任務(wù)單元抗原抗體的制備

任務(wù)單元抗原抗體的制備第一頁，共四十八頁，2022年，8月28日主要內(nèi)容單元一抗原的制備單元二抗血清的制備單元三單克隆抗體的制備單元四基因工程抗體第二頁，共四十八頁，2022年，8月28日學(xué)習(xí)目標(biāo)1.掌握抗血清的制備過程及鑒定方法，正確判定抗血清的質(zhì)量，能正確處理抗血清制備中的干擾因素。2.掌握單克隆抗體技術(shù)的原理、制備流程和應(yīng)用。3.正確理解多克隆抗體、單克隆抗體和佐劑的概念。4.知曉免疫原的制備方法及意義。5.了解基因工程抗體的優(yōu)點(diǎn)、種類和應(yīng)用。第三頁，共四十八頁，2022年，8月28日單元一抗原的制備抗原（免疫原）：免疫原（immunogen)指用于制備抗體的抗原(antigen)或半抗原(hapten）?？乖w粒性抗原可溶性抗原蛋白質(zhì)抗原多糖抗原核酸抗原第四頁，共四十八頁，2022年，8月28日一、顆粒性抗原的制備顆粒性抗原細(xì)胞性抗原：血細(xì)胞和組織細(xì)胞病原體：細(xì)菌、病毒、支原體、寄生蟲等第五頁，共四十八頁，2022年，8月28日采集靜脈血玻璃珠脫纖維離心、洗滌調(diào)合適濃度（一）綿羊紅細(xì)胞的制備第六頁，共四十八頁，2022年，8月28日(二)細(xì)菌抗原的制備用途:(1)作為診斷菌液。(2)用于制備免疫血清或診斷血清。第七頁，共四十八頁，2022年，8月28日1.制備方法培養(yǎng)細(xì)菌分離、鑒定擴(kuò)大培養(yǎng)合適濃度滅活處理離心、洗滌第八頁，共四十八頁，2022年，8月28日2.細(xì)菌抗原的檢定1.一般性狀檢定菌種典型；抗原為乳白色懸液；鹽水中不自凝。2.無菌試驗(yàn)甲醛處理后37℃培養(yǎng)2-3d無菌生長3.純度檢查革蘭氏染色鏡檢10個(gè)視野無雜菌。4.特異性試驗(yàn)玻片凝集試驗(yàn)強(qiáng)陽性。5.定量凝集試驗(yàn)?zāi)r(jià)不低于原血清凝集效價(jià)的50%6.濃度測定。第九頁，共四十八頁，2022年，8月28日二、可溶性抗原的制備組織細(xì)胞粗抗原制備組織、細(xì)胞清洗和去污處理細(xì)胞裂解（搗碎方法）勻漿物提取（初篩物）可溶性抗原制備勻漿物中目的抗原提取純化

（不同純化方法，多次純化）鑒定（定性、定量、特異性、理化性等）分裝、保存可溶性抗原制備的一般流程第十頁，共四十八頁，2022年，8月28日二、可溶性抗原的制備（一）材料的選取與預(yù)處理（二）細(xì)胞裂解（三）純化抗原的提?。ㄋ模┛乖蔫b定（五）抗原的濃縮與保存五步驟第十一頁，共四十八頁，2022年，8月28日（一）材料的選取與預(yù)處理組織：新鮮或低溫保存（-40℃）處理方法：（1）器官或組織剪去包膜、結(jié)締組織及大血管，生理鹽水或緩沖液洗去殘留血液和污物，剪成小塊，再搗碎。（2）細(xì)胞緩沖液混懸后離心，再進(jìn)行裂解或搗碎。第十二頁，共四十八頁，2022年，8月28日二、細(xì)胞裂解1.細(xì)胞勻漿（1）高速組織勻漿器法（2）研磨法：玻璃勻漿器第十三頁，共四十八頁，2022年，8月28日第十四頁，共四十八頁，2022年，8月28日第十五頁，共四十八頁，2022年，8月28日2.超聲波破碎法適用范圍：組織細(xì)胞和微生物細(xì)胞。機(jī)制：可能與強(qiáng)聲波作用于溶液時(shí)，氣泡產(chǎn)生、長大和破碎的空化現(xiàn)象有關(guān)，空化現(xiàn)象引起的沖擊波和剪刀力使細(xì)胞裂解。超聲破碎的效率取決于聲頻、聲能、處理時(shí)間、細(xì)胞濃度和細(xì)胞的類型。特別注意：使用時(shí)注意降溫、防止過熱，避免產(chǎn)生氣泡。第十六頁，共四十八頁，2022年，8月28日第十七頁，共四十八頁，2022年，8月28日3.酶處理法適用范圍：多種微生物細(xì)胞機(jī)制：利用酶反應(yīng)，破會(huì)細(xì)胞壁上特殊的鍵，從而達(dá)到破壞細(xì)胞壁的目的。優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：專一性強(qiáng)，酶解條件溫和。

缺點(diǎn)：費(fèi)用較高。應(yīng)用做多的是：溶菌酶（專一分解細(xì)胞壁上糖蛋白分子的α-1，4-糖苷鍵）。第十八頁，共四十八頁，2022年，8月28日4.反復(fù)凍融法適用范圍：培養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)胞壁較脆弱的菌體機(jī)制：突然冷凍時(shí)細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成及胞內(nèi)外溶劑濃度的突然改變而破壞細(xì)胞。優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：簡便

缺點(diǎn)：①破碎率低②引起對(duì)凍融敏感的蛋白質(zhì)變性第十九頁，共四十八頁，2022年，8月28日5.表面活性劑處理法適用范圍：

細(xì)菌和培養(yǎng)細(xì)胞機(jī)制：適當(dāng)條件下（溫度、pH、低離子強(qiáng)度），表面離子活性劑與脂蛋白形成微泡，使細(xì)胞膜通透性改變。優(yōu)點(diǎn)：作用溫和最常用的是：SDS，Tween第二十頁，共四十八頁，2022年，8月28日第二十一頁，共四十八頁，2022年，8月28日（三）可溶性抗原純化

1.蛋白質(zhì)抗原的純化純化方法：

（1）超速離心法分離亞細(xì)胞成分和大分子蛋白質(zhì)（2）選擇性沉淀法鹽析法最為經(jīng)典（3）凝膠過濾法（4）離子交換層析法（5）親和層析法第二十二頁，共四十八頁，2022年，8月28日（1）超速離心法原理:利用各顆粒在梯度液中沉降速度不同，使具有不同沉降速度的顆粒,處于不同密度的梯度層內(nèi)，達(dá)到彼此分離的目的。特點(diǎn)：用超速離心或梯度密度離心法純化抗原，極難將某一抗原成分分離出來。應(yīng)用：用于少部分大分子抗原和一些比較輕的抗原物質(zhì)的分離，如IgM、C1q、甲狀腺球蛋白、載脂蛋白A、B等。第二十三頁，共四十八頁，2022年，8月28日（2）選擇性沉淀法原理：根據(jù)各蛋白質(zhì)理化特性的差異，采用各種沉淀劑或改變某些條件促使蛋白質(zhì)抗原成分沉淀，從而達(dá)到純化的目的。常用方法：鹽析沉淀法（不同鹽濃度則溶解度不同）；常用33～50％飽和度的硫酸銨。特點(diǎn)：簡單方便，純度不高，粗提球蛋白。應(yīng)用：在大量制備中先用此法粗提，再純化。第二十四頁，共四十八頁，2022年，8月28日（3）凝膠過濾法原理：凝膠具有三維空間多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，經(jīng)適當(dāng)溶液平衡后，裝入層析柱。當(dāng)含有各種分子大小不一的混合物加在凝膠床面時(shí)，大分子物質(zhì)不能進(jìn)入凝膠顆粒的網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)內(nèi)，在凝膠顆粒之間的空隙中很快地通過凝膠床，短時(shí)間內(nèi)被洗脫出來；而分子較小的物質(zhì)則進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)內(nèi)，反復(fù)受到阻滯，洗脫較慢。分成大、中、小三種類型。第二十五頁，共四十八頁，2022年，8月28日（4）離子交換層析法原理：利用帶離子基團(tuán)的纖維素或凝膠，吸附交換帶相反電荷的蛋白質(zhì)抗原。各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同，所帶電荷不同，與纖維素結(jié)合的能力有差別。當(dāng)梯度洗脫時(shí)，逐步增加流動(dòng)相的離子強(qiáng)度，使加入的離子與蛋白質(zhì)競爭纖維素上的電荷位置，從而使血清中的蛋白質(zhì)分成γ球蛋白、α球蛋白、β球蛋白和清蛋白等幾個(gè)部分而被洗脫下來，達(dá)到分離純化的目的。第二十六頁，共四十八頁，2022年，8月28日（5）親和層析法原理：依據(jù)抗原抗體的生物學(xué)活性進(jìn)行分離和提純的技術(shù)。將純化的抗IgG附著于惰性的固相基質(zhì)上，制成免疫吸附層析柱。當(dāng)樣品流過此柱時(shí)，待分離的IgG可選擇性地與免疫吸附劑上的特異性配體(抗IgG)結(jié)合；當(dāng)改變洗脫條件可重新解離，將待分離的Ig洗脫下來，達(dá)到純化的目的。優(yōu)點(diǎn)：提取純度高、抗原抗體不失活性。第二十七頁，共四十八頁，2022年，8月28日第二十八頁，共四十八頁，2022年，8月28日2.核酸抗原的制備主要步驟破碎細(xì)胞蛋白質(zhì)的去除核酸的沉淀酚和氯仿乙醇第二十九頁，共四十八頁，2022年，8月28日第三十頁，共四十八頁，2022年，8月28日核酸的保存（1）溫度-70℃長期保存-20℃4℃（5℃）最佳和最簡單（2）介質(zhì)TE緩沖液（最常用）第三十一頁，共四十八頁，2022年，8月28日3.脂多糖抗原的制備第三十二頁，共四十八頁，2022年，8月28日4.Ig片段的制備（1）非共價(jià)鍵解離法肽鏈亞單位之間以氫鍵、靜電引力等非共價(jià)鍵結(jié)合，這些鍵結(jié)合力較弱，可經(jīng)2種方法將其斷開制備片段。

①改變pH：蛋白質(zhì)解離的臨界值為pH3～4(羧基滴定范圍)和pH9～10(賴氨酸—酪氨酸滴定范圍)，當(dāng)加入酸或堿使pH低于，3或高于10時(shí)，肽鏈亞單位就會(huì)解離；②利用強(qiáng)變性劑：多數(shù)蛋白在8mol／L脲或6moI兒鹽酸胍中會(huì)發(fā)生變性，使肽鏈亞單位解離，此法也可用于載脂蛋白抗原的解離和膠原肽的提取。第三十三頁，共四十八頁，2022年，8月28日（2）共價(jià)鍵解離法二硫鍵是連接免疫球蛋白肽鏈的共價(jià)鍵，解離二硫鍵可將輕鏈與重鏈分開。解離的方法多采用氧化法和還原法。氧化法的優(yōu)點(diǎn)是切開二硫鍵后，肽鏈不能重新形成二硫鍵，便于肽鏈純化，缺點(diǎn)是蛋氨酸(甲硫氨酸)被氧化成亞砜，色氨酸側(cè)鏈被破壞。

還原法目前常用，其原理是將二硫鍵還原成巰基，但還原的琉基極不穩(wěn)定，易再重新結(jié)合成二硫鍵，必須及時(shí)用碘乙酸或碘代乙酰胺進(jìn)行羧甲基化以封閉巰基。第三十四頁，共四十八頁，2022年，8月28日（3）酶解法酶解法的專一性極好，不同的片段可用不同的酶進(jìn)行裂解。如木瓜酶水解IgG可獲得1個(gè)Fc段和2個(gè)Fab段；胃蛋白酶水解IgG可獲得F(ab')：和數(shù)個(gè)小片段。用木瓜酶水解得到的Fc段常作為抗原來制備抗重鏈血清，胃蛋白酶水解得到的F(ab')；常作為抗體試劑應(yīng)用。第三十五頁，共四十八頁，2022年，8月28日（四）純化抗原的鑒定、濃縮與保存1.定量測定生化技術(shù)

如UV法、雙縮脲、酚試劑等蛋白檢測方法。常用的是紫外光吸收法，該法測定280nm和260nm的吸光度(A)值，并根據(jù)公式計(jì)算蛋白含量。蛋白含量(mg／m1)＝A280nm×1.45-A260nm×0.742.純度鑒定

PAGE、免疫電泳、雙擴(kuò)3.免疫活性鑒定

免疫電泳、雙向免疫擴(kuò)散法、ELISA4.濃縮與保存第三十六頁，共四十八頁，2022年，8月28日三、半抗原的制備半抗原：僅有抗原性的物質(zhì)。半抗原+載體=完全抗原（一）載體

1.蛋白質(zhì)是結(jié)構(gòu)復(fù)雜的大分子膠體物質(zhì)，是一種良好的載體，常用的有牛血清白蛋白、人血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白和血藍(lán)蛋白等。其中牛血清白蛋白溶解度較高、免疫原性強(qiáng)且易獲得，因此最為常用。蛋白質(zhì)與半抗原的結(jié)合主要通過游離氨基、游離羧基、酚基、巰基、咪唑基、吲哚基和胍基等活性基團(tuán)的縮合。第三十七頁，共四十八頁，2022年，8月28日

2.多肽聚合物

人工合成的載體。常用多聚賴氨酸(polylysine)，其分子量高達(dá)lOOkD以上，是良好的載體。這種多肽聚合物與半抗原結(jié)合后，可誘導(dǎo)產(chǎn)生高效價(jià)、高親合力的抗體。

3.大分子聚合物羧甲基纖維素(carboxymethylcellulose，CMC)、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidonc，PVP)等大分子聚合物均可與半抗原結(jié)合，加入弗氏完全佐劑可誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生良好的抗體。第三十八頁，共四十八頁，2022年，8月28日（二）半抗原與載體的連接方法

1.物理法通過吸附作用。

2.化學(xué)法通過交聯(lián)實(shí)現(xiàn)。（三）半抗原的鑒定

1.目的：測定半抗原與載體的比例。2.測定方法：（1）吸收光譜分析法（2）放射性核素標(biāo)記半抗原摻入法第三十九頁，共四十八頁，2022年，8月28日（1）如果半抗原有適宜的吸收光譜，測定在一定波長下復(fù)合抗原和載體之間克分子吸光度的差別，然后把這個(gè)差別與同樣波長下半抗原的克分子吸光度數(shù)相比較，就可以準(zhǔn)確地計(jì)算出所結(jié)合的半抗原分子數(shù)。（2）在偶聯(lián)反應(yīng)液中加入一定量的放射性核素標(biāo)記的半抗原，偶聯(lián)反應(yīng)后經(jīng)充分透析，測量透析袋中的放射性含量，計(jì)算結(jié)合到載體上的半抗原分子數(shù)。第四十頁，共四十八頁，2022年，8月28日四、免疫佐劑免疫佐劑（佐劑）：先于抗原或與抗原同時(shí)注入體內(nèi)，可增強(qiáng)機(jī)體對(duì)該抗原的特異性免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答類型的物質(zhì)被稱為免疫佐劑，簡稱佐劑。本質(zhì)：佐劑可視為一種非特異性免疫增強(qiáng)劑，可增強(qiáng)體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。第四十一頁，共四十八頁，2022年，8月28日（一）佐劑的種類與制備1.種類第四十二頁，共四十八頁，2022年，8月28日具備免疫原性的佐劑：如卡介苗、枯草分枝桿菌、短小棒狀桿菌、百日咳桿菌、脂多糖、細(xì)胞因子等。不具備免疫原性的佐劑：如氫氧化鋁佐劑、磷酸鋁、磷酸鈣、石蠟油、羊毛脂、表面活性劑、藻酸鈣、多聚核苷酸、