2基因工程制藥

會計學(xué)12基因工程制藥2.4基因工程菌生長代謝的特點一、比生長速率μ(h-1)細胞生長速率rX

：單位時間內(nèi)細胞濃度的變化（g/L·h）。

X為細胞濃度，通常用單位體積培養(yǎng)液中所含細胞（或稱菌體）的干燥質(zhì)量（drycellweight，DCW）表示（g/L,gDCW/L）。培養(yǎng)過程中，細胞的生長速率與細胞濃度成正比。第1頁/共40頁2g/L4g/L10g/L20g/L生長速率rX

：單位時間內(nèi)細胞濃度的變化（g/L·h）

2g/L·h10g/L·h

1h-11h-11h第2頁/共40頁μ為比生長速率(h-1)，表示單位濃度細胞的生長速率。二、乙酸的產(chǎn)生大腸桿菌在較高的比生長速率下會產(chǎn)生乙酸，高濃度的乙酸會抑制菌體生長和蛋白表達?？刂凭w生長可控制乙酸產(chǎn)生。第3頁/共40頁2.5基因工程菌的穩(wěn)定性一、質(zhì)粒的不穩(wěn)定性（1）分裂不穩(wěn)定性工程菌分裂時出現(xiàn)一定比例不含質(zhì)粒的子代菌。

相關(guān)因素：質(zhì)粒的丟失率（宿主菌、質(zhì)粒特性和培養(yǎng)條件）含質(zhì)粒菌與不含質(zhì)粒菌的生長速度差異（2）結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定

DNA從質(zhì)粒上丟失、質(zhì)粒上序列發(fā)生重排等。第4頁/共40頁二、提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法1.選擇合適的宿主菌株2.選擇合適的載體低拷貝數(shù)質(zhì)粒丟失的頻率較大含高拷貝數(shù)質(zhì)粒的菌比生長速度明顯低于不含質(zhì)粒菌。3.加入抗生素第5頁/共40頁二、提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法4.分階段培養(yǎng)表達水平越高，重組質(zhì)粒越不穩(wěn)定。

二階段培養(yǎng)：第一階段菌體生長第二階段誘導(dǎo)表達5.控制培養(yǎng)條件

高比生長速率下質(zhì)粒穩(wěn)定性明顯增加。培養(yǎng)基成分、溫度等培養(yǎng)條件對質(zhì)粒穩(wěn)定性也有影響。6.固定化

固定化適用于分泌表達的蛋白，對非分泌表達蛋白難以大規(guī)模采用。第6頁/共40頁2.6基因工程菌的發(fā)酵一、基因工程菌的培養(yǎng)方式1、分批培養(yǎng)（batchculture）

培養(yǎng)基和細胞一次性加入反應(yīng)器進行培養(yǎng)。細胞所處的培養(yǎng)環(huán)境時刻變化，細胞不是處在最優(yōu)的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。操作簡單。2、流加培養(yǎng)（補料分批培養(yǎng)，fed-batchculture）

在細胞分批培養(yǎng)的過程中補加培養(yǎng)基或營養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)方式，培養(yǎng)結(jié)束后一齊取出。可采用不同補料方式，如恒速流加、變速流加、指數(shù)流加等。第7頁/共40頁第8頁/共40頁3、連續(xù)培養(yǎng)（continuousculture）培養(yǎng)開始時為分批培養(yǎng)，培養(yǎng)至一定程度后，連續(xù)不斷的補加新鮮培養(yǎng)基同時排出等量培養(yǎng)液。一定時間后，細胞濃度和培養(yǎng)基中各種物質(zhì)濃度均保持不變?；蚬こ叹环€(wěn)定，很難連續(xù)培養(yǎng)。4、透析培養(yǎng)（dialysisculture）

通過透析除去乙酸。

E.coliHB101(pPAKS2)生產(chǎn)青霉素酰化酶提高11倍。第9頁/共40頁第10頁/共40頁5、固定化培養(yǎng)（immobilizedculture）質(zhì)粒穩(wěn)定，便于連續(xù)，適用于分泌表達。第11頁/共40頁二、基因工程菌的培養(yǎng)工藝1、培養(yǎng)基的影響

碳源：葡萄糖、甘油、乳糖、果糖等。氮源、無機鹽等其他成分。通過單因子實驗、正交設(shè)計等方法優(yōu)化培養(yǎng)基組成，提高蛋白表達水平。2、接種量的影響

接種量小，延遲期長，菌容易老化，不利于蛋白表達。較大的接種量延遲期短，適于蛋白表達。接種量一般為5~15％。第12頁/共40頁3、溫度的影響

溫度對基因表達的調(diào)控機理很復(fù)雜，對不同蛋白，最佳的誘導(dǎo)表達溫度不同。4、溶氧（dissolvedoxygen，DO）的影響

較高水平的DO（大于10~30％）的有利于蛋白表達，供氧不足，產(chǎn)生乙酸。加大攪拌、增加氣流、提高氧分壓、提高罐壓?？刂铺窃吹牧骷铀俣取?/p>

恒溶氧發(fā)酵：通過以上手段控制DO在一恒定值。第13頁/共40頁5、pH的影響

流加酸、堿調(diào)節(jié)pH。pH一般控制在6.8~7.6，少數(shù)例外。6、誘導(dǎo)時機的影響

一般在對數(shù)生長期進行誘導(dǎo)表達。第14頁/共40頁分批發(fā)酵不同生長階段加1mMIPTG誘導(dǎo)表達后的生長曲線正三角（對數(shù)早期）倒三角（對數(shù)中期）菱形（對數(shù)晚期）圓形（不加誘導(dǎo)）第15頁/共40頁三、高密度發(fā)酵理論上計算大腸桿菌發(fā)酵所能達到的最高菌體密度（干重）為400g/L，一般認為最高的發(fā)酵密度（干重）為200g/L。目前培養(yǎng)所達到的最高密度是175g/L。高密度發(fā)酵的成功關(guān)鍵是補料策略。

乙酸的積累是高密度培養(yǎng)生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的一個主要問題是。

第16頁/共40頁三、高密度發(fā)酵工藝上對策：在發(fā)酵工藝上常通過改變培養(yǎng)基組成（以甘油為初始碳源）降低培養(yǎng)溫度限制性流加葡萄糖提高供氧能力（加強攪拌、提高氧分壓、提高罐壓）第17頁/共40頁三、高密度發(fā)酵菌種上對策：阻斷E.coli乙酸產(chǎn)生：敲除磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因（pta1）和乙酸激酶（ack）的基因；改變代謝流方法：導(dǎo)入丙酮酸脫羧酶基因pdc1和乙醇脫氫酶adh2，丙酮酸生成乙醇；限制葡萄糖攝取主要途徑（磷酸轉(zhuǎn)移系統(tǒng)），同時還需加強其他葡萄糖攝取途徑；引入血紅蛋白基因第18頁/共40頁2.7基因工程藥物的分離純化一、分離純化的基本過程發(fā)酵液細胞固-液分離溶液細胞破碎包涵體溶解復(fù)性濃縮粗分離純化與精制制劑產(chǎn)品胞外產(chǎn)物胞內(nèi)產(chǎn)物固-液分離

溶液

細胞碎片第19頁/共40頁2.7基因工程藥物的分離純化二、建立分離純化工藝需了解的因素1、起始物料的特點菌種類型、蛋白的表達部位、產(chǎn)物濃度等。2、目的產(chǎn)物特性（各種物理化學(xué)性質(zhì)、穩(wěn)定性）3、雜質(zhì)的種類和性質(zhì)4、產(chǎn)品質(zhì)量的要求

準許存在的雜質(zhì)種類和最低含量、純度、比活等。第20頁/共40頁三、細胞破碎物理方法

珠磨、高壓勻漿、超聲波破碎、勻漿、凍融、低滲裂解、研磨等化學(xué)方法有機溶劑（甲苯、丙酮等）、表面活性劑等。

生物方法酶法：溶菌酶、葡聚糖酶、溶壁酶等；自溶：一定pH和溫度；一般采用加熱法，自溶時間較長。第21頁/共40頁

第22頁/共40頁

50~70MPa450m/s第23頁/共40頁四、固液分離胞外蛋白：離心包含體：離心、低速離心胞內(nèi)蛋白：去除細胞碎片高速離心、微濾（0.1～10um）、雙水相萃?。≒EG-Dextran、PEG-鹽系統(tǒng)）、絮凝、膨脹床吸附

第24頁/共40頁五、分離純化方法

主要為各種層析方法：離子交換層析、凝膠過濾、疏水層析、親和層析超濾六、非蛋白類雜質(zhì)的去除DNA（離子交換、疏水層析等）熱原（脂多糖，超濾、陰離子交換、疏水層析、多黏菌素B親和層析）病毒（紫外線照射、40nm膜過濾）第25頁/共40頁七、選擇分離純化方法的依據(jù)根據(jù)產(chǎn)物表達形式來選擇

分泌表達（超濾、沉淀）胞內(nèi)可溶表達（親和層析、離子交換）周質(zhì)腔表達（溶菌酶處理后滲透壓休克）包含體（離心回收）第26頁/共40頁七、選擇分離純化方法的依據(jù)根據(jù)分離單元之間的銜接選擇初步純化（超濾、沉淀；濃縮、去主要雜質(zhì)）－－高分辯率純化（親和層析、離子交換等色譜方式）色譜之間的分離次序：鹽析沉淀、離子交換后可直接采用疏水色譜親和層析通常放在第二步純化之后凝膠過濾通常放在最后（容量小、可更換緩沖）根據(jù)分離純化工藝的要求來選擇

具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性純化步驟盡可能少，時間盡可能短等。第27頁/共40頁2.8、包含體的復(fù)性

外源基因在大腸桿菌中高水平表達時通常會形成一種由目的蛋白構(gòu)成的不溶的、無活性的蛋白聚集體即包含體（InclusionBody）

包含體內(nèi)約90%的成分是蛋白質(zhì)，目的蛋白占50％以上。一、包含體表達的優(yōu)點表達量高密度高（1.2-1.4g/mL之間），容易分離抗蛋白酶對宿主毒性小第28頁/共40頁二、包含體蛋白處理過程細胞破碎包涵體分離包涵體溶解目的產(chǎn)物的復(fù)性變性條件下純化包涵體洗滌第29頁/共40頁三、包含體的復(fù)性方法方法：1.稀釋復(fù)性2.透析復(fù)性3.層析復(fù)性影響復(fù)性的操作參數(shù)：蛋白濃度、溫度、pH、離子強度。提高蛋白復(fù)性率的策略：復(fù)性添加劑如PEG、表面活性劑分子伴侶第30頁/共40頁常用半胱氨酸之間形成二硫鍵方法：1.空氣氧化法在堿性條件下通空氣，氧化時可以加入二價銅離子加快反應(yīng)速度，能夠取得更好的效果，缺點是不易控制氧化還原電勢，而且二硫鍵的氧化形成速度慢；2.氧化還原對重排體系常用氧化還原對有氧化型谷胱甘肽/還原型谷胱甘肽和胱氨酸/半胱氨酸，通過調(diào)整氧化還原兩種物質(zhì)的比例可以控制較精確的氧化還原電勢，對二硫鍵反應(yīng)進行控制，其二硫鍵形成速率快于空氣氧化法。第31頁/共40頁2.9基因工程藥物的質(zhì)量控制

生物材料、培養(yǎng)過程、純化過程、產(chǎn)品的質(zhì)量控制。

目標產(chǎn)品的質(zhì)量控制：產(chǎn)品的鑒別、純度、活性、安全性、穩(wěn)定性、一致性。1.生物活性測定活性、比活2.產(chǎn)品的鑒定（1）相對分子量

SDS、凝膠過濾，允許10%誤差。

必要時采用質(zhì)譜準確測定。第32頁/共40頁（2）等電點

等電聚焦測定，等電點常不均一，每批測定結(jié)果應(yīng)一致。（3）紫外吸收光譜

特征型吸收，每批一致（4）氨基酸序列測定

送檢中試頭三批產(chǎn)品，N端15個氨基酸序列，C端1～3個氨基酸殘基。（5）氨基酸組成分析（6）免疫印跡（westernblot）（7）圓二色光譜第33頁/共40頁（8）肽圖一般用胰蛋白酶或CNBr裂解，再用RP-HPLC或SDS分析第34頁/共40頁（9）二硫鍵分析3.蛋白純度分析

必須采用非還原SDS和HPLC進行檢定，其他檢測方法包括CE（毛細管電泳）等。4.雜質(zhì)檢測（1）內(nèi)毒素家兔法、鱟試劑法（2）宿主細胞蛋白免疫分析（3）宿主細胞殘余DNA

核酸雜交，100pg/劑量第35頁/共40頁（4）細菌、酵母、真菌、支原體、病毒微生物學(xué)方法（5）其他物質(zhì)抗生素牛血清采用了抗體親和層析，檢測小鼠IgG含量。5.穩(wěn)定性檢測

在不同溫度下保存，定期取樣檢測生物活性及其他特性的變化。6.一致性

各批次產(chǎn)品均符合標準規(guī)格。第36頁/共40頁產(chǎn)品的保存：液態(tài)保存低溫：-20℃、-80℃和液氮、短期4℃穩(wěn)定的pH

高濃度加保護劑：糖類、脂類、蛋白類、還原劑（二硫蘇糖醇）等固體保存含水量5%以下，4℃長期保存冷凍干燥