植物細(xì)胞組織培養(yǎng)緒論

植物細(xì)胞組織培養(yǎng)緒論第一講緒論概念及基本原理植物細(xì)胞組織培養(yǎng)的過程簡介植物細(xì)胞培養(yǎng)的發(fā)展簡史本門課程的基本框架植物組織培養(yǎng)的應(yīng)用2一、概念及基本原理（一）概念：植物細(xì)胞組織培養(yǎng)(PlantCellandTissueCulture):分離植物體的一部分甚至單個細(xì)胞，離體培養(yǎng)于合適的培養(yǎng)介質(zhì)上/中（無菌條件下的培養(yǎng)基/培養(yǎng)液），在可控培養(yǎng)條件下進(jìn)行繁殖及生長3外植體（Explant）：由活植物體上切取下來以進(jìn)行培養(yǎng)的那部分組織或器官叫做外植體脫分化（Dedifferentiation）：由高度分化的植物器官、組織或細(xì)胞產(chǎn)生愈傷組織的過程，稱為植物細(xì)胞的脫分化愈傷組織（Callus）：外植體脫分化后，形成的具有分生能力的薄壁細(xì)胞團(tuán)再分化（Redifferentiation）：脫分化產(chǎn)生的愈傷組織繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)又可以重新分化成根或芽等器官，這一過程稱為植物細(xì)胞的再分化植物組織培養(yǎng)中的幾個概念4（二）植物組織培養(yǎng)類型：根據(jù)不同分類的依據(jù)可以分為不同類型。

1、根據(jù)培養(yǎng)材料不同分為：（1）完整植株培養(yǎng)（PlantCulture）：對幼苗和較大植株等的培養(yǎng)。（2）胚胎培養(yǎng)（EmbryoCulture）：包括成熟胚、幼胚、子房、胚珠等的培養(yǎng)。（3）器官培養(yǎng)（OrganCulture）：包括離體根、莖、葉、果實(shí)、種子、花器官的培養(yǎng)。（4）組織培養(yǎng)（TissueCulture）：如分生組織、薄壁組織、輸導(dǎo)組織培養(yǎng)。（5）細(xì)胞培養(yǎng)（CellCulture）：指對單細(xì)胞或較小的細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行培養(yǎng)。（6）原生質(zhì)體培養(yǎng)（ProtoplastCulture）：指對去掉細(xì)胞壁后所獲得的原生質(zhì)體進(jìn)行培養(yǎng)。

5矮牽牛莖尖離體培養(yǎng)6

牡丹成熟胚的離體培養(yǎng)與快速繁殖7微型月季莖段離體培養(yǎng)8花燭葉片離體快速繁殖9大蒜根尖培養(yǎng)及植株再生102、根據(jù)再生途徑分為：（1）器官發(fā)生途徑（Organogenesis）：直接器官發(fā)生途徑：植物器官可以直接由外植體上誘導(dǎo)。如莖尖培養(yǎng)。間接器官發(fā)生途徑：成熟細(xì)胞經(jīng)過脫分化（dedifferentiation）及再分化（redifferentiation）過程而形成新的組織和器官的過程。如葉片培養(yǎng)。（2）體細(xì)胞胚胎發(fā)生（Somaticembryogenesis）：體胚發(fā)生途徑是指二倍體或單倍體的體細(xì)胞在特定條件下未經(jīng)性細(xì)胞融合而通過與合子胚發(fā)生類似的途徑發(fā)育出新個體的形態(tài)發(fā)生過程。經(jīng)體胚發(fā)生形成類似合子胚的結(jié)構(gòu)稱為胚狀體（embryoid）或體細(xì)胞胚(somaticembryo).

11直接器官發(fā)生間接器官發(fā)生體細(xì)胞胚胎發(fā)生12貫葉金絲桃不定芽直接再生過程13優(yōu)化培養(yǎng)基無蔗糖1%蔗糖5%蔗糖

無BAPBAP0.1mg/lBAP5.0mg/l無NAA非洲紫羅蘭葉片直接培養(yǎng)14臺灣百合離體培養(yǎng)15大花蕙蘭原球莖增殖與植株再生器官發(fā)生途徑（原球莖的形成）：16大蒜愈傷組織培養(yǎng)17禾本科牧草的體胚發(fā)生過程18菊花體細(xì)胞胚胎發(fā)生及植株再生19大蒜體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程目前，已在200多種被子植物中觀察到體細(xì)胞胚發(fā)生過程20人工種子（Artificialseed，SyntheticSeed）：是指植物離體培養(yǎng)產(chǎn)生的胚狀體或不定芽被包裹在含有營養(yǎng)和保護(hù)功能的人工胚乳和人工種皮中，從而形成能發(fā)芽出苗的顆粒體作為繁殖材料。21223、根據(jù)培養(yǎng)基的類型分為:

（1）固體培養(yǎng)（Solidculture）:瓊脂、卡拉膠等固化。（2）半液半固體培養(yǎng)(SemisolidCulture)：固液雙層。（3）液體培養(yǎng)(LiquidCulture)：震蕩、旋轉(zhuǎn)或靜置培養(yǎng)。23固體培養(yǎng)：液體培養(yǎng)24細(xì)胞懸浮培養(yǎng)(PlantCellCulture)

指對植物器官或愈傷組織上分離出來的單細(xì)胞(或小細(xì)胞團(tuán))進(jìn)行培養(yǎng)，形成單細(xì)胞無性系或再生植物的技術(shù)253基本原理：細(xì)胞學(xué)說及細(xì)胞全能性26a,細(xì)胞學(xué)說（celltheory）最初由德國植物學(xué)家施萊登（M.Schleiden）和德國動物學(xué)家施萬(T.Schwann)提出的學(xué)說。一切生物都由細(xì)胞組成細(xì)胞是生命的結(jié)構(gòu)單位細(xì)胞只能由細(xì)胞分裂而來27b,細(xì)胞全能性（totipotency）指多細(xì)胞生物的每個細(xì)胞都包含著該物種的全部遺傳信息，具備在合適條件下發(fā)育成完整生物體的潛在遺傳能力細(xì)胞全能性高低與細(xì)胞分化程度有關(guān)。分化程度越高，細(xì)胞全能性越低植物細(xì)胞全能性高于動物細(xì)胞，而生殖細(xì)胞全能性高于體細(xì)胞，在所有細(xì)胞中受精卵的全能性最高28二、植物細(xì)胞組織培養(yǎng)的過程簡介離體的植物器官、組織、細(xì)胞（外植體）愈傷組織叢芽不定根植物體脫分化再分化29結(jié)果及目的含有全部營養(yǎng)成分的培養(yǎng)基、無菌環(huán)境、一定的溫度、空氣、適合的PH、適時光照等離體的植物器官、組織、細(xì)胞獲得穩(wěn)定細(xì)胞培養(yǎng)系或再生完整植株培養(yǎng)條件培養(yǎng)對象30三、植物細(xì)胞培養(yǎng)的發(fā)展簡史31

探索階段Haberlandt1902發(fā)表了以紫鴨跖草(Tradescantia)部分葉片柵欄組織的組織培養(yǎng)現(xiàn)象。僅觀察到細(xì)胞的生長及細(xì)胞壁的加厚，未見細(xì)胞分裂直到1920–1930年左右，由于動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的突破產(chǎn)生的推動，植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)才重新開始起步32Robbins與Kotter于1922年分別報道離體培養(yǎng)根尖獲得成功Rehwald1927以胡蘿卜及其它植物為材料，使植外體免受病原物感染，并形成愈傷組織Laibach（1929），將亞麻種間雜交幼胚體外培養(yǎng)成熟，證明了胚培養(yǎng)在植物遠(yuǎn)緣雜交的可能性33奠基階段1933年，李繼侗和沈同研究銀杏的胚培養(yǎng)，將銀杏胚乳提取物加入培養(yǎng)基1934年，White用番茄根建立了第一個活躍生長的無性系，使根的離體培養(yǎng)首次獲得了真正成功；1937年，他將3種B族維生素（吡哆醇、硫胺素及煙酸）代替酵母提取物并獲成功1934年，Gautheret發(fā)現(xiàn)了在挪威槭（Acerpseudoplatanus

）形成層細(xì)胞體外的細(xì)胞分裂及生長，但這些愈傷組織在18個月后停止生長該時期，吲哚乙酸（indoleaceticacid；IAA）的作用被發(fā)現(xiàn)。其作為植物激素，在植物細(xì)胞的分裂及愈傷組織的生長中起作用34Gautheret(1939)獲得長期穩(wěn)定生長的形成層植外體愈傷組織，但需要IAA存在而White（1939）發(fā)現(xiàn)，不施加IAA，粉藍(lán)煙草（Nicotianaglauca）及美花煙草（Nicotianalangsdorffii）的體細(xì)胞雜交細(xì)胞系也可以長期生長以該雜交細(xì)胞誘導(dǎo)成的植株，也可以在生長素不存在的情況下生長351952年，Morel和Martin通過莖尖分生組織培養(yǎng)獲得大麗花的無毒植株1953年，Muir將萬壽菊和煙草的愈傷組織轉(zhuǎn)移到液體培養(yǎng)基中，搖床振蕩培養(yǎng)，獲得單細(xì)胞及細(xì)胞團(tuán)懸浮培養(yǎng)物，并繼代繁殖1955年，Miller發(fā)現(xiàn)激動素（Kinetin），比腺嘌呤活性高3萬倍1958年，Steward等報道在以胡蘿卜韌皮部細(xì)胞培養(yǎng)中，形成了體細(xì)胞胚，并發(fā)育成完整植株，證實(shí)了植物細(xì)胞的全能性36SkoogandMiller(1957）利用煙草的髓組織作為植外體，檢驗(yàn)了細(xì)胞生長素（Auxin）/細(xì)胞分裂素（Cytokinin）的比值變化對愈傷組織器官分化的影響在生長素占優(yōu)勢的情況下，促進(jìn)不定根的發(fā)育；細(xì)胞分裂素占優(yōu)勢的情況下，促進(jìn)地上莖部分的發(fā)育37因此，由于在胡蘿卜及煙草中取得的巨大成就，二者長期作為細(xì)胞組織培養(yǎng)的模式材料，直到近年才為擬南芥（Arabidopsisthaliana

）所替代但在該階段的研究中，主要的研究目的是揭示不同植物組織的生理功能，推論其在植物體生命活動中的可能作用。期間，White的基本培養(yǎng)基（White’sbasalmedium）應(yīng)用廣泛，但培養(yǎng)材料多為愈傷組織。3820世紀(jì)60年底初，全合成的營養(yǎng)基質(zhì)開始替換復(fù)雜的、自然的未知組分（如coconutmilkoryeastextracts），形成了以Murashige–Skoogmedium(MurashigeandSkoog1962)為主的培養(yǎng)基質(zhì),在適用不同的要求時添加不同的培養(yǎng)成分。這就是著名的MS培養(yǎng)基迅速發(fā)展階段391960年，Cocking以纖維素酶處理番茄根細(xì)胞，獲得原生質(zhì)體，開創(chuàng)了原生質(zhì)體培養(yǎng)及體細(xì)胞雜交技術(shù)同年，Morel利用蘭花莖尖培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)了脫毒及快速繁殖兩個目的，使蘭花工業(yè)興起1964年，Guha及Maheshwari成功培養(yǎng)曼陀羅花藥獲得單倍體植株，促進(jìn)了利用單倍體培養(yǎng)技術(shù)加速常規(guī)育種的開展1967年，Bourgin及Nitsch獲得煙草花藥培養(yǎng)而來的單倍體植株401970年，Carlson通過離體培養(yǎng)獲得生化突變體同年，Power等首次成功實(shí)現(xiàn)原生質(zhì)體融合1971年，Takebe首次利用煙草原生質(zhì)體培養(yǎng)獲得再生植株，促進(jìn)了體細(xì)胞雜交技術(shù)的發(fā)展，為外源基因注入提供了理想受體材料1972年，Carlson以原生質(zhì)體融合方法獲得兩個煙草物種的體細(xì)胞雜種1974年，Kao、Michayluk和Wallin等建立了PEG轉(zhuǎn)化法，提高了體細(xì)胞雜交技術(shù)的成功率1978年，Melchers等獲得番茄及馬鈴薯的體細(xì)胞雜交體411978年，Murashige提出了人工種子（ArtificialSeed）的概念：通過組織培養(yǎng)技術(shù)，可把植物組織的細(xì)胞培養(yǎng)成在形態(tài)及生理上與天然種子胚相似的胚狀體，也叫作體細(xì)胞胚。這種體細(xì)胞胚有于葉、根、莖分生組織的結(jié)構(gòu)。把體細(xì)胞胚包埋在膠囊內(nèi)形成球狀結(jié)構(gòu)，即人工種子，使其具備種子機(jī)能。1981年，Larkin和Scowcroft提出了體細(xì)胞無性系變異（SomaclonalVariation）的概念1982年，Zimmermann開發(fā)了原生質(zhì)體電融合法20世紀(jì)80年代中期，大豆、小麥等主要農(nóng)作物原生質(zhì)體再生植株相繼成功，并與體細(xì)胞雜交技術(shù)結(jié)合，加快育種同時期，土壤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化法成功應(yīng)用于植物基因轉(zhuǎn)化，加快了植物基因工程研究進(jìn)程421983年，Zambryski等利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，獲得轉(zhuǎn)基因煙草，是首例轉(zhuǎn)基因植物1985年，Horsch建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化方法1987年，Sanford發(fā)明了基因槍法（GeneGun；ParticleBombardemnt），實(shí)現(xiàn)了對單子葉植物的轉(zhuǎn)化植物遺傳轉(zhuǎn)化是當(dāng)前植物細(xì)胞組織培養(yǎng)的研究熱點(diǎn)，并開始了大規(guī)模種植及商業(yè)應(yīng)用43四、本門課程的基本框架及研究意義課程基本內(nèi)容植物細(xì)胞組織培養(yǎng)的應(yīng)用44本門課程的主要內(nèi)容緒論基本技術(shù)及設(shè)備植物的離體形態(tài)發(fā)生（InvitroMophogenesis）植物的胚胎培養(yǎng)（EmbryoCulture）植物的莖尖分生組織培養(yǎng)(MeristemCulture)單倍體細(xì)胞培養(yǎng)（HaploidCulture）植物細(xì)胞培養(yǎng)(PlantCellCulture)原生質(zhì)體培養(yǎng)(Protoplastculture)體細(xì)胞培養(yǎng)（SomaticHybridization）體細(xì)胞無性系變異（SomaclonalVariation）植物體細(xì)胞雜交（PlantSomaticHybridization）45課程安排課次授課內(nèi)容學(xué)識教學(xué)方式備注1植物細(xì)胞組織培養(yǎng)緒論2授課參觀組培室2植物組織培養(yǎng)的基本技術(shù)2授課3植物離體形態(tài)發(fā)生2授課4植物胚胎培養(yǎng)2授課5單倍體細(xì)胞培養(yǎng)2授課6植物原生質(zhì)體培養(yǎng)2授課觀看英文視頻7-8擬南芥、水稻原生質(zhì)體的制備及轉(zhuǎn)染4實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室9互作蛋白在擬南芥原生質(zhì)體中的共定位3實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室10植物細(xì)胞培養(yǎng)2授課11體細(xì)胞雜交2授課12植物體細(xì)胞雜交技術(shù)應(yīng)用及實(shí)例講解2授課13植物體細(xì)胞無性系變異2授課14莖尖分生組織培養(yǎng)2授課15植物種質(zhì)離體保存2授課16課程補(bǔ)遺及課程報告要求

2授課植物細(xì)胞組織培養(yǎng)的應(yīng)用植物育種植物脫毒及離體快繁次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)種質(zhì)資源保存和交換在遺傳、生理生化及病理研究上的應(yīng)用47在植物育種中的應(yīng)用技術(shù)：單倍體培養(yǎng)、胚培養(yǎng)、體細(xì)胞雜交、細(xì)胞突變體篩選及遺傳轉(zhuǎn)化花粉培養(yǎng)---單倍體植株---秋水仙素處理染色體加倍---純合基因型個體，加速育種。已獲得煙草、水稻、小麥、油菜等優(yōu)良品種胚培養(yǎng)可以克服遠(yuǎn)緣雜交不親和，使自然條件下不能完成發(fā)育的幼胚發(fā)育成熟，獲得雜種后代體細(xì)胞雜交，可以打破物種間生殖隔離，創(chuàng)造新物種，獲得選育新材料利用細(xì)胞水平的突變頻率高的特點(diǎn)，處理細(xì)胞獲得新的突變體用遺傳轉(zhuǎn)化法，獲得優(yōu)良品質(zhì)（抗蟲、抗旱等）的作物品系48花粉、花藥培養(yǎng)產(chǎn)生單倍體植株49體細(xì)胞無性系變異篩選50幼胚拯救克服遠(yuǎn)緣雜交障礙51用于基因工程技術(shù)創(chuàng)造植物新種質(zhì)。52在植物脫毒和離體快繁上的應(yīng)用是目前植物細(xì)胞組織培養(yǎng)應(yīng)用最多、最有成效的方面之一病毒侵染是植物（特別是無性繁殖植物）品種退化、產(chǎn)量降低、品質(zhì)下降的重要原因，但生長點(diǎn)附近病毒濃度很低或無病毒莖尖脫毒的應(yīng)用：馬鈴薯、甘薯、大蒜、蘋果及香蕉等離體快繁的應(yīng)用：觀賞植物、經(jīng)濟(jì)林木及作物等53virus-freetissue莖尖培養(yǎng)脫毒54蘭科植物生產(chǎn)55ABECFG花燭屬植物56厥類植物57盆栽及切花植物的繁殖58珍貴樹種59無菌苗快速繁殖60組培苗馴化移栽616263在次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)上的應(yīng)用