無菌檢查法實驗（直接接種法）

實訓(xùn)葡萄糖注射劑的無菌檢查（一）實訓(xùn)目的1．掌握常用注射用藥的無菌檢查法及其結(jié)果的判定與分析；2．熟悉不同類型的藥物應(yīng)采取的微生物學(xué)檢查方法；3．了解無菌制劑進(jìn)行無菌檢查的幾種常用培養(yǎng)基。

無菌檢查法是指檢查藥物制劑是否含有活的微生物的一種方法。各種注射劑(如針劑、輸液等)、手術(shù)眼科制劑都必須保證不含有任何活的微生物，應(yīng)絕對無菌才算合格。

無菌檢查是利用無菌操作的方法，將被檢查的藥品分別加入適合需氧菌、厭氧菌和真菌生長的液體培養(yǎng)基中，置于適宜溫度下培養(yǎng)一定時間后，觀察有無微生物生長，以判斷藥品是否合格。（二）實訓(xùn)原理

（三）材料和用具

金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]為陽性對照菌。硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，改良馬丁培養(yǎng)基。無菌注射劑、移液管、滴管、注射器、試管、消毒劑(碘酒、酒精棉球)、酒精燈等。（四）操作步驟

本品采用直接接種法。

1．供試品處理取規(guī)定量供試品分別接種至含硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基的容器中。每個容器中培養(yǎng)基的用量應(yīng)符合接種的供試品體積不得大于培養(yǎng)基體積的10%，同時，硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基每管裝量不少于15ml，改良馬丁培養(yǎng)基每管裝量不少于10ml。2．無菌檢查實訓(xùn)操作（1）取樣待測藥品的抽樣方法及不同類型供試品的制備方法，應(yīng)按照《中國藥典》的規(guī)定進(jìn)行。本試驗藥品為注射劑，可任意抽取4支，用砂輪在安瓿頸部劃一環(huán)形線，用碘酒、酒精棉球消毒安瓿外表面，待干后將其打開。

表

待檢無菌制劑接種量和培養(yǎng)基用量

無菌藥品類型/ml每支取量/ml培養(yǎng)基用量/ml2以下0.5152～201.01520以上5.015（2）接種用無菌注射器取處理后的供試品，分別加入需氧菌、厭氧菌、真菌培養(yǎng)基中，混勻。每種培養(yǎng)基各接種兩管。YourTitleHere（3）陽性對照用1支無菌移液管分別取上述陽性對照菌菌液lml，接種于培養(yǎng)基試管中，作為陽性對照。（4）陰性對照不加任何菌或加入與供試液相等量的稀釋劑的培養(yǎng)基試管為陰性對照。

（5）培養(yǎng)將上述試驗管、陽性對照管、陰性對照管按中國藥典規(guī)定的溫度及時間進(jìn)行培養(yǎng)。

表

檢查用培養(yǎng)基類型、數(shù)量、培養(yǎng)溫度及培養(yǎng)時間培養(yǎng)基類型培養(yǎng)溫度(℃)培養(yǎng)時間(天)培養(yǎng)基數(shù)量(個)試驗管對照管需氧菌培養(yǎng)基30~351422厭氧菌培養(yǎng)基30~351422真菌培養(yǎng)基23~281422（6）結(jié)果判定＊陰性對照管：應(yīng)無菌生長，培養(yǎng)基液體澄清無變化。＊陽性對照管：陽性對照管培養(yǎng)48-72小時應(yīng)生長良好，各管應(yīng)變混濁，表明有菌生長。且可涂片、染色、鏡檢證實為陽性對照菌。

＊

試驗管：

(1)若三種培養(yǎng)基各管均澄清，或雖混濁，但經(jīng)證實無菌生長，判為供試品符合規(guī)定；(2)若任何一培養(yǎng)基試管混濁，并經(jīng)證實有菌生長，判為供試品不符合規(guī)定。除非能充分證明試驗結(jié)果無效，即生長的微生物非供試品所含。試驗若經(jīng)確認(rèn)無效則需重試，重試時重新取同量供試品依法檢查，若無菌生長，判供試品符合規(guī)定；若有菌生長，判供試品不符合規(guī)定。注意：試驗中要與樣品管同時平行做陽性對照和陰性對照。

（五）實訓(xùn)結(jié)果無菌試驗結(jié)果記錄品名：

注射液

批

號：

規(guī)格：

檢驗日期：

檢定依據(jù)：2010年版《中國藥典》檢測環(huán)境：溫度：

濕度：

培養(yǎng)箱（Ⅰ）：

培養(yǎng)箱（Ⅱ）：

培養(yǎng)基種類、溫度及裝量：液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基（Ⅰ批號：

）：培養(yǎng)需養(yǎng)菌、厭養(yǎng)菌、陽性菌及陰性對照，溫度30~35℃，裝量100ml。改良馬丁培養(yǎng)基（Ⅱ批號：

）：培養(yǎng)真菌，溫度23~28℃，裝量100ml。營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（Ⅲ批號：

）：培養(yǎng)對照菌，溫度30~35℃，裝量10ml。對照菌：菌液制備：取對照菌一白金耳，接種于10ml（Ⅲ）培養(yǎng)基內(nèi)，經(jīng)30~35℃培養(yǎng)18~24小時后，用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍遞增稀釋至每毫升小于100個菌，備用。樣品處理：取樣

，全量通過全封閉式薄膜過濾器過濾后，再分別注入上述培養(yǎng)基，置30~35℃（Ⅰ）及23~28℃（Ⅱ）培養(yǎng)。觀察結(jié)果如下：（五）實訓(xùn)結(jié)果培養(yǎng)天數(shù)1234567891011121314硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基（30~35℃）供試品陰性對照陽性對照改良馬丁培養(yǎng)基（23~28℃）供試品陰性對照陽性對照結(jié)論：檢驗人：

復(fù)核人：

1.直接接種法適用于無抗菌作用的供試品的無菌檢查。2.操作中做了供試品接種、陽性對照和陰性對照實驗，同學(xué)們都學(xué)會了判斷試驗結(jié)果。3.試驗結(jié)束后請大家注意，