流式基礎(chǔ)原理

BD公司生物科學(xué)部流式基礎(chǔ)原理流式基本概念流式細胞術(shù)的基本概念流式細胞術(shù)（FlowCytometry,簡稱FCM）是一種可以快速、準確、客觀，并且能夠同時檢測快速直線流動狀態(tài)中的單個細胞的多項物理及生物學(xué)特性，加以分析定量的技術(shù)，同時可以對特定群體加以分選。流式細胞儀（FlowCytometer）集激光技術(shù)、電子物理技術(shù)、光電測量技術(shù)、電子計算機技術(shù)、細胞熒光化學(xué)技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)為一體的一種新型高科技儀器。流式細胞術(shù)的特點檢測速度快，分析樣本量大：在極短時間內(nèi)可分析大量細胞，這是流式不同于其他細胞分析儀器的主要特點，只要標本中的細胞數(shù)量足夠，流式細胞儀可以每秒鐘成千上萬個細胞的速率進行測量，測量的細胞總數(shù)可達數(shù)千、數(shù)萬乃至數(shù)百萬個可同時分析單個細胞的多種特征：使用不同熒光素標記的單克隆抗體或熒光染料對細胞進行多色熒光染色，通過流式細胞分析，可獲得單細胞的多種信息，使細胞亞群的識別、計數(shù)更為準確強大的分選功能：在分析的同時可以對特定群體加以分選流式檢測的樣本可檢測的樣本種類多樣：各種細胞（如外周血，骨髓，細針穿刺，灌洗液，實體組織，懸浮或貼壁培養(yǎng)的細胞），微生物，人工合成微球等New!血清、血漿、培養(yǎng)上清、細胞裂解液樣本制備：單細胞懸液（天然，機械研磨/消化）5×105～1×107cells/ml，約～1ml，300目篩網(wǎng)過濾流式細胞儀的檢測范圍

細胞結(jié)構(gòu)細胞大小細胞顆粒度細胞表面積核漿比例DNA含量與細胞周期RNA含量蛋白質(zhì)含量……

細胞功能細胞表面/胞漿/核的特異性抗原細胞活性細胞內(nèi)/外的細胞因子激素結(jié)合位點、細胞受體蛋白磷酸化pH值鈣離子濃度細胞膜電位、線粒體膜電位……流式細胞儀

的檢測信號散射光信號當細胞顆粒通過聚集的激光束時，激光向各個方向散射。與激光束方向同軸的稱前向角散射光信號（FSC）。與激光束垂直的稱為側(cè)向角散射光信號（SSC）。散射光信號RightAngleLightDetector

CellComplexitySSCForwardLightDetector

CellSurfaceArea

FSCIncidentLightSource前向角散射光（FSC,ForwardScatter）

細胞相對大小及其表面積

側(cè)向角散射光（SSC,SideScatter）

細胞顆粒度及細胞內(nèi)細胞器的相對復(fù)雜性前向角散射光信號側(cè)向角散射光信號外周全血細胞散射光雙參數(shù)點圖

（紅細胞溶解后）

顆粒雜質(zhì)、氣泡對檢測的影響熒光信號使用不同熒光標記的單克隆抗體染色，做多色分析熒光信號的強弱，反映了細胞抗原的表達含量熒光樣本制備雙色直接染色熒光素的激發(fā)和發(fā)射光譜任何發(fā)熒光的物質(zhì)分子都具有這兩個特征光譜（nm）激發(fā)光譜（Excitation，Ex）：是指能特異性地激發(fā)某種熒光素的一定波長范圍內(nèi)的光線，也稱為吸收光譜。吸收波峰（最大吸收波長）：Ex-Max發(fā)射光譜（Emission，Em）：是指某一波長激發(fā)光引起熒光素發(fā)射的一定波長范圍內(nèi)的熒光發(fā)射波峰（最大發(fā)射波長）：Em-Max熒光素的使用：選擇正確的激光器確定所需探測器（PMT）區(qū)別488nm520nm異硫氰酸熒光素（FITC）光學(xué)系統(tǒng)：濾光片如何將一束混合的熒光區(qū)分開來，分別進行收集呢？濾光片置于熒光探測器前，限定其接收的熒光的波長范圍Longpass(LP)Shortpass(SP)Bandpass(BP)460500540460500540460500540SP500LP500BP500/50FACSCalibur光學(xué)濾片檢測器組（激光器）PMT位置帶通/長通透鏡適用染料488nm藍色激光FL1530/30FITCFL2585/42PE,PIFL3670LPPerCP,PerCP-Cy5.5,PE-Cy7635nm紅色激光FL4661/16APCFluorescenceSpectrumViewerFluorescenceSpectrumViewerFluorescenceSpectrumViewerFluorescenceSpectrumViewerFluorescenceSpectrumViewerFluorescenceSpectrumViewerFluorescenceSpectrumViewer流式數(shù)據(jù)分析形式數(shù)據(jù)存儲格式常以列表模式（LISTMODE)：將每個細胞的每個檢測參量依次排列順序存儲FITC/PE雙染樣本數(shù)據(jù)顯示直方圖（Histogram）二維點圖（DotPlot）等高線圖（ContourPlot）密度圖（Density）三維圖（3DPlot）等單參數(shù)直方圖分析熒光峰的高低即在縱軸對應(yīng)的高度反映了？熒光峰的高低即在縱軸對應(yīng)的高度反映了具有此種熒光強度的細胞在樣本中所占比例的相對多少，而非絕對數(shù)目雙參數(shù)散點圖分析等高圖和密度圖流式細胞儀的組成

和工作原理液流系統(tǒng)：鞘液包繞著單行排列的細胞依次高速通過流動池，而激光聚焦于流動池中心的樣本流上，隨后經(jīng)檢測的樣本和鞘液流向廢液桶。光學(xué)系統(tǒng)：經(jīng)熒光染色的細胞在激光的照射下產(chǎn)生散射光和熒光信號，同時被前向光電二極管和一組光電倍增管（PMT）接收，熒光信號經(jīng)一系列雙色性反射鏡和帶通或長通濾光片的分離，形成多個不同波長的熒光信號電子系統(tǒng)：熒光信號和散射光信號經(jīng)二極管和PMT接收后可轉(zhuǎn)換為電信號，再通過模/數(shù)轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換為可被計算機識別的數(shù)字信號，以列表模式存儲，最終以圖形形式呈現(xiàn)流式對照的設(shè)置熒光染色對照的設(shè)置1陰性對照空白對照自發(fā)熒光，即不經(jīng)熒光染色細胞內(nèi)部熒光分子經(jīng)光照發(fā)出的熒光。自發(fā)熒光信號為噪聲信號。一般說來，細胞成分中能產(chǎn)生自發(fā)熒光的分子（核黃素、細胞色素等）的含量越高，自發(fā)熒光越強，如腫瘤細胞、粒細胞等；樣本死細胞比例越高自發(fā)熒光越強實驗樣本特異熒光，即抗體F(ab’)2段與細胞抗原特異結(jié)合上的熒光染料受光照發(fā)出的熒光非特異熒光，即抗體Fc段與細胞表面的Fc受體非特異結(jié)合上的熒光染料受光照發(fā)出的熒光自發(fā)熒光＋特異熒光＋非特異熒光同型對照（自發(fā)熒光＋非特異熒光）合適？同型對照同型對照（IsotypeControl）：與實驗染色的單克隆抗體特異性無關(guān)的免疫球蛋白亞型（即Fc段相同，F(xiàn)(ab’)2段不同）與染色的單克隆抗體①相同種屬來源②相同免疫球蛋白及亞型③相同熒光素標記④相同劑量和濃度⑤但由未免疫動物血清純化而來用于消除由于抗體非特異性結(jié)合到細胞表面的Fc受體而產(chǎn)生的背景染色例如，標記FITC的單克隆抗體為小鼠IgG1亞類抗體，標記PE的單克隆抗體為小鼠IgG2a亞類抗體，同型對照應(yīng)用相同濃度和劑量的未免疫小鼠血清的純化IgG1（γ1）和IgG2a（γ2a），并分別標記FITC和PE商業(yè)化熒光素的發(fā)射光譜spectraloverlapFluorescenceSpectrumViewerspectraloverlap如何解決？熒光染色對照的設(shè)置2補償對照（雙色或多色分析中，熒光素發(fā)射光譜重疊時）熒光補償（compensation）是指在流式細胞多色分析中，糾正熒光素發(fā)射光譜重疊（spectraloverlap）的過程，即從一個被檢測的熒光信號中去除任何其他的干擾熒光信號已染色樣本？真雙陽？假雙陽？熒光染色對照的設(shè)置2補償對照（雙色或多色分析中，熒光素發(fā)射光譜重疊時）熒光補償（compensation）使用單種熒光素標記的單克隆抗體和其余熒光素對應(yīng)的同型對照抗體分別進行染色

※幾色分析需要制備幾個補償對照管分析類型管功能加入的抗體雙色分析1Isotypeγ1-FITCγ2a-PE2Compensation1A-FITCγ2a-PE3Compensation2γ1-FITCB-PE4Sample1,2……A-FITCB-PENo.AntibodyIsotypeMouseanti-human未免疫Mouse血清純化而來1A-FITC（γ1）γ1-FITC2B-PE（γ2a）