組織培養(yǎng)第二章植物組織培養(yǎng)基本操作

第二章植物組織培養(yǎng)基本操作宜職院08.9

目的與要求

了解植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基種類、成分及其特點，學習植物組織培養(yǎng)基本操作，了解離體培養(yǎng)環(huán)境條件，以及煉苗移栽基本方法。具有植物組織培養(yǎng)基本操作程序的認知。能夠識別各類培養(yǎng)基特點，熟悉MS培養(yǎng)基成分；具有制作培養(yǎng)基能力，具有選擇外植體、表面滅菌、無菌接種等基本能力；具有植物組織培養(yǎng)條件控制基本能力；有進行組培苗馴化練苗的基本能力。第一節(jié)培養(yǎng)基成分、種類及特點第二節(jié)培養(yǎng)基的制備第三節(jié)外植體無菌接種第四節(jié)外植體培養(yǎng)第五節(jié)試管苗的馴化與移栽組織培養(yǎng)步驟圖（1）準備階段

查閱相關文獻，根據(jù)已成功培養(yǎng)的相近植物資料，結合實際制定出切實可行的培養(yǎng)方案。根據(jù)實驗方案配制適當?shù)幕瘜W消毒劑以及不同培養(yǎng)階段所需的培養(yǎng)基，并經(jīng)高壓滅菌或過濾除菌后備用。（2）外植體的選擇與消毒

選擇合適的部位作為外植體，采回后經(jīng)過處理，然后進行消毒處理。將消毒后的外植體在無菌條件下切割成一定大小的小塊，或剝離出莖尖、挑出花藥，接種到啟動培養(yǎng)基上。（3）啟動培養(yǎng)

接種后的材料置于培養(yǎng)室或光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，促使外植體中已分化的細胞脫分化形成愈傷組織，或頂芽、腋芽直接萌發(fā)形成芽。將愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基分化成不同的器官原基或形成胚狀體，最后發(fā)育形成再生植株。（4）增殖培養(yǎng)

分化形成的芽、原球莖數(shù)量有限，采用適當?shù)脑鲋撑囵B(yǎng)基經(jīng)反復多次切割轉(zhuǎn)接。當芽苗繁殖到一定數(shù)量后，再將一部分用于壯苗生根，另一部分保存或繼續(xù)擴繁。進行脫毒苗培養(yǎng)的還要進行病毒檢測。

（5）生根培養(yǎng)剛形成的芽苗往往比較弱小，多數(shù)無根，此時可降低或不加細胞分裂素濃度，提高生長素濃度，促進芽苗生根，提高其健壯度。（6）煉苗移栽選擇生長健壯，有3～5條根的生根苗進行煉苗，移栽到疏松透氣的基質(zhì)中，注意保溫、保濕、遮蔭。當苗完全成活后，再移向大田。擬定培養(yǎng)方案外植體預處理外植體無菌接種啟動培養(yǎng)分化出芽、胚狀體或原球莖繼代增殖培養(yǎng)生根培養(yǎng)煉苗移栽成活供生產(chǎn)使用植物組織培養(yǎng)的一般程序

培養(yǎng)基配制滅菌第一節(jié)

培養(yǎng)基成分、種類及特點植物生長必需16種基本元素：N、P、K、Ca、Mg、S、Fe、Mn、B、Cu、Zn、Mo、Cl、C、H、O。離體培養(yǎng)條件下，各元素主要從培養(yǎng)基中獲得：H和O來源于水，C來源于添加的糖類，其它礦質(zhì)元素來源于組成培養(yǎng)基的無機鹽。培養(yǎng)基是根據(jù)植物生長所需營養(yǎng)成分，配制成的供植物生長的人工制作的營養(yǎng)物質(zhì)。一、培養(yǎng)基的成分培養(yǎng)基一般包括無機鹽、有機化合物和生長調(diào)節(jié)劑三大基本組成成分。1、無機鹽類

功能離體組織生長發(fā)育的基本成分根據(jù)植物對必需元素需要的量，可以分為以下兩類：

微量元素—植物所需元素的濃度小于10-5～10-7mol/L，F(xiàn)e、Cu、Zn、Mn、Mo、B、Cl。除C、H、O外，其它礦質(zhì)元素通常以離子態(tài)吸收N-硝態(tài)氮和銨態(tài)氮

2、有有機化化合物物培養(yǎng)基基中只只有無無機鹽鹽叫做做基本培培養(yǎng)基基，為使培培養(yǎng)物物更好好的生生長，，還需需添加加有機機成分分，常常用有有糖類類、維維生素素、醇醇類、、嘌呤呤、氨氨基酸酸等。。⑴糖類類功能離體培培養(yǎng)物物生長長與發(fā)發(fā)育不不可缺缺少的的有機機成分分，即即作為為碳源源，又又維持持培養(yǎng)養(yǎng)基的的滲透透壓在MPa。多使用用蔗糖糖，試試管苗苗生長長與繁繁殖濃濃度2-3%，，幼胚胚培養(yǎng)養(yǎng)4-6%，某某些特特殊培培養(yǎng)中中用8-10%。細胞和和原生生質(zhì)體體培養(yǎng)養(yǎng)還用用麥芽芽糖、、葡萄萄糖、、果糖糖。⑵維生生素類類功能參與酶酶的形形成、、蛋白白質(zhì)、、脂肪肪代謝謝，明明顯的的促進進離體體培養(yǎng)養(yǎng)物的的生長長。鹽酸硫硫胺素素-VB1、鹽酸吡吡哆醇醇-VB6、煙酸-Vpp、生物素素-VH、、維生素素C-Vc。。⑶肌醇功能促進糖糖的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化、、維生生素和和激素素的利利用，，對胚胚狀體體和芽芽的形形成有有良好好影響響。用量一一般50-100mg/L。。⑷腺嘌嘌呤合成各各種細細胞分分裂素素的前前體物物質(zhì)之之一，，利于于細胞胞分裂裂，促促進芽芽的形形成和和生長長。⑸氨基基酸蛋白質(zhì)質(zhì)的成成分，，是有有機氮氮化合合物，，常用用甘氨氨酸和和多種種氨基基酸混混合物物如水水解酪酪蛋白白、水水解乳乳蛋白白。⑹其它它復合合成分分成分尚尚不清清楚的的天然然提取取物，，如椰椰乳、、香蕉蕉汁、、酵母母提取取液、、番茄茄汁、、麥芽芽糖等等。3、生生長調(diào)調(diào)節(jié)物物質(zhì)⑴生長長素類類功能促進細細胞脫脫分化化和細細胞伸伸長，，誘導導愈傷傷組織織產(chǎn)生生生長素素與細細胞分分裂素素協(xié)調(diào)調(diào)作用用，在在離體體培養(yǎng)養(yǎng)中，，生長長素促促進根根的形形成，，抑制制芽的的形成成。液體培養(yǎng)養(yǎng)中利于于體細胞胞胚胎發(fā)發(fā)生。常用IAA、、IBA、NAA、2,4-D。IBA促進生根根細胞分裂裂素的生生理效應應⑵細胞分分裂素類類功能促進細胞胞分裂和和擴大，，調(diào)節(jié)器器官分化化，延緩緩組織衰衰老，增增強蛋白白質(zhì)合成成。離體體培養(yǎng)中中，促進進不定芽芽的發(fā)生生，與生生長素協(xié)協(xié)調(diào)作用用可有效效控制培培養(yǎng)物的的生長與與分化。。常用6-BA、ZT、KT、2iP。。植株的形形態(tài)建成成是CTK和IAA的比值調(diào)調(diào)控的CTK/IAA高，誘導導愈傷組組織形成成芽CTK/IAA低，誘導導愈傷組組織形成成根煙草在不不同細胞胞分裂素素與生長長素濃度度下的生生理效應應⑶赤霉素素類功能促進細胞胞伸長生生長、誘誘導花芽芽形成、、打破種種子休眠眠以及誘誘導單性性結實等等。與生長素素協(xié)調(diào)作作用對形形成層分分化有影影響，刺刺激體細細胞胚進進一步發(fā)發(fā)育成植植株。有20多多種，目目前主要要是赤霉霉酸GA3。4、水離體培養(yǎng)養(yǎng)中，既既是培養(yǎng)養(yǎng)基營養(yǎng)養(yǎng)成分的的溶劑，，又是培培養(yǎng)基的的重要組組成部分分，占培培養(yǎng)基成成分的95%。。原生質(zhì)體體培養(yǎng)、、細胞培培養(yǎng)及分分生組織織培養(yǎng)一一般應用用雙蒸水水或超純純水大批量快快速繁殖殖培養(yǎng)，，可用一一般蒸餾餾水或純純凈水。。5、其它它附加成成分⑴瓊脂功能來自海藻藻的多糖糖類物質(zhì)質(zhì)，組織織培養(yǎng)中中最常用用作凝固固劑，是是最方便便、最好好的凝固固劑和支支持物。。常用量0.6%-1.0%，，不是培培養(yǎng)基必必需成分分?？ɡz海藻提取取物，含含雜質(zhì)少少純度更更高，凝凝固后培培養(yǎng)基透透明，利利于材料料觀察。。⑵活性炭炭功能常用的吸吸附劑，，某些培培養(yǎng)類型型中，可可以吸附附培養(yǎng)過過程中產(chǎn)產(chǎn)生的一一些有毒毒物質(zhì)（（酚類物物質(zhì)），，有利于于培養(yǎng)物物的生長長。常用用濃度1～5mg/L左右其吸附作作用選擇擇性較差差，使用用應慎重重。常受受溫度影影響，低低溫吸附附效果好好，高溫溫吸附能能力降低低甚至解解吸附。。⑶抗生素素培養(yǎng)基中中添加抗抗生素可可防止菌菌類污染染，常用用的抗生生素有青青霉素、、鏈霉素素、慶大大霉素等等，用量量一般為為5～20mg/L。大部分分抗生素素需要過過濾除菌菌。⑷抗氧化化物抗酚類氧氧化常用用的藥劑劑有半胱胱氨酸、、聚乙烯烯吡咯烷烷酮（PVP）及抗壞壞血酸（（Vc），可用用50～200mg／L的濃度洗洗滌剛切切割的外外植體傷傷口表面面，或過過濾除菌菌后加入入固體培培養(yǎng)基的的表層。。二、常用用培養(yǎng)基基的種類類、配方方及特點點（一）培培養(yǎng)基種種類1、根據(jù)據(jù)態(tài)相分分：固體培養(yǎng)養(yǎng)基-加凝固固劑的培培養(yǎng)基液體培養(yǎng)養(yǎng)基-不加凝凝固劑的的培養(yǎng)基基。2、根據(jù)培養(yǎng)養(yǎng)過程分：初代培養(yǎng)基-初次接種外外植體的培養(yǎng)養(yǎng)基。繼代培培養(yǎng)基基-接種種初代代培養(yǎng)養(yǎng)之后后培養(yǎng)養(yǎng)物的的培養(yǎng)基基。3、根據(jù)據(jù)作用用分：：誘導培養(yǎng)基基-誘誘導外外植體體啟動動生長長增殖培養(yǎng)基基-誘誘導離離體培培養(yǎng)苗苗擴大大繁殖殖。生根培養(yǎng)基基-誘誘導離離體培培養(yǎng)苗苗生根根4、根根據(jù)營營養(yǎng)水水平分分：基本培養(yǎng)基基-包包含無無機鹽鹽等基基本營營養(yǎng)成成分。。完全培養(yǎng)基基-包包含使使植物物離體體生長長全面面營養(yǎng)養(yǎng)。（二））幾種種常用用培養(yǎng)養(yǎng)基細胞工工程常常用的的基本本培養(yǎng)養(yǎng)基有有：MS、、MT、、White、、Nitsch、、Blaydes、、N6、B5、NT、、SH、、Miller、、Heller等。。（三三））幾幾種種常常見見培培養(yǎng)養(yǎng)基基的的特特點點1、富鹽鹽平衡培培養(yǎng)基無機鹽濃濃度高，，元素比比例適當當，離子子平衡好好，具有有較強的的緩沖性性，培養(yǎng)養(yǎng)中維持持較好的的穩(wěn)定性性，含高高量氮、、鉀，營營養(yǎng)豐富富，元素素種類齊齊全，MS培養(yǎng)基使使用最廣廣泛。2、低鹽鹽培養(yǎng)基基無機鹽濃濃度低，，有機成成分含量量低，多多數(shù)作為為生根培培養(yǎng)基、、胚胎培培養(yǎng)使用用，常用用White培養(yǎng)基。。3、高硝硝態(tài)鹽培培養(yǎng)基較低銨鹽鹽，高硝硝酸鹽和和鹽酸硫硫胺素B5培養(yǎng)基適適合雙子子葉植物物特別是是木本植植物的生生長。N6培養(yǎng)基為為水稻等等禾谷類類花藥培培養(yǎng)設計計，KNO3和（NH4）2SO4含量高,不含鉬鉬。SH培養(yǎng)基(NH4)H2PO4代替（NH4）2SO4,礦質(zhì)濃度度較高，，多數(shù)單單子葉和和雙子葉葉植物上上使用較較好。4、中鹽鹽培養(yǎng)基基大量元素素無機鹽鹽為MS的1/2，微量量元素種種類減少少含量增增高，無無肌醇維維生素種種類多，，增加生生物素、、葉酸，，有H、Hitsch、Miller、、Blaydes等培養(yǎng)基基，適用用于特殊殊細胞培培養(yǎng)。第二節(jié)培培養(yǎng)基基的制備備制作一升升培養(yǎng)基基所需藥藥品20多種，，為節(jié)省省時間和和配制的的準確，，需將各各種藥品品濃縮成成一定倍倍數(shù)，并并且混合合成一定定母液，，進行保保存。制制作培養(yǎng)養(yǎng)基時根根據(jù)需求求制培養(yǎng)養(yǎng)基數(shù)量量取用母母液。一、培養(yǎng)養(yǎng)基母液液的配制制（一）營營養(yǎng)成分分的配制制根據(jù)藥品品性質(zhì)將將母液配配制成以以下四類類：1、大量量元素可以混在在一起配配制成10—20倍液液，硫酸酸鎂和氯氯化鈣Ca２+和Mg2+會與磷酸酸鹽混合合，產(chǎn)生生不溶性性沉淀，，要分別別單獨配配制Ca２+與PO4-一起混合合易沉淀淀，定容容后消失失。2、微量量元素可配成100——200倍混合合母液，，KI可單獨配配。3、鐵鹽鹽硫酸亞鐵鐵和EDTA鈉鹽易沉沉淀，需需單獨配配制，配配成100—200倍倍鰲合劑劑不易沉沉淀。4、有機機化合物物維生素、、肌醇、、氨基酸酸等一起起配成100或或200倍液，，也可分分別配制制。（二）植植物生長長調(diào)節(jié)物物質(zhì)的配配制植物生長長調(diào)節(jié)物物質(zhì)分別別配成母母液儲于于冰箱，，濃度一一般為0.5－－1mg/ml。1、IAA、NAA：：先用少量量95%酒精使使之充分分溶解。。2、2,4－D：可用少量量0.1mol/L的NaOH溶液充分分溶解，，再緩緩緩加蒸餾餾水定容容至需要要的體積積。3、KT和BA等細胞分裂裂素類：：先用少量量0.1mol/L的HCl溶解，再再用蒸餾餾水定容容至需要要的體積積。（三）藥品用量量的計算：：配制母液液時藥品品用量(mg)=配方用量(mg)×濃縮倍數(shù)×制制備容量（L）二、培養(yǎng)基的的制作（一）母液取取用量的計算算制備培養(yǎng)基時時母液取用量量（ml）=1000÷濃縮倍數(shù)×制制備培養(yǎng)基數(shù)數(shù)量（L）（二）培養(yǎng)基基制作程序1、按大量元元素、微量元元素、鐵鹽、、有機成分順順序?qū)⒛敢喝〕觯旌??！?、適量蒸餾餾水放入加熱熱容器，蒸餾餾水應少于所所制培養(yǎng)基數(shù)數(shù)量，約終體體積的2/3-3/4，，接通電源加加熱。3、向加熱容容器中加入稱稱量好的瓊脂（0.6-0.8%），，攪拌加熱，，至完全溶化化。培養(yǎng)基制作程程序圖4、瓊脂熬化化后，稱取相相應量的蔗糖（2-3%）），加入加熱熱容器中至溶溶解。5、將母液混混合液加入到到加熱容器中中，攪拌混勻勻。6、蒸餾水定容至所需體積。。7、測試培養(yǎng)養(yǎng)基溶液的PH值(5.8-6.0)，，過高滴加0.1mol/L的HCL調(diào)整，過低滴滴加0.1mol/L的NaOH調(diào)整。8、迅速分裝到培養(yǎng)瓶中，，備用。培養(yǎng)基是離體體培養(yǎng)物賴以以生存和生長長的人工環(huán)境境的重要組成成部分，常用用的培養(yǎng)基依依據(jù)其物理狀狀態(tài)的不同分分為固態(tài)培養(yǎng)養(yǎng)基和液態(tài)培培養(yǎng)基。固態(tài)培養(yǎng)基一一般使用瓊脂脂為凝固劑，，也有使用卡卡拉膠或魔芋芋粉為凝固劑劑的。液態(tài)培養(yǎng)基不不使用凝固劑劑，但需要在在容器中置入入適當?shù)闹螕挝?，試管為為培養(yǎng)容器的的支撐物可用用濾紙橋，底底面積較大的的培養(yǎng)容器，，支撐物可選選用脫脂棉等等。固體培養(yǎng)基三、培養(yǎng)基及及培養(yǎng)器械的的滅菌制備好的培養(yǎng)養(yǎng)基如果帶菌菌，會導致植植物離體培養(yǎng)養(yǎng)失敗，因而而還要對培養(yǎng)養(yǎng)基進行滅菌菌處理。（一）高壓蒸蒸汽滅菌培養(yǎng)基的滅菌菌一般采用濕濕熱滅菌法：：1、培養(yǎng)瓶及及培養(yǎng)器械放放入高壓滅菌菌鍋。2、滅菌鍋加加水至淹沒電電熱絲。3、封閉高壓壓滅菌鍋各出出氣口。4、接通電源源加壓至49kPa（0.05MPa）5、打開排氣閥，，排冷氣至壓力0kPa。6、繼續(xù)加壓至108kPa（0.11mPa-0.12Mpa，即121℃））7、壓力至108kPa（0.11mPa-0.12Mpa，即121℃））時，穩(wěn)壓在此壓力15-20min。8、關閉電源自然然冷卻至壓力力為0kPa。9、取出培養(yǎng)基和和器械冷卻，，貯存于30℃以下室內(nèi)內(nèi)。（二）干熱滅滅菌培養(yǎng)瓶、三角角瓶、試管等等玻璃器皿及及接種器械，，可以進行干干熱滅菌。即將洗滌干干凈的玻璃璃器皿放到到烘箱中，，在150℃溫度下下，干熱滅滅菌1小時時，或120℃下滅滅菌2小時時。滅菌完畢冷冷卻后取出出器械貯存存。貯存室要保保持無菌、、干燥、以以免造成培培養(yǎng)基的二二次污染。。滅菌后的培培養(yǎng)基一般般應在2周周內(nèi)使用，，時間過長長易造成潛潛在的污染染。培養(yǎng)基滅菌菌后如果出出現(xiàn)過多沉沉淀或瓊脂脂不凝固等等現(xiàn)象，該該培養(yǎng)基不不能繼續(xù)使使用，應查查明原因重重新配制。。第三節(jié)外外植體無無菌接種一般來說，，無論何種種類型的細細胞工程技技術，起始始階段均涉涉及外植體體取材、滅滅菌、接種種與培養(yǎng)等等基本過程程。一、植物材材料的培養(yǎng)養(yǎng)與取材外植體—是指用于于離體培養(yǎng)養(yǎng)的活的植植物組織、、器官等材材料，是植植物離體培培養(yǎng)的基礎礎材料。1、外植體體的來源-生長在自自然環(huán)境下下的植物-有目的地地培育在溫溫室控制條條件下生長長的植物-無菌環(huán)境境下已經(jīng)過過離體培養(yǎng)養(yǎng)的植物自然環(huán)境中中生長的植植株，一般般帶有微生生物，甚至至與某些微微生物具有有寄生關系系，使植株株具有內(nèi)生菌。取自這些些植物的外外植體，在在培養(yǎng)過程程中會有微微生物滋生生，從而影影響培養(yǎng)效效果。自然環(huán)境境生長植植株溫室控制制條件下下生長植植株已離體培培養(yǎng)植株株多數(shù)情況況下，應應盡量使使用溫室室或人工工氣候室室控制培培養(yǎng)的植植物材料料作為外外植體來來源，減減少培養(yǎng)養(yǎng)過程中中的微生生物感染染概率。。同時，，生長在在控制條條件下的的植物可可以保持持培養(yǎng)料料間的一一致性，，提高實實驗的可可重復性性，也便便于培養(yǎng)養(yǎng)技術的的規(guī)范。。某些多年年生植物物或特殊殊材料，，必須取取自自然然生長的的植物，，就需要要盡可能能避免使使用那些些生長過過于潮濕濕和不潔潔凈環(huán)境境中的植植物。對對于培養(yǎng)養(yǎng)過程中中可能出出現(xiàn)內(nèi)生生菌污染染的材料料，應盡盡量取生生長旺盛盛期的生生長點部部位作為為起始培培養(yǎng)的材材料。2、供體植株株的管理取自室外的外外植體材料，，供體植株的的管理十分重重要，這與外外植體培養(yǎng)時時的污染率密密切相關。植植株管理中應應注意：⑴避免昆蟲危危害許多多昆蟲如蚜蟲蟲、螨類和飛飛虱是許多植植物病蟲害的的傳播媒介，，會引起植物物組織的潛在在感染。⑵注意防病尤尤其是真真菌和細菌病病害的侵染，，取自感病植植株的外植體體，在培養(yǎng)中中的污染率遠遠遠高于來自自健康植株的的外植體，必必要時需使用用化學藥劑防防治病害。⑶控制濕度給給供體植植株澆水時應應從根部給水水，避免從上上部澆水，以以免上部形成成易于病原侵侵染的濕度環(huán)環(huán)境；盡可能能降低溫室濕濕度；取材前前盡可能保持持植株干爽。。1、材料取材材⑴材料選擇培養(yǎng)材料應選選擇有代表性性的主要植物物、選擇性狀狀優(yōu)良的種質(zhì)質(zhì)或特殊的基基因型。快速繁殖時應應在植株生長長的最適時期期取材，花藥藥培養(yǎng)應在花花粉發(fā)育到單單核期取材。。選取材料的大cm之間。胚胎培培養(yǎng)或脫毒在在0.5cm以下。材料太太大易污染，，材料太小難難于成活。⑵采收從生長健壯的的無病蟲害的的植株上選取取發(fā)育正常的的器官和組織織。最好采用用莖尖，后代代性狀較穩(wěn)定定，攜帶細菌菌較少。二、預處理與與表面滅菌1、預處理先對植物材料料進行修剪整整理，去掉不不需要部分，，將準備使用用的植物材料料（外植體））在流水中沖沖洗20-60分鐘，備備用。如特別別不潔的外植植體，可先用用加有洗滌劑劑的水清洗10-15分分鐘，再用流流水沖洗干凈凈。2、表面滅菌菌（1）操作人人員穿戴滅菌菌過的工作服服、口罩。進進入接種室前前雙手用洗滌滌劑清洗干凈凈，操作前再再用70%酒酒精或消毒劑劑擦洗雙手。。（2）操作期期間雙手和臺臺面常用70%酒精或消消毒劑擦拭。。超凈工作臺臺使用前必須須用紫外燈照照射殺菌，然然后開啟風機機。（3）接種用用工具（解剖剖刀、剪刀、、鑷子）可放放入70-75%酒精中中，使用時需需火焰灼燒滅滅菌，冷卻后后使用。（4）外植體體放入超凈工工作臺內(nèi)，置置70-75%酒精中5-60秒秒，0.1氯氯化汞6-10分鐘，或或10%的漂漂白粉上清液液中10-15分鐘，然然后用無菌水水沖洗3-5次。滅菌時時需進行攪動動。表面滅菌劑種種類較多，可可選取1-2種使用。常用滅菌劑使使用濃度及效效果比較表滅菌劑使使用濃度度持續(xù)續(xù)時間去除的難易效效果次氯酸鈣9-10％5-30分鐘易很很好次氯酸鈉2％5-30分鐘易易很很好氯化汞0.1-1％5-10分鐘較較難最最好抗菌素4-50mg／L30-60分鐘中中較較好酒精70-75%0.2-2分分鐘易易好好過氧化氫10-12%5-15分鐘最最易易好好三、外植體的的接種—無菌菌接種外植體的接種種是把經(jīng)過表表面滅菌后的的植物材料切切碎或分離出出器官、組織織、細胞、轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)放到無菌培培養(yǎng)基上的全全部操作過程程。整個過程程均需無菌操操作。（1）借助接接種用工具將將材料切割分分離。（2）將培養(yǎng)養(yǎng)基放入超凈凈工作臺內(nèi)，，火焰灼燒培培養(yǎng)基瓶口，，然后打開培培養(yǎng)瓶口，置置培養(yǎng)瓶為斜斜角，避免灰灰塵落入平中中。（3）迅速將將切割分離下下的所需組織織、細胞、器器官，放入培培養(yǎng)基上，及及時蓋上瓶蓋蓋。（4）工具用用后應及時滅滅菌，避免交交叉污染。（5）工作人人員操作時禁禁止不必要的的談話。第四節(jié)外外植體的培養(yǎng)養(yǎng)接種只是完成成了離體培養(yǎng)養(yǎng)的第一步，，植物離體培培養(yǎng)和栽培植植物一樣，生生長過程中也也受到各種環(huán)環(huán)境因素的影影響。培養(yǎng)條條件是離體培培養(yǎng)能否成功功的關鍵。在在培養(yǎng)基條件件適宜的基礎礎上，影響試試管苗生長的的主要因素有有光照、溫度度、濕度、氧氧氣。一、外植體的的培養(yǎng)條件1、光照光照對植物生生長發(fā)育有重重要作用，是是離體培養(yǎng)中中非常重要的的環(huán)境因素。。光照強度、、光質(zhì)以及光光照時間，對對細胞的增殖殖、器官的分分化都有很大大影響。除特特殊要求外，，一般都采用用日光燈作光光源，光照強強度1000-5000Lx，根據(jù)不同植物物或器官需要要，可以每天天連續(xù)光照12-16小小時，也可每每天光照16小時，8小小時黑暗。2、溫度離體培培養(yǎng)中中對溫溫度的的控制制比光光照更更為重重要，，大所所數(shù)植植物最最適溫溫度在在23-32℃℃之間間。培培養(yǎng)室室溫度度是25±±2℃℃。低低于15℃℃時，，培養(yǎng)養(yǎng)的組組織生生長停停頓，，高于于35℃對對生長長也不不利。。因此此，培培養(yǎng)室室應安安裝空空調(diào)機機或其其他的的控溫溫設備備。3、濕濕度培養(yǎng)瓶瓶內(nèi)相相對濕濕度通通常是是100%，而而環(huán)境境中的的相對對濕度度會直直接影影響培培養(yǎng)基基的水水分蒸蒸發(fā)。。因此此，培培養(yǎng)過過程中中，培培養(yǎng)室室一般般要求求相對對濕度度保持持在70-80%，，相對對濕度度過低低影響響培養(yǎng)養(yǎng)物生生長和和分化化，應應向室室內(nèi)噴噴灑水水，以以提高高濕度度；過過高雜雜菌滋滋生，，大量量污染染，應應及時時地通通風除除濕。。4、氧氧氣離體培培養(yǎng)的的試管管苗是是需要要氧氣氣的，，在固固體培培養(yǎng)或或液體體靜置置培養(yǎng)養(yǎng)時，，如果果組織織完全全浸入入培養(yǎng)養(yǎng)基中中，與與氧氣氣隔絕絕，就就會停停止生生長。。因此此，接接種時時要有有部分分組織織合空空氣接接觸。。振蕩蕩培養(yǎng)養(yǎng)是解解決通通氣的的良好好辦法法。固固體培培養(yǎng)中中，如如瓶塞塞不透透氣，，培養(yǎng)養(yǎng)物也也不能能生長長，要要選擇擇通氣氣性好好的培培養(yǎng)瓶瓶蓋，，增加加可利利用的的氧氣氣，迅迅速除除去釋釋放出出來的的CO2，有利于于外植植體外外層細細胞開開始分分裂。。二、外外植體體的成成苗途途徑外植體體的成成苗途途徑有有三種種：（一）外外植體-愈傷組組織-完完整植株株。具體又可可分為三三種：1、愈傷傷組織-同時長長芽和根根-植株株。2、愈傷傷組織-莖-根根-植株株。3、愈傷傷組織-根-芽芽-植株株。（二）外外植體-胚狀體體-植株株?？蓮膹囊韵聨讕追N培養(yǎng)養(yǎng)物中產(chǎn)產(chǎn)生：1、器官官上發(fā)生生。2、愈傷傷組織上上發(fā)生。。3、游離離單細胞胞發(fā)生。。4、小孢孢子發(fā)生生。誘導胚狀狀體比誘誘導芽數(shù)數(shù)量多、、速度快快、結構構完整。。（三）外外植體-直接形形成根與與芽-植植株。如如莖尖培培養(yǎng)三、培養(yǎng)養(yǎng)中常見見問題（一）污染的原因及及其預防防措施1、污染原原因污染是指指在組織織培養(yǎng)過過程中培培養(yǎng)基和和培養(yǎng)材材料滋生生雜菌，，導致培培養(yǎng)失敗敗的現(xiàn)象象。病原菌：：細菌及及真菌兩兩大類。。⑴細菌污污染特點點-菌斑呈黏黏液狀，，接種后后1-2天發(fā)現(xiàn)。。污染途徑徑：外外植體體帶菌培養(yǎng)基及及器皿滅滅菌不徹徹底操作人員員未遵守守操作規(guī)規(guī)程⑵真菌污污染的特特點-污染部分分長有不不同顏色色的霉菌菌，接種種后3-10天發(fā)現(xiàn)。。污染途徑徑：周周圍環(huán)境境不清潔潔超凈工作作臺過濾濾裝置失失效培養(yǎng)瓶的的口徑過過大2、污染的的預防措措施⑴防止材材料帶菌菌的措施施-莖尖作外外植體時時，進行行預培養(yǎng)養(yǎng)（無糖糖）或暗暗培養(yǎng)。。無糖營營養(yǎng)液或或自來水水使枝條條抽枝，，以新抽抽嫩枝作作外植體體。-晴天取材材，下午午取材，，經(jīng)日曬曬過可殺殺死部分分細菌或或真菌。。-接種時除除去外部部韌皮組組織，只只接內(nèi)部部的分生生組織。。（2）外植體體的滅菌菌-多次滅菌菌法，次次氯酸鈉鈉-無菌水-次氯酸鈉鈉-多種藥液液交替浸浸泡法，，肥皂水水-酒精-次氯酸鈉鈉-無菌水。。⑶器皿與與金屬器器械的滅滅菌玻璃器皿皿可采用用濕熱滅滅菌或干干熱滅菌菌金屬器皿皿一般火火焰滅菌菌，也可可干熱滅滅菌⑷布質(zhì)制制品的滅滅菌濕濕熱滅滅菌⑸無菌操操作室的的滅菌2%新捷爾滅滅或70%酒精擦拭拭（噴霧霧），紫紫外燈照照射，定定期甲醛醛和高錳錳酸鉀熏熏蒸。⑹嚴格按照照操作程程序。（二）外外植體的的褐變及其防止止措施。。1、褐變的的原因褐變是指指外植體體在培養(yǎng)養(yǎng)過程中中體內(nèi)的的多酚氧氧化酶被被激活，，使細胞胞內(nèi)的酚酚類物質(zhì)質(zhì)氧化成成棕褐色色的醌類類物質(zhì)，，這種致致死的褐褐變物向向外擴散散致使培培養(yǎng)基逐逐漸變成成褐色，，抑制其其它酶的的活性，，影響外外植體的的分化，，最后變變褐死亡亡的現(xiàn)象象。⑴基因型型某某些植物物酚類物物質(zhì)含量量較多。。⑵外植體體的生理理狀態(tài)幼幼年年的材料料培養(yǎng)含含醌類物物質(zhì)較少少。⑶培養(yǎng)基基的成分分-過高的無無機鹽濃濃度-生長調(diào)節(jié)節(jié)物質(zhì)使使用不當當，BA過多-分生能力力強的材材料，氧氧化受抑抑制，褐褐變也被被抑制-培養(yǎng)條件件不適宜宜，溫度度過高或或光照過過強，褐褐變加速速。⑷材料轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移時間間時時間過長長引起材材料褐變變。2、褐變的的防止措措施⑴選擇適適宜的外外植體及及最佳培培養(yǎng)基。。⑵連續(xù)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移。⑶加抗氧氧化物。。⑷加活性性炭。0.1-0.5%活性炭（三）玻璃化現(xiàn)象及其其預防措措施1、玻璃化化現(xiàn)象及及其產(chǎn)生生原因玻璃化是是在細胞胞生長過過程中的的環(huán)境產(chǎn)產(chǎn)生變化化，試管管苗為了了適應變變化了的的環(huán)境而而呈玻璃璃狀。主主要原因因是：⑴激素濃濃度BA濃度提高高，導致致玻璃化化苗的產(chǎn)產(chǎn)生。⑵瓊脂濃濃度瓊瓊脂濃度度低，玻玻璃化苗苗增加。。⑶溫度低低溫易易形成玻玻璃化苗苗。⑷光照時時間一一般要求求10-12h，大于15h玻璃苗增增加。⑸通風條條件培培養(yǎng)瓶容容量小，，氣體交交換不良良，玻璃璃化苗多多。⑥離子水水平植植物種類類不同，，離子形形態(tài)比例例量要求求不同。。2、預防措措施⑴控制無無機營養(yǎng)養(yǎng)成分，，降低氮氮（銨態(tài)態(tài)氮）和和氯。⑵提高蔗蔗糖和瓊瓊脂濃度度⑶降低細細胞分裂裂素和赤赤霉素濃濃度，增增加生長長素比例例。⑷增加自自然光照照1000-1800lx，控制光光照時間間8-12h。⑸適溫溫生長，，熱擊處處理防止止玻璃化化發(fā)生。。⑥使用透透氣性好好的封口口膜。⑺培養(yǎng)基基中加入入間苯三三酚、根根皮苷或或多效唑唑、矮壯壯素。第五節(jié)試試管管苗的馴馴化移栽栽一、試管管苗的特特點1、試管苗苗的生態(tài)態(tài)環(huán)境組織培養(yǎng)養(yǎng)出來的的苗通稱稱試管苗苗或組培培苗。試管苗長長期生活活在密閉閉容器中中，形成成其獨特特生態(tài)系系統(tǒng)，與與外界環(huán)環(huán)境相比比，有四四大差異異⑴高恒溫溫試管苗整整個生長長過程中中采用的的是恒溫溫培養(yǎng)，，溫差很很小。并并且溫度度一般控控制在25+2℃甚至更高高。外界環(huán)境境條件溫溫度不斷斷變化，，其調(diào)節(jié)節(jié)由太陽陽輻射決決定，溫溫差很大大，而且且一般不不會達到到25+2℃。⑵高濕試管瓶內(nèi)內(nèi)水分移移動途徑徑有兩條條：試管苗水水分從氣氣孔蒸騰騰培養(yǎng)基向向外蒸發(fā)發(fā)，凝結結后又進進入培養(yǎng)養(yǎng)基水分移動動循環(huán)造造成瓶內(nèi)內(nèi)相對濕濕度接近近100%，遠遠大大于瓶外外空氣濕濕度，故故試管苗苗蒸騰小小。⑶弱光試管瓶內(nèi)內(nèi)光照一一般比太太陽光弱弱，幼苗苗生長也也較弱，，不能受受太陽光光直接照照射。⑷無菌試管苗所所在環(huán)境境無菌，，與外界界有菌環(huán)環(huán)境不同同，試管管苗也無無菌，同同時，培培養(yǎng)瓶內(nèi)內(nèi)氣體環(huán)環(huán)境較為為特殊，，與外界界環(huán)境有有很大差差異。2、試管苗苗特點⑴試管苗苗生長細細弱、莖莖葉表面面角質(zhì)層層不發(fā)達達⑵葉綠體體的光合合作用較較差⑶葉片氣氣孔數(shù)目目少，活活性差⑷根的吸吸收功能能差⑸對逆境境的適應應性和抵抵抗能力力較差二、試管管苗的馴馴化1、馴化的的目的提高試管管苗對外外界環(huán)境境條件的的適應性性，提高高光合能能力，使使試管苗苗健壯，，提高試試管苗移移栽成活活率。2、馴化原原則調(diào)節(jié)溫濕濕光和無無菌等環(huán)環(huán)境要素素，開始始和培養(yǎng)養(yǎng)條件相相似，后后期與預預計栽培培條件相相似。3、馴化方方法將長有完完整試管管苗的培培養(yǎng)瓶由由培養(yǎng)室室轉(zhuǎn)到伴伴遮蔭的的自然光光下鍛煉煉，并打打開瓶蓋蓋注入少少量自來來水使幼幼苗逐漸漸降低溫溫度，轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)向有菌菌，一般般進行1-2周。三、試管管苗的移移栽1、常規(guī)移移栽法將已誘導導出大量量根的試試管苗，，馴化3-5天，移到到無菌混混合土中中，當長長出2-3片新葉時時，栽到到田間或或盆缽中中。2、直接移移栽法直接將試試管苗移移栽到盆盆缽的方方法。3、嫁接移移栽法用試管苗苗做接穗穗嫁接在在同一植植物的實實生苗上上。嫁接移栽栽優(yōu)點：：1、移栽成成活率高高。2、適用范范圍廣，，嫁接移移栽也適適用于弱弱苗或污污染苗。。3、需時間間短，20天成活，，緩苗期期10-15天。4、植株生生長發(fā)育育較快。。四、提高高試管苗苗移栽成成活率的的途徑1、壯苗移移栽比弱弱苗移栽栽成活率率高2、生長素素（NAA）利于生生根3、低無機機鹽濃度度生根效效果好4、活性炭利利于嫩莖生生根5、避免太陽陽直射，溫溫度25-30℃，濕度在85%以上6、使試管苗苗逐漸從無無菌向有菌菌過渡思考題：1、分別寫出出MS、N6、White培養(yǎng)基特點點。2、寫出培養(yǎng)養(yǎng)基高壓滅滅菌操作程程序。3、簡述植物物離體培養(yǎng)養(yǎng)的無菌操操作程序。。4、玻璃化現(xiàn)現(xiàn)象的原因因及其預防防措施。5、試分析外外植體培養(yǎng)養(yǎng)中污染的的防治措施施。6、說明試管管苗馴化原原則、目的的和方法。。7、簡述提高高試管苗移移栽成活率率途徑。9、靜夜四四無鄰，，荒居舊舊業(yè)貧。。。1月-231月-23Sunday,January1,202310、雨中黃黃葉樹，，燈下白白頭人。。。14:43:5014:43:5014:431/1/20232:43:50PM11、以我獨沈久久，愧君相見見頻。。1月-2314:43:5014:43Jan-2301-Jan-2312、故人江海別別，幾度隔山山川。。14:43:5014:43:5014:43Sunday,January1,202313、乍見翻翻疑夢，，相悲各各問年。。。1月-231月-2314:43:5014:43:50January1,202314、他鄉(xiāng)鄉(xiāng)生白白發(fā)，，舊國國見青青山。。。01一一月月20232:43:50下下午14:43:501月-2315、比不了得得就不比，，得不到的的就不要。。。。一月232:43下下午1月-2314:43January1,202316、行動出成成果，工作作出財富。