duì)稱(chēng)稱(chēng)軸的3’’端切割，，則產(chǎn)生3’黏性末末端，如PstI③在識(shí)別序序列的對(duì)稱(chēng)稱(chēng)軸上切割割，產(chǎn)生平平頭末端，，如PvuII有些識(shí)別序序列為間斷斷型回文序序列的II限制酶，，其切點(diǎn)位位于不確定定核苷酸中中，如：BglIGCCNNNN↓NGGCSfiIGGCCNNNNN↓NGGCCXmnIGAANN↓NNTTC有極少數(shù)II型限制制性核酸內(nèi)內(nèi)切酶的切切割位點(diǎn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)離識(shí)別序序列，如MboII識(shí)別GAAGA序序列，切割割位點(diǎn)則是是：5’－GAAGANNNNNNNN↓N－－3’3’－CTTCTNNNNNNNN↓N－5’’同裂酶是指識(shí)別序序列相同、、切割方式式相同或不不同、來(lái)源源不同的II限制性性核酸內(nèi)切切酶。如：HpaII與MspI的識(shí)別序序列和切割割位點(diǎn)都相相同(C↓↓CGG)，但MspI還可以識(shí)識(shí)別已甲基基化的序列列CmCGG；SmaI(CCC↓GGG)和XmaI(C↓↓CCGGG)，識(shí)識(shí)別序列相相同，但切切割位點(diǎn)不不同。同尾酶是指來(lái)源各各異、識(shí)別別序列不同同，但產(chǎn)生生相同的黏黏性末端的的II限制制性核酸內(nèi)內(nèi)切酶。如：BamHI(5’-G↓GATCC-3’)BglII(5’-A↓↓GATCT-3’’)3、II型型限制性核核酸內(nèi)功酶酶不具有甲甲基化功能能如EcoRI限制性核核酸內(nèi)切酶酶與EcoRI甲基化酶酶，兩者均均識(shí)別GAATTC序列，而而前者能對(duì)對(duì)G↓AATTC序序列進(jìn)行切切割，后者者的作用是是使第二個(gè)個(gè)A甲基化化。目前已已經(jīng)分離到到許多II型限制性性核酸內(nèi)切切酶與其對(duì)對(duì)應(yīng)的甲基基化酶。4、II型型限制性核核酸內(nèi)切酶酶對(duì)單鏈DNA的切切割有一些II限制性核核酸內(nèi)切酶酶，除雙鏈鏈DNA外外，還可以以特異識(shí)別別并切割單單鏈DNA的相應(yīng)位位點(diǎn)，只是是切割效率率比較低。。如HhaI能切割單鏈鏈?zhǔn)删wФФX174和M13mp18DNA，只是是切割單鏈鏈DNA比切割雙雙鏈DNA效率低低50％。。五、Ⅱ限制制性核酸內(nèi)內(nèi)切酶的主主要用途①產(chǎn)生具有有相同粘性性末端的DNA片段段，以便重重組克??；；②建立DNA分子的的限制酶圖圖譜；③構(gòu)建基因因文庫(kù)；④構(gòu)建載體體。六、II型型限制性核核酸內(nèi)切酶酶的酶切反反應(yīng)1、標(biāo)準(zhǔn)酶解體體系的建立立反應(yīng)體積一一般為20μl(根據(jù)DNA量可可適當(dāng)擴(kuò)大大)。①10×酶切切緩沖液2μl(大部分分酶反應(yīng)緩緩沖液基本本相似：50mmol/LTris-HClpH7.0~7.5、0~100mmol/LNaCl、10mmol/LMgCl2、1mmol/LDTT)②酶(根據(jù)酶活活力大小及及工作性質(zhì)質(zhì)確定酶量量，不超過(guò)過(guò)反應(yīng)總體體積10％％③DNA樣品品(μg~mg)④無(wú)菌水限制性核酸酸內(nèi)切酶的的一個(gè)活力單單位(U)為：：在合適的的溫度和緩緩沖液中，，在20μL反應(yīng)體系系中，1h完全降解解1ug標(biāo)準(zhǔn)DNA所需需要的酶量量。2、酶解反反應(yīng)①混勻②酶解(溫溫度、時(shí)間間)③酶解鑒定定④終止a、加EDTA至至10mmol/L；b、加SDS至0.1%(W/V)；；c、65℃℃水浴保溫溫20min(有些些最適反應(yīng)應(yīng)溫度較高高的酶不能能使之完全全失活，如如AceIII、BelI、BstXI、TaqI)；d、酚/氯氯仿抽提酶酶，乙醇沉沉淀DNA3、限制性性核酸內(nèi)切切酶對(duì)DNA的不完完全酶解(見(jiàn)下圖)不完全酶解解對(duì)于構(gòu)建建物理圖譜譜和基因組組文庫(kù)是非非常必要的的。其方法法有減少酶酶量、增加加反應(yīng)體積積、縮短反反應(yīng)時(shí)間和和降低反應(yīng)應(yīng)溫度等。。incomplete1231+3incompletedigestion123SmaIcomplete1+2+34、Ⅱ限制制性核酸內(nèi)內(nèi)切酶操作作的注意事事項(xiàng)①商品化的的限制性核核酸內(nèi)切酶酶均為濃縮縮液，每次次操作時(shí)應(yīng)應(yīng)使用新的的吸頭去取取酶；②加入酶的的體積應(yīng)不不超過(guò)總體體積的10%，否則則酶液中的的甘油濃度度超過(guò)5%時(shí)將會(huì)抑抑制酶的活活性；③整個(gè)操作作應(yīng)在0℃℃進(jìn)行，即即在冰浴中中進(jìn)行，而而且是在加加入其它試試劑之后，，最后加入入酶；④盡可能使使反應(yīng)體積積減到最小小，即盡可可能少加水水；⑤當(dāng)切割大大量DNA時(shí)，通常常采用延長(zhǎng)長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間間，減少酶酶的用量；；⑥當(dāng)DNA需2種或或以上酶切切時(shí)，應(yīng)用用通用緩沖沖液。若沒(méi)沒(méi)有通用緩緩沖液時(shí)，，只有用1種酶切完完后，純化化酶切產(chǎn)物物，再進(jìn)行行下一個(gè)酶酶切反應(yīng)。。七、影響限限制性核酸酸內(nèi)切酶活性與酶切效果的因素1、酶的純度；要求不存在在其他核酸酸內(nèi)切酶或或外切酶的的污染。2、DNA樣品品的純度；DNA樣品品中的蛋白白質(zhì)、苯酚酚、氯仿、、乙醇、EDTA、、SDS、、高NaCl等，都都能抑制酶酶活性。樣樣品中DNase會(huì)降解DNA，影影響酶切。。3、酶切反應(yīng)的的溫度、時(shí)間；多數(shù)II型型限制酶最最適反應(yīng)溫溫度是37℃，但SmaI為25℃℃或30℃℃，SfiI為50℃℃，TaqI為65℃℃。反應(yīng)溫度過(guò)過(guò)高或過(guò)低低都會(huì)影響響酶活性，，甚至導(dǎo)致致酶失活。。4、DNA的甲甲基化程度度；限制性核酸酸內(nèi)切酶不不能切割甲甲基化的核核苷酸序列列。這一特性有有特殊用途途：①改變變某些限制制性核酸內(nèi)內(nèi)切酶的識(shí)識(shí)別序列；；②產(chǎn)生新新的限制酶酶識(shí)別序列列；③保護(hù)護(hù)限制性核核酸內(nèi)切酶酶的切點(diǎn)；；④利用一一些同裂酶酶對(duì)甲基化化的敏感性性不同，研研究細(xì)胞DNA位點(diǎn)點(diǎn)專(zhuān)一性甲甲基化的程程度和分布布。大腸桿菌中中的DNA腺嘌呤甲甲基化酶(dam)在5’GATC3’序列中中的腺嘌呤呤N6位引入甲基基，受其影影響的酶有有BclI、MboI等，但但BamHI、BglII、Sau3AI不不受影響。。大腸桿菌中中的DNA胞嘧啶甲甲基化酶(dcm)在在5’CCAGG3’或5’’CCTGG3’序序列中的胞胞嘧啶C5位上引入甲甲基，受其其影響的酶酶有EcoRII等，，但BglI、KpnI不受影響響。采用去甲基化酶酶的大腸桿桿菌菌株來(lái)制備質(zhì)粒粒DNA，，可防止DNA的甲甲基化。5、DNA分子子的構(gòu)型限制性?xún)?nèi)切切酶對(duì)不同同構(gòu)型DNA分子的的酶切效果果是不同的的，例如超超螺旋DNA酶解所所需要的酶酶量，比線線性DNA酶解所需需要的酶量量高許多，，甚至可高高達(dá)20倍倍。有些限制性性核酸內(nèi)切切酶對(duì)于同同一DNA分子上上不同位置置的識(shí)別序序列，切割割效率明顯顯不同。例例如，EcoRI、HindIII對(duì)λDNA的酶切切。6、反應(yīng)緩沖液液主要成分：：pH(Tris-HCl)、離子強(qiáng)強(qiáng)度(NaCl)、、Mg2+；輔助成分：：β-巰基基乙醇或二二硫蘇糖醇醇(DTT)防止酶氧化化；牛血清蛋白白(BSA)組分V對(duì)于某些些酶是必需需的，可防防止酶在低低濃度蛋白白質(zhì)溶液中中變性。星號(hào)活性是指在極端端非標(biāo)準(zhǔn)反反應(yīng)條件下下，限制性性核酸內(nèi)切切酶能切割割與特異識(shí)識(shí)別序列相相似的序列列的特性。。例如EcoRI在高pH(＞8)、低鹽鹽(50mmol/L)和高高濃度甘油油(＞5％％)存在的的情況下，，其識(shí)別序序列由GAATTC改變?yōu)镹AATTN。以EcoRI表示其星號(hào)號(hào)活性。引起星號(hào)活活性的原因因有：①高甘油油含量，大大于5%；；②酶用量量過(guò)大，大大于100U/微克克DNA；；③低離子子強(qiáng)度，小小于25mmol/L；④④高pH，，大于8.0；⑤含含有機(jī)劑，，如乙醇、、二甲基亞亞砜、二甲甲基乙酰胺胺等；⑥Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+等非Mg2+的二價(jià)陽(yáng)離離子的存在在。常發(fā)生星活活性的內(nèi)切切酶有：EcoRI、HindⅢ、KpnI、PstI、SalI、HinfI等。第二節(jié)DNA連接酶1967年年幾個(gè)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)室?guī)缀跬瑫r(shí)發(fā)現(xiàn)DNA連接接酶。一、定義與與反應(yīng)機(jī)理理DNA連接接酶是指能催化化雙鏈DNA分子內(nèi)內(nèi)或分子間間的5’-磷酸基和和3’-羥羥基生成磷磷酸二酯鍵鍵而使DNA鏈連接接的一類(lèi)酶酶。大腸桿菌和其他細(xì)菌：NAD+動(dòng)物細(xì)胞和噬菌體：ATPT4DNA連接酶酶連接DNA/RNA雜合分分子中DNA鏈的切切口DNA連接酶無(wú)連接DNA連接接酶的作用用機(jī)理二、DNA連接酶的的種類(lèi)1、T4噬噬菌體DNA連連接酶(T4DNA連連接酶)T4DNA連接酶DNA/RNARNA平頭末端的的Km比黏黏性末端的的Km高約約1000倍。提高高平頭末端端連接效率率的方法：：①加大酶濃度(10~100倍于粘性末末端)；②加大底物濃濃度；③加入適量的的一價(jià)陽(yáng)離離子(150-200mmol/LNaCl)；④加入低濃度的PEG(10%PEG8000)。ATP的最適終終濃度為0.5mmol/L。2、大腸桿桿菌DNA連接酶E.coliDNA連接酶DNA/RNAE.coliDNA連接酶無(wú)連接3、T4噬噬菌體RNA連接酶酶用途：RNA末端標(biāo)標(biāo)記pNpNNNNT4RNA連接酶三、DNA連接酶的的反應(yīng)體系系DNA連接接酶的活性性單位較通通用的是韋氏(Weiss)單位，一個(gè)韋氏氏單位是指指在37℃℃，20min內(nèi)內(nèi)催化從γγ,β-32P-ATP的焦磷酸酸根置換出出1nmol32P所需要的的酶量。M-L單位位：以d(A-T)n作為底底物黏性末端連連接單位：：以λDNA/HindIII片段為底底物一個(gè)韋氏單單位相當(dāng)于于0.2個(gè)個(gè)M-L單單位或者60個(gè)黏性性末端連接接單位。反應(yīng)體系：10μL或或20μL，DNA片段段，連接酶，Buffer，溫度(12~16℃或<30℃)，時(shí)間(4~16h)Buffer：50mmol/LTris-HClpH7.6，10mmol/LMgCl2，0.5mmol/LATP，5mmol/LDTT四、影響連連接反應(yīng)的的因素1、DNA末端的濃濃度連接產(chǎn)物的的分子構(gòu)型型(線形或環(huán)狀)與DNA濃度及DNA分子子長(zhǎng)度存在在密切關(guān)系系。在一定定濃度下，，小分子DNA片段段進(jìn)行分子子內(nèi)連接，，有利于形形成環(huán)化分分子。對(duì)于于長(zhǎng)度一定定的DNA分子，其其濃度增加加有利于分分子間連接接。此外，，分子間連連接還與兩兩種片段的的末端濃度度的比例有有關(guān)。原則則上一種片片段的濃度度大于另一一一種片段段的濃，如如：在克隆隆中，插入入片段:載載體片段=2:1。。2、反應(yīng)溫度介于最適溫溫度與其Tm之間。。＞30℃℃會(huì)導(dǎo)致T4DNA連接酶酶的不穩(wěn)定定。3、ATP濃度ATP最適適的終濃度度為0.5mmol/L，濃濃度過(guò)高會(huì)會(huì)抑制連接接。第三節(jié)DNA聚聚合酶DNA聚合合酶分為：：①依賴(lài)于于DNA的的DNA聚聚合酶；②②依賴(lài)于RNA的DNA聚合合酶。常用的DNA聚合酶酶：大腸桿桿菌DNA聚合酶I、Klenow片片段酶、T4噬菌體體DNA聚聚合酶、T7噬DNA聚合酶酶、TaqDNA聚合酶、、逆轉(zhuǎn)錄酶酶。酶聚合反應(yīng)速度5’→3’外切酶活性3’→5’外切酶活性持續(xù)合成能力E.ColiDNA聚合酶I中速有低低Klenow酶中速無(wú)低低T4DNA聚合酶中速無(wú)高低T7DNA聚合酶快速無(wú)高高修飾T7DNA聚合酶快速無(wú)低或無(wú)高TaqDNA聚合酶快速有無(wú)高逆轉(zhuǎn)錄酶低速無(wú)無(wú)中一、大腸桿桿菌DNA聚合酶I5’→3’聚合酶活性5’→3’外切酶活性：雙鏈DNA帶磷酸基團(tuán)的5’端或DNA/RNA雜合分子中的RNA5’端3’→5’外切酶活性切口平移作作用DNAPolI主要用途：：切口平移法法制備DNA探針?lè)磻?yīng)體系：：在25μμl反應(yīng)體體系中含有有1μg純化的特特定DNA片斷，并并加入適量量的DNaseＩ、、PolＩＩ、α-32p-dNTPs和未未標(biāo)記的dNTPs。DNaseI，Mg2+PolI，α-32p-dCTP，dNTPs二、Klenow片片段Klenow酶具有有5’→3’聚合合酶活性和和3’→5’外切切酶活性，，缺失5`→3`核酸外切切酶活性。。其主要用用途如下：：①補(bǔ)平限制性性核酸內(nèi)切切酶產(chǎn)生的的5’黏性性末端；②標(biāo)記3’’凹陷末端端的DNA分子或平平末端；DNA末端端標(biāo)記一般般標(biāo)記活性性不高，極極少用于分分子雜交探探針的標(biāo)記記，主要用用于DNA序列測(cè)定定等所需片片段的標(biāo)記記。③合成cDNA第二鏈鏈；④雙脫氧末端端終止法測(cè)測(cè)定DNA序列；⑤在單鏈模板板上延伸寡寡核苷酸引引物，以合合成雜交探探針和進(jìn)行行體外突變變。平末端標(biāo)記記三、T4噬噬菌體DNA聚合酶酶具有5’→→3’聚合合酶活性和和3’→5’外切切酶活性，，缺少5’’→3’外外切酶活性性。其3’’→5’外外切酶活性性比Klenow酶酶高100~1000倍。在無(wú)dNTP時(shí)，可可以從任何何3`-OH端外切切(即可可降解dsDNA，，只是其活活性比ssDNA低低很多)，，在只有一一種dNTP時(shí)，外外切至互補(bǔ)補(bǔ)核苷酸，，在四種dNTP均均存在時(shí)，，聚合活性性占主導(dǎo)地地位。T4DNA聚合酶的置換合成作用無(wú)dNTP時(shí)，T4DNA聚合酶有dNTP時(shí)，T4DNA聚合酶T4DNA聚合酶酶的用途：：①切平核酸酸內(nèi)切酶產(chǎn)產(chǎn)生的3’’黏性末端端②末端標(biāo)記記。特別是是不需要核核酸外切酶酶幫助就可可進(jìn)行平末末端標(biāo)記，，這種探針針標(biāo)記方法法稱(chēng)為置換(取代)合成法。置換合成法法將產(chǎn)生一一組末端完完全標(biāo)記、、而從末端端到中點(diǎn)其其標(biāo)記量遞遞減的分子子。四、T7噬噬菌體DNA聚合酶酶與測(cè)序酶酶T7DNA聚合酶酶具有5`→3`聚聚合酶活性性及很強(qiáng)的的單鏈、雙雙鏈DNA的3`→→5`外切切酶活性，，但無(wú)5`→3`外外切酶活性性。其最大大特點(diǎn)是有有最強(qiáng)的持持續(xù)合成能能力。其用用途如下：：①用于長(zhǎng)模板板(M13DNA)的引物延伸伸；(不受DNA二級(jí)級(jí)結(jié)構(gòu)的影影響，聚合合能力較強(qiáng)強(qiáng)可延伸合合成數(shù)千個(gè)個(gè)核苷酸)②通過(guò)延伸或或取代合成成法標(biāo)記DNA3’’末端；③將雙鏈DNA的5’’或3’突突出末端轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)變成平末末端的結(jié)構(gòu)構(gòu)。對(duì)天然的T7DNA聚合酶酶進(jìn)行修飾飾，使之降降低或完全全失去3’’→5’的外切切酶活性，，而聚合酶酶活性增加加了3倍。。因此，修飾的T7DNA聚合酶主主要用于雙雙脫氧測(cè)序序，又稱(chēng)作為為測(cè)序酶。此外，還還用于末端標(biāo)標(biāo)記、探針針制備(可催化較低低水平<0.1μμmol/L的dNTP參參入)、體外誘變中中DNA鏈的合成。。五、TaqDNA聚合合酶TaqDNA聚合合酶具有5’→3’’聚合酶活活性和5’’→3’外外切酶活活性，缺少少3’→5’外切切酶活性。其最大特特點(diǎn)是熱穩(wěn)定(95℃以上上高溫半小小時(shí)不失活活)，最適反應(yīng)溫溫度高(7075℃)。因此，，其主要用途途是PCR及DNA測(cè)序(具有二級(jí)級(jí)結(jié)構(gòu)的DNA)。。保真的PCR酶有有TmaDNA聚合合酶(Thermotoamaritima海棲熱袍菌菌)、TliDNA聚合合酶(Thermococcuslitoralis海棲熱球菌菌)、PfuDNA聚合合酶(Pyrococcusfuriosus激烈火球菌菌)、PwoDNA聚合合酶(Pyrococcuswoesi沃氏火球菌菌)。六、逆轉(zhuǎn)錄錄酶①5’→3’聚合酶酶活性。逆逆轉(zhuǎn)錄酶能能以RNA或DNA為模板合合成DNA分子，但但是后者的的合成很慢慢；②RNA酶酶H活性。。能從5’’或3’方方向特異地地降解DNA/RNA雜交分分子中的RNA鏈。。商品化的逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄酶主要是是鳥(niǎo)類(lèi)骨髓母細(xì)細(xì)胞瘤病毒(avianmyeloblastosisvirus，AMV)逆轉(zhuǎn)錄酶酶和Moloney鼠白血病病毒毒(Moloneymurineleukemiavirus，，Mo-MLV)逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄酶。其用途有：①合成cDNA第一鏈，構(gòu)構(gòu)建cDNA文庫(kù)；②RT-PCR；③以RNA為為模板制備DNA探針；；④補(bǔ)平和標(biāo)記記5’-末端端突出的DNA片段；⑤代替Klenow酶用用于DNA序序列分析。第四節(jié)修修飾酶一、末端脫氧氧核苷酸轉(zhuǎn)移移酶(末端轉(zhuǎn)移酶)末端轉(zhuǎn)移酶能能在二價(jià)陽(yáng)離離子作用下，，催化DNA的聚合作用用，但不需要模板板，將脫氧核糖糖核苷酸加到到DNA分子子的3’-OH末端。AAAAAAMg2+dATP末端轉(zhuǎn)移酶效率高Co2+dATP末端轉(zhuǎn)移酶AAAAAAAAAAAAAAAAAAA效率低用途：①給載體和和外源DNA(如cDNA或隨機(jī)切割DNA)接上同聚物物尾，以便連連接；②末端標(biāo)記二、核酸酶核糖核酸酶(RNase)：水解RNA脫氧核糖核酸酶(DNase)：水解DNA核酸酶(nuclease)：水解RNA和DNA(一)核糖糖核酸酶1、核糖核酸酸酶A(RNaseA)RNaseA是一種內(nèi)切核糖核酸酸酶，可特異攻擊擊RNA上嘧啶殘基的3’端磷酸酯酯鍵。其反應(yīng)條件件極寬，且極極難失活。在在低鹽濃度(0~100mmol/LNaCl)下，RNaseA切割單鏈鏈和雙鏈RNA、DNA/RNA中中的RNA；；當(dāng)NaCl濃濃度為300mmol/L或更高高時(shí)，RNaseA就就特異性切割割單鏈RNA。RNaseA的用途:①確定RNA或DNA中中的單堿基突突變的位置；；②通過(guò)RNA雜交技術(shù)檢檢測(cè)特定RNA(特異降解單鏈鏈RNA，對(duì)對(duì)雜交雙鏈RNA不起作作用)，較northern雜交靈敏敏；③轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)點(diǎn)及內(nèi)含子剪剪接位點(diǎn)的分分析，其靈敏度比S1核酸酶分析法法高數(shù)倍；④降解DNA樣樣品中的RNA分子。2、核糖核酸酸酶T1RNaseT1也是是一種內(nèi)切核糖核酸酸酶，可特異攻擊擊RNA上鳥(niǎo)嘌呤殘基的的3’端磷酸酸酯鍵。其催化活性性與用途類(lèi)似似于RNaseA。3、核糖核酸酸酶HRNaseH特異地降解DNA/RNA雜交雙鏈鏈中的RNA鏈，產(chǎn)生具有3’-OH和和5’-磷酸酸末端的寡核核苷酸和單核核苷酸，不能能降解單鏈或或雙鏈的DNA或RNA。其用途是產(chǎn)生cDNA第二鏈合成成的引物。RNaseHPolIdNTPPolIdNTPDNA連接酶(二)脫氧核糖核酸酸酶IDNaseI是一種內(nèi)切脫脫氧核糖核酸酸酶，可從嘧嘧啶核苷酸5’-端磷酸酸隨機(jī)降解單單鏈或雙鏈DNA，生成成具有5’-磷酸末端的的寡核苷酸。。Mg2+Mn2+用途：①產(chǎn)生大腸腸桿菌DNA聚合酶I切切口平移的切切口；②在Mn2+存在下，產(chǎn)生生構(gòu)建基因因組文庫(kù)的大大片段DNA；③DNasel足跡法測(cè)測(cè)定DNA結(jié)結(jié)合蛋白在DNA上的精精確結(jié)合位點(diǎn)點(diǎn)；④除去RNA樣品中的的DNA。(三)S1核酸酶作用特點(diǎn)：①需要Zn2+和酸性條件(pH4.0~4.5)；②降解單鏈DNA或RNA，但降解解DNA的速速度大于降解解RNA的速速度(7倍)；③降解方式為為內(nèi)切和外切切，內(nèi)切為主主；④酶量過(guò)大時(shí)時(shí)也可降解雙雙鏈核酸，為為單鏈的1/75000。用途：①切掉DNA片段的單鏈鏈突出末端產(chǎn)產(chǎn)生平頭末端端；②在雙鏈cDNA合成時(shí)時(shí)切除發(fā)夾環(huán)環(huán)結(jié)構(gòu)；③S1核酸酶作作圖分析。如內(nèi)含子的數(shù)數(shù)目、大小、、位置分析及及轉(zhuǎn)錄起始位位點(diǎn)與終止位位點(diǎn)分析等。。內(nèi)含子數(shù)量及及大小的分析析DNAmRNA分子雜交RERES1核酸酶變性凝膠電泳MABM：分子量MarkerA：未經(jīng)S1酶處理B：經(jīng)S1酶處理但不能定位內(nèi)內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的的定位分析RERERE酶切堿性磷酸酯酶酶多核苷酸激酶酶**變性后與mRNA雜交*S1核酸酶*變性凝膠電泳泳MAB三、核酸外切切酶核酸外切酶(exonuclease)是一類(lèi)類(lèi)從多核苷酸酸鏈的末端開(kāi)開(kāi)始逐個(gè)降解解核苷酸的酶酶。單鏈核酸外切酶：E.coliexoⅠ、exoⅦ雙鏈核酸外切酶：exoⅢ單雙鏈核酸外切酶：Bal31核酸酶1、大腸桿菌菌核酸外切酶酶VII3’→5’外切酶酶活性5’→3’外外切酶活性用途:①抹平DNA末端；②②回收dA/dT接尾克克隆的cDNA。2、大腸桿菌菌核酸外切酶酶III3’→5’外切酶酶活性ExoIIIMg2+核酸外切酶活性PPExoIIIMg2+3’磷酸酶活性ExoIIIMg2+

ssDNA無(wú)反應(yīng)無(wú)嘌呤或無(wú)嘧啶位點(diǎn)ExoIIIMg2+核酸內(nèi)切酶活性RNA/DNA構(gòu)建單向缺失失突變體庫(kù)3’突出黏性性末端5’突出黏性性末端ExoIIIS1核酸酶克隆單向缺失突變體克隆3、Bal31核酸酶酶Bal31核酸酶酶主要為3’’外切酶活性性，同時(shí)伴有有5’外切及及較弱的內(nèi)切切活性，需要要Mg2+和Ca2+。①對(duì)于單鏈DNA，具有有特異的內(nèi)切切酶活性，可可從3’-OH末端迅速速降解DNA，而5’端端切割速率較較慢；②對(duì)于雙鏈DNA，具有有3’→5’’外切酶活性性和5’→3’外切酶活活性，以3’’外切酶活性性迅速降解一一條鏈，隨后后在互補(bǔ)鏈上上進(jìn)行緩慢的的5’端內(nèi)切切反應(yīng)，產(chǎn)物物大部分為5’端突出5個(gè)堿基的雙雙鏈分子(80%~90%)，少量量為帶平頭末末端的雙鏈分分子(10%~20%)。對(duì)雙鏈RNA分子也也能發(fā)生類(lèi)似似反應(yīng)；③當(dāng)共價(jià)閉合合環(huán)型雙鏈DNA上出現(xiàn)現(xiàn)單鏈缺口時(shí)時(shí)，通過(guò)其內(nèi)內(nèi)切酶活性，，將其切開(kāi)成成線性雙鏈DNA，并按按上述方式進(jìn)進(jìn)一步降解。。用途：與ExoIII相同，構(gòu)建建雙向缺失突突變體庫(kù)，分分析大片段DNA。四、T4噬菌菌體多核苷酸酸激酶催化ATP的的γ-磷酸基基團(tuán)轉(zhuǎn)移到單單鏈或雙鏈的的DNA或RNA的5’’-OH末端端。催化速度：雙鏈>單鏈鏈>雙鏈切口口或缺口；5’突出末端>平平末端>5’凹陷末端。T4多核苷酸激酶的激酶活性(正向反應(yīng))交換反應(yīng)(過(guò)量ADP存在時(shí))T4多核苷酸酸激酶的3’’磷酸酶活性性PPPPPPPNpPNPOHNpOHNOHOHT4多核苷酸激酶Mg2+pH6.0T4多核苷酸酸激酶的用途途①DNA的5’末端標(biāo)記記(如DNA的化化學(xué)測(cè)序)；②使DNA5’末端磷酸酸化，以便連連接(如銜接頭的克克隆方式)。

+五、堿性磷酸酸酶催化核酸分子子的脫磷作用用，使DNA或RNA或或核苷酸的5’磷酸變?yōu)闉?’-OH末端。細(xì)菌堿性磷酸酸酶(BAP)、小牛腸堿性磷磷酸酶(CIP)CIP的活性性比BAP高高10~20倍，反應(yīng)后后易失活(68℃10min)堿性磷酸酶的的用途①5’末端標(biāo)記記前的處理；②去除載體片段段的5’磷酸酸基因，防止止載體自身連連接?；蚬こ讨谐３Ｓ玫墓ぞ呙该腹ぞ呙腹δ芟拗菩院怂醿?nèi)切酶特異切割DNA，產(chǎn)生具有特定末端的DNA片段DNA連接酶DNA片段間連接，產(chǎn)生重組DNA分子DNA聚合酶Ⅰ合成雙鏈cDNA分子切口平移制作高比活探針DNA序列分析填補(bǔ)3′末端Klenow片段cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3末端標(biāo)記等TaqDNA聚合酶PCR反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA替代DNA聚合酶I進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羥基末端磷酸化，或末端標(biāo)記堿性磷酸酶防止載體自身連接末端轉(zhuǎn)移酶同聚物加尾連接9、靜夜四無(wú)無(wú)鄰，荒居居舊業(yè)貧。。。12月-2212月-22Thursday,December29,202210、雨中黃葉樹(shù)樹(shù)，燈下白頭頭人。。11:16:5311:16:5311:1612/29/202211:16:53AM11、以我獨(dú)沈沈久，愧君君相見(jiàn)頻。。。12月-2211:16:531