核酸檢測實驗室建立與應(yīng)用

核酸檢測實驗室建立與應(yīng)用衛(wèi)生部臨檢中心深圳市血液中心血液病毒核酸檢測聯(lián)合實驗室葉賢林核酸檢測實驗室建立與應(yīng)用核酸擴增檢測實驗室的建立人員場地檢測方法選擇實施方案依據(jù)：衛(wèi)生部頒發(fā)的《臨床基因擴增檢驗實驗室管理暫行辦法》（衛(wèi)醫(yī)發(fā)[2002]10號）2023/1/122核酸檢測實驗室建立與應(yīng)用核酸實驗室人員要求資質(zhì):經(jīng)過臨檢中心PCR培訓(xùn)班培訓(xùn)并取得上崗證；通過血站核酸實驗室崗前培訓(xùn)考試合格。培訓(xùn):①無”核酸”的概念形成,②防污染的概念③良好工作習(xí)慣的培養(yǎng).④報告的正確發(fā)放.后備人員的培養(yǎng).2023/1/123核酸檢測實驗室建立與應(yīng)用試劑準(zhǔn)備區(qū)標(biāo)本制備區(qū)擴增區(qū)及擴增產(chǎn)物分析區(qū)樣本離心交接區(qū)報告發(fā)放區(qū)核酸實驗場地2023/1/124核酸檢測實驗室建立與應(yīng)用

方法選擇:TMA與PCRTMAPCR擴增原理模擬自然DNA轉(zhuǎn)錄成mRNA的過程模擬自然DNA復(fù)制的過程靶目標(biāo)RNADNA酶MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶及T7RNA聚合酶DNA聚合酶反應(yīng)體系兩種酶，兩條引物，dNTP,NTP一種酶，一對引物，dNTP溫度條件恒溫（41.5℃）循環(huán)導(dǎo)熱（變性，退火，延伸）擴增儀器水浴箱或者加熱塊熱循環(huán)儀擴增產(chǎn)物RNADNA擴增速度每個循環(huán)可以生成100-1000個復(fù)制物，在15-30分鐘內(nèi)可增加10億倍復(fù)制物以2n擴增，2～3h就能將待擴目的基因擴增放大10億倍2023/1/125核酸檢測實驗室建立與應(yīng)用TMA的優(yōu)點缺點自動化程度高靈敏度高擴增效率高：10n

不能絕對定量2023/1/126核酸檢測實驗室建立與應(yīng)用PCR的優(yōu)點缺點易于自動化靈敏度高

擴增效率高匯集拆分過程繁瑣

拆分可減低非反應(yīng)性比率2023/1/127核酸檢測實驗室建立與應(yīng)用核酸試劑質(zhì)控試劑的確認試劑運輸過程的控制(溫度\條件\時限)

靈敏度的要求內(nèi)標(biāo)的要求試劑涵蓋的基因型

2023/1/128核酸檢測實驗室建立與應(yīng)用檢測流程(1):常規(guī)篩查合格匯集標(biāo)本檢測流程2023/1/129核酸檢測實驗室建立與應(yīng)用檢測流程(2):常規(guī)篩查合格單人份標(biāo)本檢測流程2023/1/1210核酸檢測實驗室建立與應(yīng)用檢測流程(3):平行檢測流程樣本清點交接核酸單份檢測常規(guī)檢測合格標(biāo)本不合格標(biāo)本陰性標(biāo)本反應(yīng)性標(biāo)本合格標(biāo)本發(fā)布結(jié)果單項目反應(yīng)性無反應(yīng)性

陽性或可疑結(jié)果淘汰

陽性或可疑結(jié)果淘汰2023/1/1211核酸檢測實驗室建立與應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP)的編寫核酸實驗室設(shè)置與管理規(guī)范核酸實驗室標(biāo)本檢測流程核酸實驗室崗位職責(zé)核酸實驗室關(guān)鍵試劑管理規(guī)范核酸實驗室儀器設(shè)備管理規(guī)范核酸實驗室檢測標(biāo)本管理規(guī)范核酸實驗室室間質(zhì)量評價規(guī)范核酸實驗室記錄管理制度核酸實驗室生物防護規(guī)范核酸反應(yīng)性獻血者追蹤規(guī)程核酸實驗室檢測應(yīng)急措施2023/1/1212核酸檢測實驗室建立與應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP)的編寫核酸標(biāo)本離心交接操作規(guī)程核酸標(biāo)本提取及匯集操作規(guī)程(科華)核酸標(biāo)本擴增檢測操作規(guī)程（科華）核酸標(biāo)本全自動檢測分析系統(tǒng)操作規(guī)程（CHIRON）核酸標(biāo)本檢測報告發(fā)布操作規(guī)程（唐山軟件）核酸標(biāo)本檢測復(fù)檢操作規(guī)程生物安全柜標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程可移動紫外線燈標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程低溫高速離心機標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程ABI7300型核酸擴增熒光檢測儀標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程2023/1/1213核酸檢測實驗室建立與應(yīng)用

核酸實驗室防污染措施主要的污染源擴增產(chǎn)物標(biāo)本之間產(chǎn)生的氣溶膠操作人員手衣服2023/1/1214核酸檢測實驗室建立與應(yīng)用核酸實驗室防污染措施要有獨立的空氣處理系統(tǒng).各區(qū)始終處于完全分隔的狀態(tài)，不能有空氣的直接相通實驗室保持合理的通風(fēng)對各區(qū)內(nèi)的設(shè)備、物料進行標(biāo)示，專區(qū)專用；其他物品不得混用（例如：筆、紙張）空氣：試劑準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本制備區(qū)→擴增區(qū)→產(chǎn)物分析區(qū)試劑陽性對照儲存在標(biāo)本制備區(qū)使用帶濾芯的吸頭2023/1/1215核酸檢測實驗室建立與應(yīng)用核酸實驗室防污染措施使用外排式的生物安全柜自配試劑應(yīng)分裝成小規(guī)格，未用完的試劑應(yīng)廢棄使用次氯酸鈉溶液消毒（臺面、地面）使用1mol/L的HCL溶液（吸頭）使用紫外線照射（空氣和臺面）使用無水乙醇溶液（空氣噴霧）2023/1/1216核酸檢測實驗室建立與應(yīng)用核酸實驗室污染后措施實驗室污染后，如何處理？通風(fēng)次氯酸鈉溶液（擴增區(qū)不宜使用）HCL溶液（吸頭）紫外線（固定、移動）酒精噴灑（空氣）應(yīng)設(shè)計有備用實驗室

:如開設(shè)獨立的報告發(fā)放區(qū)作為備用2023/1/1217核酸檢測實驗室建立與應(yīng)用中心理念：監(jiān)測全程的實驗過程包含病毒核酸提取、反轉(zhuǎn)錄及擴增過程的效率。血篩核酸檢測的內(nèi)標(biāo)的作用內(nèi)標(biāo)的作用質(zhì)控整個反應(yīng)。提示假陰性檢測結(jié)果。監(jiān)控反應(yīng)的外部條件內(nèi)標(biāo)濃度要合適保持適度的內(nèi)標(biāo)失控.(<0.2%)2023/1/1218核酸檢測實驗室建立與應(yīng)用核酸試劑靈敏度評估概率單位回歸分析(PROBIT）用于描述劑量-反應(yīng)或不同因素間的劑量-反應(yīng)比較，反應(yīng)結(jié)果應(yīng)該是以二分類形式表達的。概率單位的回歸方程為：

PROBITPi=A+BXi2023/1/1219核酸檢測實驗室建立與應(yīng)用

用國際標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成不同濃度評估血液HBV核酸篩查方法，結(jié)果如下。請計算95%的檢出限量及可信范圍CI

序號濃度（IU/ml）陽性數(shù)/重復(fù)數(shù)

概率15003/310021006/61003508/81004307/887.55104/850652/825710/502023/1/1220核酸檢測實驗室建立與應(yīng)用

AnalysisofParameterEstimates

Standard95%ConfidenceChi-

ParameterDFEstimateErrorLimitsSquarePr>ChiSq

Intercept1-4.68521.5659-7.7542-1.61618.950.0028

log10(Dose)14.80001.46991.91907.681010.660.0011

應(yīng)用SAS9.0軟件PROBIT分析結(jié)果2023/1/1221核酸檢測實驗室建立與應(yīng)用

ProbitAnalysisonDoseProbabilityDose95%FiducialLimits0.509.570175.1203815.551100.5510.631756.0286917.840470.6011.831137.0273720.773340.6513.213168.1239224.640980.7014.844679.3358129.907500.7516.8320510.6994437.369630.8019.3597312.2864148.541110.8522.7890014.2417966.740000.9027.9795316.90417101.074790.9129.4011617.58727111.931570.9231.0275518.34915125.130150.9332.9198819.21204141.541650.9435.1700620.20878162.548510.9537.9247421.39086190.498222023/1/1222核酸檢測實驗室建立與應(yīng)用2023/1/1223核酸檢測實驗室建立與應(yīng)用陽性獻血者的追蹤溝通原則:專業(yè)授權(quán)、人性化、保密、尊敬。溝通方式：電話、面談溝通技巧：表揚和鼓勵、合理解釋、知情、適當(dāng)?shù)膯柡?023/1/1224核酸檢測實驗室建立與應(yīng)用獻血者核酸檢測不合格解釋由于核酸檢測方法目前尚不能排除假陽性，對實驗過程要求極高，另外乙肝和丙肝病毒進入人體后，人體又有清除現(xiàn)象，但血液不能用于臨床，因此核酸檢測不合格血液僅表示該血液不能用于臨床輸血。不作為獻血者健康體檢指標(biāo)。更不宜作為疾病診療指標(biāo)。獻血者獻血權(quán)利仍保留。2023/1/1225核酸檢測實驗室建立與應(yīng)用關(guān)于核酸檢測的解釋匯集結(jié)果成反應(yīng)性,拆分結(jié)果為陰性.內(nèi)標(biāo)失敗.ELISA(+),核酸結(jié)果為(-)ELISA(-),核酸結(jié)果為(+)核酸單檢結(jié)果反應(yīng)性與血液發(fā)放.化學(xué)發(fā)光法與核酸檢測.2023/1/1226核酸檢測實驗室建立與應(yīng)用1.靈敏度：匯集池大小要滿足靈敏度要求。靈敏度太低，病毒低載量獻血者漏檢。HBVDNA靈敏度宜50拷貝/ml.2.引物是否有效性,能否檢測亞型和突變株感染。3.假陽性，防污染措施（血篩主要要防止RNA酶的污染）。4.核酸提取效率與自動化.5.需要規(guī)范化場地和高素質(zhì)的操作人員.6.參加國際間室間質(zhì)控,提高檢測水準(zhǔn).血液核酸篩查注意的問題2023/1/1227核酸檢測實驗室建立與應(yīng)用深圳血液中心核酸檢測概況對161228人份酶免疫檢測結(jié)果陰性標(biāo)本進行核酸檢測，共檢出33例不相同HBVDNA陽性獻血者，總比率為1：4885。檢出anti-HCV陰性、HCVRNA陽性1例，定量結(jié)果為1.2×105IU/ml。3個月后追蹤結(jié)果發(fā)現(xiàn)anti-HCV（+），ALT由正常升高至700U/L。2023/1/1228核酸檢測實驗室建立與應(yīng)用項目科華（自動化）科華（半自動化）美國羅氏上海浩源凱榮（CHIRON）方法學(xué)全自動提取+實時熒光PCR病毒離心富集+半自動提取+實時熒光PCR全自動提取+PCR-ELISA半自動提取+PCR+毛細管電泳分離TMA匯集量8×45ul8×150ul24×45ul5×200ul500ul單人份檢測數(shù)6849637041315121412514603HBVDNA陽性數(shù)122838HBV陽性比率1：57081：185211：39391：47081：1825深圳血液中心核酸檢測概況2023/1/1229核酸檢測實驗室建立與應(yīng)用HBVDNA陽性獻血者追蹤情況

對17位HBVDNA陽性獻血者進行了追蹤，9位獻血者發(fā)生血清轉(zhuǎn)換現(xiàn)象。4例呈窗口期特征（或部分），2例獻血者發(fā)現(xiàn)病毒感染后自愈現(xiàn)象1例獻血者原為乙肝大三陽患者，經(jīng)治療后HBsAg轉(zhuǎn)陰后，獻血，常規(guī)檢測為合格，核酸檢測HBVDNA（+），經(jīng)追蹤后HBsAg變?yōu)殛栃?023/1/1230核酸檢測實驗室建立與應(yīng)用2023/1/1231核酸檢測實驗室建立與應(yīng)用2023/1/1232核酸檢測實驗室建立與應(yīng)用2023/1/1233核酸檢測實驗室建立與應(yīng)用2023/1/1234核酸檢測實驗室建立與應(yīng)用2023/1/1235核酸檢測實驗室建立與應(yīng)用

HBVDNA檢測陽性獻血者追蹤概況追蹤時間(d)ALT（IU/L）HBsAgHBsAg抗-HBs抗-HBcHBeAg抗-HBeDNA（cp/ml）1(03/10/23)18－－－＋－＋+2124－－－＋－＋1504528＋－－＋－＋未檢出9126＋－－＋－＋未檢出15631＋－－＋－＋未