熒光壽命成像技術(shù)FLIM

,.生物光子學大作業(yè)作業(yè)名稱：熒光壽命成像技術(shù)FLIM姓名：曾揚艦學號：達成日期：,.熒光壽命成像技術(shù)FLIM綱領(lǐng)：熒光壽命顯微成像技術(shù)（FLIM）技術(shù)是一種奇異的熒光成像技術(shù)，擁有其余熒光成像技術(shù)沒法取代的優(yōu)秀性能，是生物醫(yī)學工程領(lǐng)域的研究熱門。頻域調(diào)制、門控探測和時間有關(guān)單光子計數(shù)是FLIM的幾種主要實現(xiàn)方法。綜述了這些計數(shù)的原理、研究現(xiàn)狀和已獲得的部分紅果，比較了這三種方法的時間分辨率和成像速度等參數(shù)的利害。寬場FLIM更合用于延時成像和及時成像。熒光偏振各向異性成像和內(nèi)窺鏡FLIM技術(shù)都是FLIM技術(shù)很有遠景的應(yīng)用方向。,.FluorescenceLifetimeImagingMicroscopy(FLIM)WhylifetimeImaging?Thefluorescencelifetimeisthesignatureofafluorescentmaterial;Itistheexponentialdecayinemissionaftertheexcitationofafluorescentmaterialhasbeenstopped.FLIMisatechniquetomapthespatialdistributionoflifetimeswithinmicroscopicimagesanditallowsmeasurementsinlivingcellsaswellasinfixed.Becauseofthefactthatsomephenomenadoaffectfluorescencelifetimes,thelifetimeisusedtodetectthesephenomenaleadingtovariousapplicationssuchas;lonimaging,oxygenimaging,probingmicroenvironment,andmedicaldlagnosis.FrequencydomainmethodThehomodynefrequencydomainFLIMmethodrequiresamodulatedlightsourceandamodulateddetector.IntheLIFEsystemthesearetheLEDandtheintensifiedCCDcamere.Botharemodulatedatexactlythesamefrequency,butwithanadjustablediffrenceinphase.Thesetwoparametersdependon,.thefluorescencelifetimeofthesampleandthemodulationfrequencyandaremeasuredtocalculatetheflurescencelifetimeineachpixeloftheimage.、基本見解熒光是分子汲取能量后使得其基態(tài)電子被激發(fā)到單線激發(fā)態(tài)后由第一單線激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時所發(fā)生的輻射復(fù)合發(fā)出的光。熒光壽命是指分子遇到光脈沖激發(fā)后返回基態(tài)以前在激發(fā)均勻逗留的時間，處于激發(fā)態(tài)的熒光分子在從激發(fā)到基態(tài)的過程中發(fā)射熒光開釋能量。熒光壽命是熒光物質(zhì)固有性質(zhì)，與濃度，光漂白和激發(fā)強度沒關(guān)，依靠于環(huán)繞熒光物質(zhì)的離子和局部環(huán)境，比方蛋白質(zhì)的拘束等。影響熒光壽命的要素：熒光物質(zhì)的結(jié)構(gòu)；所處微環(huán)境的極性、溫度、粘度，鍵合離子等條件有關(guān)。熒光壽命成像能夠劃分熒光物質(zhì)濃度和淬滅效應(yīng)的影響，這使得熒光壽命成像顯微學成為一個有力的工具進行細胞內(nèi)的定量環(huán)境和分子動力學分析。熒光壽命成像技術(shù)有兩種：時間域和頻次域。1）時域FLIM：需要脈沖光源，所以一般在雙光子的系統(tǒng)上比較常有，因為激光是脈沖的并且買雙光子的老師一般也搭配一個FLIM。光路調(diào)理也是一個問題，供給的廠家一般是Becker&Hickl和PicoQuant德國企業(yè)。這個方法比較流行，也有好多系統(tǒng)。（2）頻域FLIM：需要一個相位調(diào)制的光源，合用LED調(diào)制的，荷蘭的Lambert-Instrument就有這樣一套產(chǎn)品，是在熒光顯微鏡上搭的。,.2、FLIM技術(shù)的分類及整體進展熒光發(fā)射后會以指數(shù)規(guī)律衰減。熒光壽命平常定義為熒光強度降至最大值的1/e時所需要的時間，常用τ表示。因為熒光分子所處環(huán)境的不同樣，熒光發(fā)射可分為單組分和多組分兩類，最簡單的狀況即單組分下，熒光信號衰減可表示為II0exp(t/)假如有大批處在相像環(huán)境里的熒光分子被激發(fā)，那么發(fā)射熒光的衰減依照單指數(shù)規(guī)律。典型的熒光信號平常都是多組分，即多指數(shù)衰減規(guī)律。FLIM技術(shù)發(fā)展到此刻，形成了頻域和時域兩大類方法。此中門控探測、時間有關(guān)單光子計數(shù)和掃描相機成像是三種主要的時域?qū)崿F(xiàn)方法。國際上從20世紀80年月開始熒光壽命成像發(fā)面的研究工作。較早從事熒光壽命成像技術(shù)方面的研究工作是日本大阪大學，他們提出的頻次調(diào)制法來進行熒光壽命的丈量。頻次調(diào)制法原理清楚，設(shè)施要求低，系統(tǒng)簡單并且造價低，技術(shù)也日益成熟。睡者生物醫(yī)學丈量的需要，可進行納秒、皮秒量級熒光壽命成像的實不時域FLIM技術(shù)隨后流行，擁有成像速度快，時間分辨率高等長處。TCSPC是一種經(jīng)典的光子丈量技術(shù)，在當前時域FLIM中應(yīng)用最寬泛，技術(shù)也很成熟。與此同時，時間分辨率不及TCSPC，但成像速度更快的門控FLIM技術(shù)漸漸成為FLIM領(lǐng)域的研究熱門。、條紋相機方法丈量熒光壽命,.工作原理：條紋相機把熒光中的時間信息轉(zhuǎn)變?yōu)榭臻g信息的裝置。典型的條紋相機由條紋管、迅速掃描電極、輸入和輸出裝置。條紋相機主假如用來丈量超快熒光。由超短光脈沖引誘的、從樣品發(fā)出的熒光被聚焦在條紋相機的歲月電極上，從歲月電極上開釋的光電子流量與聚焦在歲月電極上的熒光強度成比，這些電子在加快電場中被加快，此后在偏轉(zhuǎn)電場中被偏離，最后入射到熒光屏的磷光粉上。所以，在不同樣的時刻，從歲月電極上開釋出來的光電子入射到熒光屏上地點也不同樣。這樣在熒光屏上就能夠看到一條條軌跡或許稱之為條紋，這些條紋的空間分辨率真接對應(yīng)于熒光的時間分辨率。種類細分為飛秒條紋相機，大動向范圍條紋相機，幀條紋相機，X-射線條紋相機等。4、頻域FLIM技術(shù)頻域FLIM使用正選調(diào)制的激光器或許發(fā)光二極管LED作為光源對樣品進行激發(fā)，樣品會產(chǎn)生與激發(fā)光同頻次但相位差為?φ的熒光信號此后使用同頻次調(diào)制的CCD或許PMT作為探測器解調(diào)并接收熒光信號，經(jīng)過丈量解調(diào)系數(shù)M，即可計算相應(yīng)的熒光壽命τ和τ。cM,.τ=1tanφCω11τM=ω√M2-1ACem/DCemM=ACex/ACex國際上對頻域

FLIM

的研究張開較早。怎樣提升成像速率成為頻域

FLIM技術(shù)第一需要解決的問題。

1999

年，瑞士環(huán)境工程研究所

Mizeret

等實現(xiàn)了視頻速率的內(nèi)窺鏡頻域

FLIM

成像，將其應(yīng)用到了醫(yī)療診斷領(lǐng)域，

2000

年，伊利洛伊大學厄本那分校Holub等實現(xiàn)了幀頻55Hz的頻域，是當時最快幀頻。2004年，新加坡南洋理工大學Seah等使用頻域FLIM達成了對暗藏指紋的鑒識。5、時域FLIM技術(shù)時域FLIM經(jīng)過脈沖激光器激發(fā)熒光團，利用探測器等直接探測熒光衰減信號成像。時域設(shè)施與頻域比較，平常有更快的成像速度和更高的時間分辨率，因此對設(shè)施要求更高。TCSPC有理想的光子計數(shù)率和超高的時間分辨率，與門控探測比較，可丈量更短的熒光壽命。門控法的熒光壽命分辨率雖不及TCSPC，但圖像獲得速度平常很快，是實現(xiàn)非穩(wěn)態(tài)過程探測的有力技術(shù)手段。5.1時間有關(guān)單光子計數(shù)某一段時間內(nèi)檢測到發(fā)射光子的概率與此時段內(nèi)的熒光強度成正比，經(jīng)過丈量探測熒光強度的衰減即可實現(xiàn)熒光壽命的探測。TCSPC鑒于上述原理實現(xiàn)，結(jié)構(gòu)出如右圖熒光發(fā)射光子在時間軸上的概率散布曲線，即熒光衰減曲線。因為每個周期只記錄一,.5.2門控探測左圖為理想的單指數(shù)熒光衰減曲線，在激發(fā)光E(t)作用下，熒光團發(fā)射熒光，熒光強度F(t)與時間t關(guān)系可表示為F(t)=F0exp(-t/τ)，熒光壽命可經(jīng)過在兩個不同樣時刻開啟的同樣寬度的門內(nèi)記錄的熒光強度信息求得。在條件贊成下，平常采納多門探測。一個典型的設(shè)置為：取三個不同樣的延緩時刻，每個門記錄1~5幅圖像右圖是個典型的門控熒光壽命成像系統(tǒng)簡圖。平常由激發(fā)光源、光電探測器、延緩裝置及圖像辦理設(shè)施構(gòu)成門控裝置的光源平常為短脈寬超快激光器，以提升生物樣品成像的壽命分辨率。CCD是常有的成像設(shè)施，CCD門寬對成像精度的影響還需要深入研究。延緩裝置供給FLIM的控制信號。熒光強度圖像生成壽命圖像的方法有兩種：RLD和WNLLS。,.6、寬場FLIM系統(tǒng)寬場FLIM是寬視場的熒光壽命成像顯微鏡，右圖給出了寬場顯微鏡與掃描顯微鏡的比較。，寬場FLIM優(yōu)勢在于較弱的熒光團光漂白效應(yīng)和較快的系統(tǒng)成像速度，同樣探測率下，所需要的激發(fā)光要小的多，則樣品遇到光漂白的影響會小于掃描系統(tǒng)。寬場系統(tǒng)弊端在于其成像深度小與掃描系統(tǒng)，沒法獲得樣本深層的圖像，可經(jīng)過其余手段獲得改良。7、FLIM技術(shù)與癌癥診斷癌細胞的自熒光特點與正常組織有較大差別，同時也可用于劃分癌細胞的不同樣生長周期。其自熒光特點之一的熒光壽命供給了癌癥診斷的新依照。近來幾年來，國際FLIM研究熱門紛繁集中在FLIM對癌癥的協(xié)助診斷上，研究方向逐漸由體外病理查驗向體內(nèi)診斷治療發(fā)展。內(nèi)窺鏡是臨床診斷，特別是胃癌、食道癌診斷中特別重要的手段。所以FLIM與內(nèi)窺鏡的聯(lián)合，將極大發(fā)揮其對癌癥組織的精準定位的優(yōu)勢。及時成像在內(nèi)窺鏡診斷中是特別有必需的。8、FLIM技術(shù)的應(yīng)用）細胞體自己熒光壽命分析）自己熒光相對熒光標志的有效劃分）擁有同樣頻譜性質(zhì)的不同樣熒光標志的劃分4）活細胞內(nèi)水介質(zhì)的PH值丈量,.）局部氧氣濃度丈量）活細胞內(nèi)鈣濃度丈量）時間分辨Forster共振能量轉(zhuǎn)移（Fret）：納米級尺度上的遠程丈量，環(huán)境敏感的FRET探針定量丈量?？偨Y(jié)：在各樣FLIM方法中，TCSPC的時間分辨率最高，文件報導(dǎo)可達25ps，門控FLIM不過于TCSPC，可進行納秒量級的壽命測試。但在成像速度上，門控FLIM是最快的，文件報導(dǎo)幀頻可達100Hz。頻域FLIM的成本最低，應(yīng)用最寬泛，但其性能指標均不及TCSPC和門控FLIM為主的時域方法。寬場FLIM可實現(xiàn)更快的幀頻，更合適應(yīng)用門控FLIM。內(nèi)窺鏡FLIM有廣闊的醫(yī)療應(yīng)用遠景，可用于癌癥等疾病的初期診斷。參照文件：1、LiDongxu,XuXiao,LiNaetal...Timeresolutionfluorescencetechnologyandfluorescencelifetimemeasurement[J].UniversityChemistry,2008,23(4):2~11李東旭，徐瀟，李娜等.時間分辨熒光技術(shù)與熒光壽命丈量[J].大學化學，2008，23(4):2~112、陳同生，王巖等.利用鑒于掃描相機的熒光壽命成像顯微技術(shù)研究細胞周期[J].中國激光，2011,38(3):3040023、Y.Sun，N.Hatami,M.Yeeetal...Fluorescencelifetimeimagingmicroscopyforbraintumorimageguidesurgery[J].J.Biomedical,.Optics,2010,15(5):0560224、W.Becker,A.Bergmann,M.Hansroulreal2timefluorescencelifetimeimaging

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