組織培養(yǎng)第二章植物組織培養(yǎng)基本操作

第二章植物組織培養(yǎng)基本操作宜職院08.9

目的與要求

了解植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基種類、成分及其特點(diǎn)，學(xué)習(xí)植物組織培養(yǎng)基本操作，了解離體培養(yǎng)環(huán)境條件，以及煉苗移栽基本方法。具有植物組織培養(yǎng)基本操作程序的認(rèn)知。能夠識(shí)別各類培養(yǎng)基特點(diǎn)，熟悉MS培養(yǎng)基成分；具有制作培養(yǎng)基能力，具有選擇外植體、表面滅菌、無(wú)菌接種等基本能力；具有植物組織培養(yǎng)條件控制基本能力；有進(jìn)行組培苗馴化練苗的基本能力。第一節(jié)培養(yǎng)基成分、種類及特點(diǎn)第二節(jié)培養(yǎng)基的制備第三節(jié)外植體無(wú)菌接種第四節(jié)外植體培養(yǎng)第五節(jié)試管苗的馴化與移栽組織培養(yǎng)步驟圖（1）準(zhǔn)備階段

查閱相關(guān)文獻(xiàn)，根據(jù)已成功培養(yǎng)的相近植物資料，結(jié)合實(shí)際制定出切實(shí)可行的培養(yǎng)方案。根據(jù)實(shí)驗(yàn)方案配制適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)消毒劑以及不同培養(yǎng)階段所需的培養(yǎng)基，并經(jīng)高壓滅菌或過(guò)濾除菌后備用。（2）外植體的選擇與消毒

選擇合適的部位作為外植體，采回后經(jīng)過(guò)處理，然后進(jìn)行消毒處理。將消毒后的外植體在無(wú)菌條件下切割成一定大小的小塊，或剝離出莖尖、挑出花藥，接種到啟動(dòng)培養(yǎng)基上。（3）啟動(dòng)培養(yǎng)

接種后的材料置于培養(yǎng)室或光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，促使外植體中已分化的細(xì)胞脫分化形成愈傷組織，或頂芽、腋芽直接萌發(fā)形成芽。將愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基分化成不同的器官原基或形成胚狀體，最后發(fā)育形成再生植株。（4）增殖培養(yǎng)

分化形成的芽、原球莖數(shù)量有限，采用適當(dāng)?shù)脑鲋撑囵B(yǎng)基經(jīng)反復(fù)多次切割轉(zhuǎn)接。當(dāng)芽苗繁殖到一定數(shù)量后，再將一部分用于壯苗生根，另一部分保存或繼續(xù)擴(kuò)繁。進(jìn)行脫毒苗培養(yǎng)的還要進(jìn)行病毒檢測(cè)。

（5）生根培養(yǎng)剛形成的芽苗往往比較弱小，多數(shù)無(wú)根，此時(shí)可降低或不加細(xì)胞分裂素濃度，提高生長(zhǎng)素濃度，促進(jìn)芽苗生根，提高其健壯度。（6）煉苗移栽選擇生長(zhǎng)健壯，有3～5條根的生根苗進(jìn)行煉苗，移栽到疏松透氣的基質(zhì)中，注意保溫、保濕、遮蔭。當(dāng)苗完全成活后，再移向大田。擬定培養(yǎng)方案外植體預(yù)處理外植體無(wú)菌接種啟動(dòng)培養(yǎng)分化出芽、胚狀體或原球莖繼代增殖培養(yǎng)生根培養(yǎng)煉苗移栽成活供生產(chǎn)使用植物組織培養(yǎng)的一般程序

培養(yǎng)基配制滅菌第一節(jié)

培養(yǎng)基成分、種類及特點(diǎn)植物生長(zhǎng)必需16種基本元素：N、P、K、Ca、Mg、S、Fe、Mn、B、Cu、Zn、Mo、Cl、C、H、O。離體培養(yǎng)條件下，各元素主要從培養(yǎng)基中獲得：H和O來(lái)源于水，C來(lái)源于添加的糖類，其它礦質(zhì)元素來(lái)源于組成培養(yǎng)基的無(wú)機(jī)鹽。培養(yǎng)基是根據(jù)植物生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)成分，配制成的供植物生長(zhǎng)的人工制作的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。一、培養(yǎng)基的成分培養(yǎng)基一般包括無(wú)機(jī)鹽、有機(jī)化合物和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑三大基本組成成分。1、無(wú)機(jī)鹽類

功能離體組織生長(zhǎng)發(fā)育的基本成分根據(jù)植物對(duì)必需元素需要的量，可以分為以下兩類：

微量元素—植物所需元素的濃度小于10-5～10-7mol/L，F(xiàn)e、Cu、Zn、Mn、Mo、B、Cl。除C、H、O外，其它礦質(zhì)元素通常以離子態(tài)吸收N-硝態(tài)氮和銨態(tài)氮

2、有有機(jī)化化合物物培養(yǎng)基基中只只有無(wú)無(wú)機(jī)鹽鹽叫做做基本培培養(yǎng)基基，為使培培養(yǎng)物物更好好的生生長(zhǎng)，，還需需添加加有機(jī)機(jī)成分分，常常用有有糖類類、維維生素素、醇醇類、、嘌呤呤、氨氨基酸酸等。。⑴糖類類功能離體培培養(yǎng)物物生長(zhǎng)長(zhǎng)與發(fā)發(fā)育不不可缺缺少的的有機(jī)機(jī)成分分，即即作為為碳源源，又又維持持培養(yǎng)養(yǎng)基的的滲透透壓在MPa。多使用用蔗糖糖，試試管苗苗生長(zhǎng)長(zhǎng)與繁繁殖濃濃度2-3%，，幼胚胚培養(yǎng)養(yǎng)4-6%，某某些特特殊培培養(yǎng)中中用8-10%。細(xì)胞和和原生生質(zhì)體體培養(yǎng)養(yǎng)還用用麥芽芽糖、、葡萄萄糖、、果糖糖。⑵維生生素類類功能參與酶酶的形形成、、蛋白白質(zhì)、、脂肪肪代謝謝，明明顯的的促進(jìn)進(jìn)離體體培養(yǎng)養(yǎng)物的的生長(zhǎng)長(zhǎng)。鹽酸硫硫胺素素-VB1、鹽酸吡吡哆醇醇-VB6、煙酸-Vpp、生物素素-VH、、維生素素C-Vc。。⑶肌醇功能促進(jìn)糖糖的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化、、維生生素和和激素素的利利用，，對(duì)胚胚狀體體和芽芽的形形成有有良好好影響響。用量一一般50-100mg/L。。⑷腺嘌嘌呤合成各各種細(xì)細(xì)胞分分裂素素的前前體物物質(zhì)之之一，，利于于細(xì)胞胞分裂裂，促促進(jìn)芽芽的形形成和和生長(zhǎng)長(zhǎng)。⑸氨基基酸蛋白質(zhì)質(zhì)的成成分，，是有有機(jī)氮氮化合合物，，常用用甘氨氨酸和和多種種氨基基酸混混合物物如水水解酪酪蛋白白、水水解乳乳蛋白白。⑹其它它復(fù)合合成分分成分尚尚不清清楚的的天然然提取取物，，如椰椰乳、、香蕉蕉汁、、酵母母提取取液、、番茄茄汁、、麥芽芽糖等等。3、生生長(zhǎng)調(diào)調(diào)節(jié)物物質(zhì)⑴生長(zhǎng)長(zhǎng)素類類功能促進(jìn)細(xì)細(xì)胞脫脫分化化和細(xì)細(xì)胞伸伸長(zhǎng)，，誘導(dǎo)導(dǎo)愈傷傷組織織產(chǎn)生生生長(zhǎng)素素與細(xì)細(xì)胞分分裂素素協(xié)調(diào)調(diào)作用用，在在離體體培養(yǎng)養(yǎng)中，，生長(zhǎng)長(zhǎng)素促促進(jìn)根根的形形成，，抑制制芽的的形成成。液體培養(yǎng)養(yǎng)中利于于體細(xì)胞胞胚胎發(fā)發(fā)生。常用IAA、、IBA、NAA、2,4-D。IBA促進(jìn)生根根細(xì)胞分裂裂素的生生理效應(yīng)應(yīng)⑵細(xì)胞分分裂素類類功能促進(jìn)細(xì)胞胞分裂和和擴(kuò)大，，調(diào)節(jié)器器官分化化，延緩緩組織衰衰老，增增強(qiáng)蛋白白質(zhì)合成成。離體體培養(yǎng)中中，促進(jìn)進(jìn)不定芽芽的發(fā)生生，與生生長(zhǎng)素協(xié)協(xié)調(diào)作用用可有效效控制培培養(yǎng)物的的生長(zhǎng)與與分化。。常用6-BA、ZT、KT、2iP。。植株的形形態(tài)建成成是CTK和IAA的比值調(diào)調(diào)控的CTK/IAA高，誘導(dǎo)導(dǎo)愈傷組組織形成成芽CTK/IAA低，誘導(dǎo)導(dǎo)愈傷組組織形成成根煙草在不不同細(xì)胞胞分裂素素與生長(zhǎng)長(zhǎng)素濃度度下的生生理效應(yīng)應(yīng)⑶赤霉素素類功能促進(jìn)細(xì)胞胞伸長(zhǎng)生生長(zhǎng)、誘誘導(dǎo)花芽芽形成、、打破種種子休眠眠以及誘誘導(dǎo)單性性結(jié)實(shí)等等。與生長(zhǎng)素素協(xié)調(diào)作作用對(duì)形形成層分分化有影影響，刺刺激體細(xì)細(xì)胞胚進(jìn)進(jìn)一步發(fā)發(fā)育成植植株。有20多多種，目目前主要要是赤霉霉酸GA3。4、水離體培養(yǎng)養(yǎng)中，既既是培養(yǎng)養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)養(yǎng)成分的的溶劑，，又是培培養(yǎng)基的的重要組組成部分分，占培培養(yǎng)基成成分的95%。。原生質(zhì)體體培養(yǎng)、、細(xì)胞培培養(yǎng)及分分生組織織培養(yǎng)一一般應(yīng)用用雙蒸水水或超純純水大批量快快速繁殖殖培養(yǎng)，，可用一一般蒸餾餾水或純純凈水。。5、其它它附加成成分⑴瓊脂功能來(lái)自海藻藻的多糖糖類物質(zhì)質(zhì)，組織織培養(yǎng)中中最常用用作凝固固劑，是是最方便便、最好好的凝固固劑和支支持物。。常用量0.6%-1.0%，，不是培培養(yǎng)基必必需成分分?？ɡz海藻提取取物，含含雜質(zhì)少少純度更更高，凝凝固后培培養(yǎng)基透透明，利利于材料料觀察。。⑵活性炭炭功能常用的吸吸附劑，，某些培培養(yǎng)類型型中，可可以吸附附培養(yǎng)過(guò)過(guò)程中產(chǎn)產(chǎn)生的一一些有毒毒物質(zhì)（（酚類物物質(zhì)），，有利于于培養(yǎng)物物的生長(zhǎng)長(zhǎng)。常用用濃度1～5mg/L左右其吸附作作用選擇擇性較差差，使用用應(yīng)慎重重。常受受溫度影影響，低低溫吸附附效果好好，高溫溫吸附能能力降低低甚至解解吸附。。⑶抗生素素培養(yǎng)基中中添加抗抗生素可可防止菌菌類污染染，常用用的抗生生素有青青霉素、、鏈霉素素、慶大大霉素等等，用量量一般為為5～20mg/L。大部分分抗生素素需要過(guò)過(guò)濾除菌菌。⑷抗氧化化物抗酚類氧氧化常用用的藥劑劑有半胱胱氨酸、、聚乙烯烯吡咯烷烷酮（PVP）及抗壞壞血酸（（Vc），可用用50～200mg／L的濃度洗洗滌剛切切割的外外植體傷傷口表面面，或過(guò)過(guò)濾除菌菌后加入入固體培培養(yǎng)基的的表層。。二、常用用培養(yǎng)基基的種類類、配方方及特點(diǎn)點(diǎn)（一）培培養(yǎng)基種種類1、根據(jù)據(jù)態(tài)相分分：固體培養(yǎng)養(yǎng)基-加凝固固劑的培培養(yǎng)基液體培養(yǎng)養(yǎng)基-不加凝凝固劑的的培養(yǎng)基基。2、根據(jù)培養(yǎng)養(yǎng)過(guò)程分：初代培養(yǎng)基-初次接種外外植體的培養(yǎng)養(yǎng)基。繼代培培養(yǎng)基基-接種種初代代培養(yǎng)養(yǎng)之后后培養(yǎng)養(yǎng)物的的培養(yǎng)基基。3、根據(jù)據(jù)作用用分：：誘導(dǎo)培養(yǎng)基基-誘誘導(dǎo)外外植體體啟動(dòng)動(dòng)生長(zhǎng)長(zhǎng)增殖培養(yǎng)基基-誘誘導(dǎo)離離體培培養(yǎng)苗苗擴(kuò)大大繁殖殖。生根培養(yǎng)基基-誘誘導(dǎo)離離體培培養(yǎng)苗苗生根根4、根根據(jù)營(yíng)營(yíng)養(yǎng)水水平分分：基本培養(yǎng)基基-包包含無(wú)無(wú)機(jī)鹽鹽等基基本營(yíng)營(yíng)養(yǎng)成成分。。完全培養(yǎng)基基-包包含使使植物物離體體生長(zhǎng)長(zhǎng)全面面營(yíng)養(yǎng)養(yǎng)。（二））幾種種常用用培養(yǎng)養(yǎng)基細(xì)胞工工程常常用的的基本本培養(yǎng)養(yǎng)基有有：MS、、MT、、White、、Nitsch、、Blaydes、、N6、B5、NT、、SH、、Miller、、Heller等。。（三三））幾幾種種常常見(jiàn)見(jiàn)培培養(yǎng)養(yǎng)基基的的特特點(diǎn)點(diǎn)1、富鹽鹽平衡培培養(yǎng)基無(wú)機(jī)鹽濃濃度高，，元素比比例適當(dāng)當(dāng)，離子子平衡好好，具有有較強(qiáng)的的緩沖性性，培養(yǎng)養(yǎng)中維持持較好的的穩(wěn)定性性，含高高量氮、、鉀，營(yíng)營(yíng)養(yǎng)豐富富，元素素種類齊齊全，MS培養(yǎng)基使使用最廣廣泛。2、低鹽鹽培養(yǎng)基基無(wú)機(jī)鹽濃濃度低，，有機(jī)成成分含量量低，多多數(shù)作為為生根培培養(yǎng)基、、胚胎培培養(yǎng)使用用，常用用White培養(yǎng)基。。3、高硝硝態(tài)鹽培培養(yǎng)基較低銨鹽鹽，高硝硝酸鹽和和鹽酸硫硫胺素B5培養(yǎng)基適適合雙子子葉植物物特別是是木本植植物的生生長(zhǎng)。N6培養(yǎng)基為為水稻等等禾谷類類花藥培培養(yǎng)設(shè)計(jì)計(jì)，KNO3和（NH4）2SO4含量高,不含鉬鉬。SH培養(yǎng)基(NH4)H2PO4代替（NH4）2SO4,礦質(zhì)濃度度較高，，多數(shù)單單子葉和和雙子葉葉植物上上使用較較好。4、中鹽鹽培養(yǎng)基基大量元素素?zé)o機(jī)鹽鹽為MS的1/2，微量量元素種種類減少少含量增增高，無(wú)無(wú)肌醇維維生素種種類多，，增加生生物素、、葉酸，，有H、Hitsch、Miller、、Blaydes等培養(yǎng)基基，適用用于特殊殊細(xì)胞培培養(yǎng)。第二節(jié)培培養(yǎng)基基的制備備制作一升升培養(yǎng)基基所需藥藥品20多種，，為節(jié)省省時(shí)間和和配制的的準(zhǔn)確，，需將各各種藥品品濃縮成成一定倍倍數(shù)，并并且混合合成一定定母液，，進(jìn)行保保存。制制作培養(yǎng)養(yǎng)基時(shí)根根據(jù)需求求制培養(yǎng)養(yǎng)基數(shù)量量取用母母液。一、培養(yǎng)養(yǎng)基母液液的配制制（一）營(yíng)營(yíng)養(yǎng)成分分的配制制根據(jù)藥品品性質(zhì)將將母液配配制成以以下四類類：1、大量量元素可以混在在一起配配制成10—20倍液液，硫酸酸鎂和氯氯化鈣Ca２+和Mg2+會(huì)與磷酸酸鹽混合合，產(chǎn)生生不溶性性沉淀，，要分別別單獨(dú)配配制Ca２+與PO4-一起混合合易沉淀淀，定容容后消失失。2、微量量元素可配成100——200倍混合合母液，，KI可單獨(dú)配配。3、鐵鹽鹽硫酸亞鐵鐵和EDTA鈉鹽易沉沉淀，需需單獨(dú)配配制，配配成100—200倍倍鰲合劑劑不易沉沉淀。4、有機(jī)機(jī)化合物物維生素、、肌醇、、氨基酸酸等一起起配成100或或200倍液，，也可分分別配制制。（二）植植物生長(zhǎng)長(zhǎng)調(diào)節(jié)物物質(zhì)的配配制植物生長(zhǎng)長(zhǎng)調(diào)節(jié)物物質(zhì)分別別配成母母液儲(chǔ)于于冰箱，，濃度一一般為0.5－－1mg/ml。1、IAA、NAA：：先用少量量95%酒精使使之充分分溶解。。2、2,4－D：可用少量量0.1mol/L的NaOH溶液充分分溶解，，再緩緩緩加蒸餾餾水定容容至需要要的體積積。3、KT和BA等細(xì)胞分裂裂素類：：先用少量量0.1mol/L的HCl溶解，再再用蒸餾餾水定容容至需要要的體積積。（三）藥品用量量的計(jì)算：：配制母液液時(shí)藥品品用量(mg)=配方用量(mg)×濃縮倍數(shù)×制制備容量（L）二、培養(yǎng)基的的制作（一）母液取取用量的計(jì)算算制備培養(yǎng)基時(shí)時(shí)母液取用量量（ml）=1000÷濃縮倍數(shù)×制制備培養(yǎng)基數(shù)數(shù)量（L）（二）培養(yǎng)基基制作程序1、按大量元元素、微量元元素、鐵鹽、、有機(jī)成分順順序?qū)⒛敢喝〕?，混合?！?、適量蒸餾餾水放入加熱熱容器，蒸餾餾水應(yīng)少于所所制培養(yǎng)基數(shù)數(shù)量，約終體體積的2/3-3/4，，接通電源加加熱。3、向加熱容容器中加入稱稱量好的瓊脂（0.6-0.8%），，攪拌加熱，，至完全溶化化。培養(yǎng)基制作程程序圖4、瓊脂熬化化后，稱取相相應(yīng)量的蔗糖（2-3%）），加入加熱熱容器中至溶溶解。5、將母液混混合液加入到到加熱容器中中，攪拌混勻勻。6、蒸餾水定容至所需體積。。7、測(cè)試培養(yǎng)養(yǎng)基溶液的PH值(5.8-6.0)，，過(guò)高滴加0.1mol/L的HCL調(diào)整，過(guò)低滴滴加0.1mol/L的NaOH調(diào)整。8、迅速分裝到培養(yǎng)瓶中，，備用。培養(yǎng)基是離體體培養(yǎng)物賴以以生存和生長(zhǎng)長(zhǎng)的人工環(huán)境境的重要組成成部分，常用用的培養(yǎng)基依依據(jù)其物理狀狀態(tài)的不同分分為固態(tài)培養(yǎng)養(yǎng)基和液態(tài)培培養(yǎng)基。固態(tài)培養(yǎng)基一一般使用瓊脂脂為凝固劑，，也有使用卡卡拉膠或魔芋芋粉為凝固劑劑的。液態(tài)培養(yǎng)基不不使用凝固劑劑，但需要在在容器中置入入適當(dāng)?shù)闹螕挝?，試管為為培養(yǎng)容器的的支撐物可用用濾紙橋，底底面積較大的的培養(yǎng)容器，，支撐物可選選用脫脂棉等等。固體培養(yǎng)基三、培養(yǎng)基及及培養(yǎng)器械的的滅菌制備好的培養(yǎng)養(yǎng)基如果帶菌菌，會(huì)導(dǎo)致植植物離體培養(yǎng)養(yǎng)失敗，因而而還要對(duì)培養(yǎng)養(yǎng)基進(jìn)行滅菌菌處理。（一）高壓蒸蒸汽滅菌培養(yǎng)基的滅菌菌一般采用濕濕熱滅菌法：：1、培養(yǎng)瓶及及培養(yǎng)器械放放入高壓滅菌菌鍋。2、滅菌鍋加加水至淹沒(méi)電電熱絲。3、封閉高壓壓滅菌鍋各出出氣口。4、接通電源源加壓至49kPa（0.05MPa）5、打開(kāi)排氣閥，，排冷氣至壓力0kPa。6、繼續(xù)加壓至108kPa（0.11mPa-0.12Mpa，即121℃））7、壓力至108kPa（0.11mPa-0.12Mpa，即121℃））時(shí)，穩(wěn)壓在此壓力15-20min。8、關(guān)閉電源自然然冷卻至壓力力為0kPa。9、取出培養(yǎng)基和和器械冷卻，，貯存于30℃以下室內(nèi)內(nèi)。（二）干熱滅滅菌培養(yǎng)瓶、三角角瓶、試管等等玻璃器皿及及接種器械，，可以進(jìn)行干干熱滅菌。即將洗滌干干凈的玻璃璃器皿放到到烘箱中，，在150℃溫度下下，干熱滅滅菌1小時(shí)時(shí)，或120℃下滅滅菌2小時(shí)時(shí)。滅菌完畢冷冷卻后取出出器械貯存存。貯存室要保保持無(wú)菌、、干燥、以以免造成培培養(yǎng)基的二二次污染。。滅菌后的培培養(yǎng)基一般般應(yīng)在2周周內(nèi)使用，，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)長(zhǎng)易造成潛潛在的污染染。培養(yǎng)基滅菌菌后如果出出現(xiàn)過(guò)多沉沉淀或瓊脂脂不凝固等等現(xiàn)象，該該培養(yǎng)基不不能繼續(xù)使使用，應(yīng)查查明原因重重新配制。。第三節(jié)外外植體無(wú)無(wú)菌接種一般來(lái)說(shuō)，，無(wú)論何種種類型的細(xì)細(xì)胞工程技技術(shù)，起始始階段均涉涉及外植體體取材、滅滅菌、接種種與培養(yǎng)等等基本過(guò)程程。一、植物材材料的培養(yǎng)養(yǎng)與取材外植體—是指用于于離體培養(yǎng)養(yǎng)的活的植植物組織、、器官等材材料，是植植物離體培培養(yǎng)的基礎(chǔ)礎(chǔ)材料。1、外植體體的來(lái)源-生長(zhǎng)在自自然環(huán)境下下的植物-有目的地地培育在溫溫室控制條條件下生長(zhǎng)長(zhǎng)的植物-無(wú)菌環(huán)境境下已經(jīng)過(guò)過(guò)離體培養(yǎng)養(yǎng)的植物自然環(huán)境中中生長(zhǎng)的植植株，一般般帶有微生生物，甚至至與某些微微生物具有有寄生關(guān)系系，使植株株具有內(nèi)生菌。取自這些些植物的外外植體，在在培養(yǎng)過(guò)程程中會(huì)有微微生物滋生生，從而影影響培養(yǎng)效效果。自然環(huán)境境生長(zhǎng)植植株溫室控制制條件下下生長(zhǎng)植植株已離體培培養(yǎng)植株株多數(shù)情況況下，應(yīng)應(yīng)盡量使使用溫室室或人工工氣候室室控制培培養(yǎng)的植植物材料料作為外外植體來(lái)來(lái)源，減減少培養(yǎng)養(yǎng)過(guò)程中中的微生生物感染染概率。。同時(shí)，，生長(zhǎng)在在控制條條件下的的植物可可以保持持培養(yǎng)料料間的一一致性，，提高實(shí)實(shí)驗(yàn)的可可重復(fù)性性，也便便于培養(yǎng)養(yǎng)技術(shù)的的規(guī)范。。某些多年年生植物物或特殊殊材料，，必須取取自自然然生長(zhǎng)的的植物，，就需要要盡可能能避免使使用那些些生長(zhǎng)過(guò)過(guò)于潮濕濕和不潔潔凈環(huán)境境中的植植物。對(duì)對(duì)于培養(yǎng)養(yǎng)過(guò)程中中可能出出現(xiàn)內(nèi)生生菌污染染的材料料，應(yīng)盡盡量取生生長(zhǎng)旺盛盛期的生生長(zhǎng)點(diǎn)部部位作為為起始培培養(yǎng)的材材料。2、供體植株株的管理取自室外的外外植體材料，，供體植株的的管理十分重重要，這與外外植體培養(yǎng)時(shí)時(shí)的污染率密密切相關(guān)。植植株管理中應(yīng)應(yīng)注意：⑴避免昆蟲(chóng)危危害許多多昆蟲(chóng)如蚜蟲(chóng)蟲(chóng)、螨類和飛飛虱是許多植植物病蟲(chóng)害的的傳播媒介，，會(huì)引起植物物組織的潛在在感染。⑵注意防病尤尤其是真真菌和細(xì)菌病病害的侵染，，取自感病植植株的外植體體，在培養(yǎng)中中的污染率遠(yuǎn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于來(lái)自自健康植株的的外植體，必必要時(shí)需使用用化學(xué)藥劑防防治病害。⑶控制濕度給給供體植植株澆水時(shí)應(yīng)應(yīng)從根部給水水，避免從上上部澆水，以以免上部形成成易于病原侵侵染的濕度環(huán)環(huán)境；盡可能能降低溫室濕濕度；取材前前盡可能保持持植株干爽。。1、材料取材材⑴材料選擇培養(yǎng)材料應(yīng)選選擇有代表性性的主要植物物、選擇性狀狀優(yōu)良的種質(zhì)質(zhì)或特殊的基基因型?？焖俜敝硶r(shí)應(yīng)應(yīng)在植株生長(zhǎng)長(zhǎng)的最適時(shí)期期取材，花藥藥培養(yǎng)應(yīng)在花花粉發(fā)育到單單核期取材。。選取材料的大cm之間。胚胎培培養(yǎng)或脫毒在在0.5cm以下。材料太太大易污染，，材料太小難難于成活。⑵采收從生長(zhǎng)健壯的的無(wú)病蟲(chóng)害的的植株上選取取發(fā)育正常的的器官和組織織。最好采用用莖尖，后代代性狀較穩(wěn)定定，攜帶細(xì)菌菌較少。二、預(yù)處理與與表面滅菌1、預(yù)處理先對(duì)植物材料料進(jìn)行修剪整整理，去掉不不需要部分，，將準(zhǔn)備使用用的植物材料料（外植體））在流水中沖沖洗20-60分鐘，備備用。如特別別不潔的外植植體，可先用用加有洗滌劑劑的水清洗10-15分分鐘，再用流流水沖洗干凈凈。2、表面滅菌菌（1）操作人人員穿戴滅菌菌過(guò)的工作服服、口罩。進(jìn)進(jìn)入接種室前前雙手用洗滌滌劑清洗干凈凈，操作前再再用70%酒酒精或消毒劑劑擦洗雙手。。（2）操作期期間雙手和臺(tái)臺(tái)面常用70%酒精或消消毒劑擦拭。。超凈工作臺(tái)臺(tái)使用前必須須用紫外燈照照射殺菌，然然后開(kāi)啟風(fēng)機(jī)機(jī)。（3）接種用用工具（解剖剖刀、剪刀、、鑷子）可放放入70-75%酒精中中，使用時(shí)需需火焰灼燒滅滅菌，冷卻后后使用。（4）外植體體放入超凈工工作臺(tái)內(nèi)，置置70-75%酒精中5-60秒秒，0.1氯氯化汞6-10分鐘，或或10%的漂漂白粉上清液液中10-15分鐘，然然后用無(wú)菌水水沖洗3-5次。滅菌時(shí)時(shí)需進(jìn)行攪動(dòng)動(dòng)。表面滅菌劑種種類較多，可可選取1-2種使用。常用滅菌劑使使用濃度及效效果比較表滅菌劑使使用濃度度持續(xù)續(xù)時(shí)間去除的難易效效果次氯酸鈣9-10％5-30分鐘易很很好次氯酸鈉2％5-30分鐘易易很很好氯化汞0.1-1％5-10分鐘較較難最最好抗菌素4-50mg／L30-60分鐘中中較較好酒精70-75%0.2-2分分鐘易易好好過(guò)氧化氫10-12%5-15分鐘最最易易好好三、外植體的的接種—無(wú)菌菌接種外植體的接種種是把經(jīng)過(guò)表表面滅菌后的的植物材料切切碎或分離出出器官、組織織、細(xì)胞、轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)放到無(wú)菌培培養(yǎng)基上的全全部操作過(guò)程程。整個(gè)過(guò)程程均需無(wú)菌操操作。（1）借助接接種用工具將將材料切割分分離。（2）將培養(yǎng)養(yǎng)基放入超凈凈工作臺(tái)內(nèi)，，火焰灼燒培培養(yǎng)基瓶口，，然后打開(kāi)培培養(yǎng)瓶口，置置培養(yǎng)瓶為斜斜角，避免灰灰塵落入平中中。（3）迅速將將切割分離下下的所需組織織、細(xì)胞、器器官，放入培培養(yǎng)基上，及及時(shí)蓋上瓶蓋蓋。（4）工具用用后應(yīng)及時(shí)滅滅菌，避免交交叉污染。（5）工作人人員操作時(shí)禁禁止不必要的的談話。第四節(jié)外外植體的培養(yǎng)養(yǎng)接種只是完成成了離體培養(yǎng)養(yǎng)的第一步，，植物離體培培養(yǎng)和栽培植植物一樣，生生長(zhǎng)過(guò)程中也也受到各種環(huán)環(huán)境因素的影影響。培養(yǎng)條條件是離體培培養(yǎng)能否成功功的關(guān)鍵。在在培養(yǎng)基條件件適宜的基礎(chǔ)礎(chǔ)上，影響試試管苗生長(zhǎng)的的主要因素有有光照、溫度度、濕度、氧氧氣。一、外植體的的培養(yǎng)條件1、光照光照對(duì)植物生生長(zhǎng)發(fā)育有重重要作用，是是離體培養(yǎng)中中非常重要的的環(huán)境因素。。光照強(qiáng)度、、光質(zhì)以及光光照時(shí)間，對(duì)對(duì)細(xì)胞的增殖殖、器官的分分化都有很大大影響。除特特殊要求外，，一般都采用用日光燈作光光源，光照強(qiáng)強(qiáng)度1000-5000Lx，根據(jù)不同植物物或器官需要要，可以每天天連續(xù)光照12-16小小時(shí)，也可每每天光照16小時(shí)，8小小時(shí)黑暗。2、溫度離體培培養(yǎng)中中對(duì)溫溫度的的控制制比光光照更更為重重要，，大所所數(shù)植植物最最適溫溫度在在23-32℃℃之間間。培培養(yǎng)室室溫度度是25±±2℃℃。低低于15℃℃時(shí)，，培養(yǎng)養(yǎng)的組組織生生長(zhǎng)停停頓，，高于于35℃對(duì)對(duì)生長(zhǎng)長(zhǎng)也不不利。。因此此，培培養(yǎng)室室應(yīng)安安裝空空調(diào)機(jī)機(jī)或其其他的的控溫溫設(shè)備備。3、濕濕度培養(yǎng)瓶瓶?jī)?nèi)相相對(duì)濕濕度通通常是是100%，而而環(huán)境境中的的相對(duì)對(duì)濕度度會(huì)直直接影影響培培養(yǎng)基基的水水分蒸蒸發(fā)。。因此此，培培養(yǎng)過(guò)過(guò)程中中，培培養(yǎng)室室一般般要求求相對(duì)對(duì)濕度度保持持在70-80%，，相對(duì)對(duì)濕度度過(guò)低低影響響培養(yǎng)養(yǎng)物生生長(zhǎng)和和分化化，應(yīng)應(yīng)向室室內(nèi)噴噴灑水水，以以提高高濕度度；過(guò)過(guò)高雜雜菌滋滋生，，大量量污染染，應(yīng)應(yīng)及時(shí)時(shí)地通通風(fēng)除除濕。。4、氧氧氣離體培培養(yǎng)的的試管管苗是是需要要氧氣氣的，，在固固體培培養(yǎng)或或液體體靜置置培養(yǎng)養(yǎng)時(shí)，，如果果組織織完全全浸入入培養(yǎng)養(yǎng)基中中，與與氧氣氣隔絕絕，就就會(huì)停停止生生長(zhǎng)。。因此此，接接種時(shí)時(shí)要有有部分分組織織合空空氣接接觸。。振蕩蕩培養(yǎng)養(yǎng)是解解決通通氣的的良好好辦法法。固固體培培養(yǎng)中中，如如瓶塞塞不透透氣，，培養(yǎng)養(yǎng)物也也不能能生長(zhǎng)長(zhǎng)，要要選擇擇通氣氣性好好的培培養(yǎng)瓶瓶蓋，，增加加可利利用的的氧氣氣，迅迅速除除去釋釋放出出來(lái)的的CO2，有利于于外植植體外外層細(xì)細(xì)胞開(kāi)開(kāi)始分分裂。。二、外外植體體的成成苗途途徑外植體體的成成苗途途徑有有三種種：（一）外外植體-愈傷組組織-完完整植株株。具體又可可分為三三種：1、愈傷傷組織-同時(shí)長(zhǎng)長(zhǎng)芽和根根-植株株。2、愈傷傷組織-莖-根根-植株株。3、愈傷傷組織-根-芽芽-植株株。（二）外外植體-胚狀體體-植株株?？蓮膹囊韵聨讕追N培養(yǎng)養(yǎng)物中產(chǎn)產(chǎn)生：1、器官官上發(fā)生生。2、愈傷傷組織上上發(fā)生。。3、游離離單細(xì)胞胞發(fā)生。。4、小孢孢子發(fā)生生。誘導(dǎo)胚狀狀體比誘誘導(dǎo)芽數(shù)數(shù)量多、、速度快快、結(jié)構(gòu)構(gòu)完整。。（三）外外植體-直接形形成根與與芽-植植株。如如莖尖培培養(yǎng)三、培養(yǎng)養(yǎng)中常見(jiàn)見(jiàn)問(wèn)題（一）污染的原因及及其預(yù)防防措施1、污染原原因污染是指指在組織織培養(yǎng)過(guò)過(guò)程中培培養(yǎng)基和和培養(yǎng)材材料滋生生雜菌，，導(dǎo)致培培養(yǎng)失敗敗的現(xiàn)象象。病原菌：：細(xì)菌及及真菌兩兩大類。。⑴細(xì)菌污污染特點(diǎn)點(diǎn)-菌斑呈黏黏液狀，，接種后后1-2天發(fā)現(xiàn)。。污染途徑徑：外外植體體帶菌培養(yǎng)基及及器皿滅滅菌不徹徹底操作人員員未遵守守操作規(guī)規(guī)程⑵真菌污污染的特特點(diǎn)-污染部分分長(zhǎng)有不不同顏色色的霉菌菌，接種種后3-10天發(fā)現(xiàn)。。污染途徑徑：周周?chē)h(huán)境境不清潔潔超凈工作作臺(tái)過(guò)濾濾裝置失失效培養(yǎng)瓶的的口徑過(guò)過(guò)大2、污染的的預(yù)防措措施⑴防止材材料帶菌菌的措施施-莖尖作外外植體時(shí)時(shí)，進(jìn)行行預(yù)培養(yǎng)養(yǎng)（無(wú)糖糖）或暗暗培養(yǎng)。。無(wú)糖營(yíng)營(yíng)養(yǎng)液或或自來(lái)水水使枝條條抽枝，，以新抽抽嫩枝作作外植體體。-晴天取材材，下午午取材，，經(jīng)日曬曬過(guò)可殺殺死部分分細(xì)菌或或真菌。。-接種時(shí)除除去外部部韌皮組組織，只只接內(nèi)部部的分生生組織。。（2）外植體體的滅菌菌-多次滅菌菌法，次次氯酸鈉鈉-無(wú)菌水-次氯酸鈉鈉-多種藥液液交替浸浸泡法，，肥皂水水-酒精-次氯酸鈉鈉-無(wú)菌水。。⑶器皿與與金屬器器械的滅滅菌玻璃器皿皿可采用用濕熱滅滅菌或干干熱滅菌菌金屬器皿皿一般火火焰滅菌菌，也可可干熱滅滅菌⑷布質(zhì)制制品的滅滅菌濕濕熱滅滅菌⑸無(wú)菌操操作室的的滅菌2%新捷爾滅滅或70%酒精擦拭拭（噴霧霧），紫紫外燈照照射，定定期甲醛醛和高錳錳酸鉀熏熏蒸。⑹嚴(yán)格按照照操作程程序。（二）外外植體的的褐變及其防止止措施。。1、褐變的的原因褐變是指指外植體體在培養(yǎng)養(yǎng)過(guò)程中中體內(nèi)的的多酚氧氧化酶被被激活，，使細(xì)胞胞內(nèi)的酚酚類物質(zhì)質(zhì)氧化成成棕褐色色的醌類類物質(zhì)，，這種致致死的褐褐變物向向外擴(kuò)散散致使培培養(yǎng)基逐逐漸變成成褐色，，抑制其其它酶的的活性，，影響外外植體的的分化，，最后變變褐死亡亡的現(xiàn)象象。⑴基因型型某某些植物物酚類物物質(zhì)含量量較多。。⑵外植體體的生理理狀態(tài)幼幼年年的材料料培養(yǎng)含含醌類物物質(zhì)較少少。⑶培養(yǎng)基基的成分分-過(guò)高的無(wú)無(wú)機(jī)鹽濃濃度-生長(zhǎng)調(diào)節(jié)節(jié)物質(zhì)使使用不當(dāng)當(dāng)，BA過(guò)多-分生能力力強(qiáng)的材材料，氧氧化受抑抑制，褐褐變也被被抑制-培養(yǎng)條件件不適宜宜，溫度度過(guò)高或或光照過(guò)過(guò)強(qiáng)，褐褐變加速速。⑷材料轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移時(shí)間間時(shí)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)長(zhǎng)引起材材料褐變變。2、褐變的的防止措措施⑴選擇適適宜的外外植體及及最佳培培養(yǎng)基。。⑵連續(xù)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移。⑶加抗氧氧化物。。⑷加活性性炭。0.1-0.5%活性炭（三）玻璃化現(xiàn)象及其其預(yù)防措措施1、玻璃化化現(xiàn)象及及其產(chǎn)生生原因玻璃化是是在細(xì)胞胞生長(zhǎng)過(guò)過(guò)程中的的環(huán)境產(chǎn)產(chǎn)生變化化，試管管苗為了了適應(yīng)變變化了的的環(huán)境而而呈玻璃璃狀。主主要原因因是：⑴激素濃濃度BA濃度提高高，導(dǎo)致致玻璃化化苗的產(chǎn)產(chǎn)生。⑵瓊脂濃濃度瓊瓊脂濃度度低，玻玻璃化苗苗增加。。⑶溫度低低溫易易形成玻玻璃化苗苗。⑷光照時(shí)時(shí)間一一般要求求10-12h，大于15h玻璃苗增增加。⑸通風(fēng)條條件培培養(yǎng)瓶容容量小，，氣體交交換不良良，玻璃璃化苗多多。⑥離子水水平植植物種類類不同，，離子形形態(tài)比例例量要求求不同。。2、預(yù)防措措施⑴控制無(wú)無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)養(yǎng)成分，，降低氮氮（銨態(tài)態(tài)氮）和和氯。⑵提高蔗蔗糖和瓊瓊脂濃度度⑶降低細(xì)細(xì)胞分裂裂素和赤赤霉素濃濃度，增增加生長(zhǎng)長(zhǎng)素比例例。⑷增加自自然光照照1000-1800lx，控制光光照時(shí)間間8-12h。⑸適溫溫生長(zhǎng)，，熱擊處處理防止止玻璃化化發(fā)生。。⑥使用透透氣性好好的封口口膜。⑺培養(yǎng)基基中加入入間苯三三酚、根根皮苷或或多效唑唑、矮壯壯素。第五節(jié)試試管管苗的馴馴化移栽栽一、試管管苗的特特點(diǎn)1、試管苗苗的生態(tài)態(tài)環(huán)境組織培養(yǎng)養(yǎng)出來(lái)的的苗通稱稱試管苗苗或組培培苗。試管苗長(zhǎng)長(zhǎng)期生活活在密閉閉容器中中，形成成其獨(dú)特特生態(tài)系系統(tǒng)，與與外界環(huán)環(huán)境相比比，有四四大差異異⑴高恒溫溫試管苗整整個(gè)生長(zhǎng)長(zhǎng)過(guò)程中中采用的的是恒溫溫培養(yǎng)，，溫差很很小。并并且溫度度一般控控制在25+2℃甚至更高高。外界環(huán)境境條件溫溫度不斷斷變化，，其調(diào)節(jié)節(jié)由太陽(yáng)陽(yáng)輻射決決定，溫溫差很大大，而且且一般不不會(huì)達(dá)到到25+2℃。⑵高濕試管瓶?jī)?nèi)內(nèi)水分移移動(dòng)途徑徑有兩條條：試管苗水水分從氣氣孔蒸騰騰培養(yǎng)基向向外蒸發(fā)發(fā)，凝結(jié)結(jié)后又進(jìn)進(jìn)入培養(yǎng)養(yǎng)基水分移動(dòng)動(dòng)循環(huán)造造成瓶?jī)?nèi)內(nèi)相對(duì)濕濕度接近近100%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大大于瓶外外空氣濕濕度，故故試管苗苗蒸騰小小。⑶弱光試管瓶?jī)?nèi)內(nèi)光照一一般比太太陽(yáng)光弱弱，幼苗苗生長(zhǎng)也也較弱，，不能受受太陽(yáng)光光直接照照射。⑷無(wú)菌試管苗所所在環(huán)境境無(wú)菌，，與外界界有菌環(huán)環(huán)境不同同，試管管苗也無(wú)無(wú)菌，同同時(shí)，培培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)內(nèi)氣體環(huán)環(huán)境較為為特殊，，與外界界環(huán)境有有很大差差異。2、試管苗苗特點(diǎn)⑴試管苗苗生長(zhǎng)細(xì)細(xì)弱、莖莖葉表面面角質(zhì)層層不發(fā)達(dá)達(dá)⑵葉綠體體的光合合作用較較差⑶葉片氣氣孔數(shù)目目少，活活性差⑷根的吸吸收功能能差⑸對(duì)逆境境的適應(yīng)應(yīng)性和抵抵抗能力力較差二、試管管苗的馴馴化1、馴化的的目的提高試管管苗對(duì)外外界環(huán)境境條件的的適應(yīng)性性，提高高光合能能力，使使試管苗苗健壯，，提高試試管苗移移栽成活活率。2、馴化原原則調(diào)節(jié)溫濕濕光和無(wú)無(wú)菌等環(huán)環(huán)境要素素，開(kāi)始始和培養(yǎng)養(yǎng)條件相相似，后后期與預(yù)預(yù)計(jì)栽培培條件相相似。3、馴化方方法將長(zhǎng)有完完整試管管苗的培培養(yǎng)瓶由由培養(yǎng)室室轉(zhuǎn)到伴伴遮蔭的的自然光光下鍛煉煉，并打打開(kāi)瓶蓋蓋注入少少量自來(lái)來(lái)水使幼幼苗逐漸漸降低溫溫度，轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)向有菌菌，一般般進(jìn)行1-2周。三、試管管苗的移移栽1、常規(guī)移移栽法將已誘導(dǎo)導(dǎo)出大量量根的試試管苗，，馴化3-5天，移到到無(wú)菌混混合土中中，當(dāng)長(zhǎng)長(zhǎng)出2-3片新葉時(shí)時(shí)，栽到到田間或或盆缽中中。2、直接移移栽法直接將試試管苗移移栽到盆盆缽的方方法。3、嫁接移移栽法用試管苗苗做接穗穗嫁接在在同一植植物的實(shí)實(shí)生苗上上。嫁接移栽栽優(yōu)點(diǎn)：：1、移栽成成活率高高。2、適用范范圍廣，，嫁接移移栽也適適用于弱弱苗或污污染苗。。3、需時(shí)間間短，20天成活，，緩苗期期10-15天。4、植株生生長(zhǎng)發(fā)育育較快。。四、提高高試管苗苗移栽成成活率的的途徑1、壯苗移移栽比弱弱苗移栽栽成活率率高2、生長(zhǎng)素素（NAA）利于生生根3、低無(wú)機(jī)機(jī)鹽濃度度生根效效果好4、活性炭利利于嫩莖生生根5、避免太陽(yáng)陽(yáng)直射，溫溫度25-30℃，濕度在85%以上6、使試管苗苗逐漸從無(wú)無(wú)菌向有菌菌過(guò)渡思考題：1、分別寫(xiě)出出MS、N6、White培養(yǎng)基特點(diǎn)點(diǎn)。2、寫(xiě)出培養(yǎng)養(yǎng)基高壓滅滅菌操作程程序。3、簡(jiǎn)述植物物離體培養(yǎng)養(yǎng)的無(wú)菌操操作程序。。4、玻璃化現(xiàn)現(xiàn)象的原因因及其預(yù)防防措施。5、試分析外外植體培養(yǎng)養(yǎng)中污染的的防治措施施。6、說(shuō)明試管管苗馴化原原則、目的的和方法。。7、簡(jiǎn)述提高高試管苗移移栽成活率率途徑。9、靜夜四四無(wú)鄰，，荒居舊舊業(yè)貧。。。1月-231月-23Sunday,January1,202310、雨中黃黃葉樹(shù)，，燈下白白頭人。。。14:43:5014:43:5014:431/1/20232:43:50PM11、以我獨(dú)沈久久，愧君相見(jiàn)見(jiàn)頻。。1月-2314:43:5014:43Jan-2301-Jan-2312、故人江海別別，幾度隔山山川。。14:43:5014:43:5014:43Sunday,January1,202313、乍見(jiàn)翻翻疑夢(mèng)，，相悲各各問(wèn)年。。。1月-231月-2314:43:5014:43:50January1,202314、他鄉(xiāng)鄉(xiāng)生白白發(fā)，，舊國(guó)國(guó)見(jiàn)青青山。。。01一一月月20232:43:50下下午14:43:501月-2315、比不了得得就不比，，得不到的的就不要。。。。一月232:43下下午1月-2314:43January1,202316、行動(dòng)出成成果，工作作出財(cái)富。