第四章植物組織培養(yǎng)技術(shù)二

第三節(jié)植物離體繁殖

植物離體繁殖（propagationinvitro）又稱植物快繁或微繁，是指利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)對外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)，使其短期內(nèi)獲得遺傳性一致的大量再生植株的方法。一、概念和特點(diǎn)（一）概念2I概述

1、繁殖效率高。2、培養(yǎng)條件可控性強(qiáng)。3、占用空間小。4、管理方便，利于自動化控制。5、便于種質(zhì)保存和交換。（二）特點(diǎn)3二、植物快繁器官形成方式（再分化形成植株的方式）根據(jù)器官形成方式的不同，將植物器官的再生分為五種類型，即短枝發(fā)生型（不定芽型）、叢生芽發(fā)生型（器官型）、器官發(fā)生性、胚狀體發(fā)生型和原球莖發(fā)生型。（一）短枝發(fā)生型（不定芽型）

短枝發(fā)生型是指外植體攜帶的帶葉莖段，在適宜的培養(yǎng)環(huán)境中萌發(fā)，形成完整植株，再將其剪成帶葉莖段，繼代再成苗的繁殖方法。5特點(diǎn)：①繁殖率高，利用外植體的芽特別是原受到抑制的腋芽和大量形成不定芽。②能保持該種植物遺傳穩(wěn)定性。③可使繁殖周期長的林木縮短其童年期（二）叢生芽發(fā)生型(器官型)

叢生芽發(fā)生型是指使外植體攜帶的頂芽或腋芽在適宜培養(yǎng)環(huán)境中不斷發(fā)生腋芽而呈叢生狀芽，或者直接從外植體上長出多個從芽，將單個芽轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)生根成苗的繁殖方法。叢生芽發(fā)生型是大多數(shù)植物快繁的主要途徑，它不經(jīng)過愈傷組織，能使無性系后代保持原品種的特性，在生產(chǎn)中普遍應(yīng)用。67特點(diǎn)：①繁殖率非常高，但繁殖速度較慢。②遺傳性穩(wěn)定。（三）器官發(fā)生型（已講過）是指外植體在適宜培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下，經(jīng)過脫分化形成愈傷組織，然后經(jīng)過再分化誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)生不定芽，或外植體不形成愈傷組織而直接從其表面形成不定芽，將芽苗轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中，經(jīng)培養(yǎng)獲得完整植株的繁殖方法。①繁殖速度較快。②遺傳性不穩(wěn)定，已產(chǎn)生變異。③愈傷組織是遺傳轉(zhuǎn)化、細(xì)胞培養(yǎng)或原生質(zhì)體培養(yǎng)的良好材料器官發(fā)生型也是許多植物快繁的主要方式。由于不定芽形成的數(shù)量與腋芽數(shù)目無關(guān)，其增殖率高于叢生芽發(fā)生型。但經(jīng)過愈傷組織途徑或者多次繼代培養(yǎng)后，容易導(dǎo)致細(xì)胞分裂不正常，增加變異植株發(fā)生頻率。如香蕉繼代次數(shù)控制在8代之內(nèi)，再生植株的變異率則可控制在3%左右。9表現(xiàn)嵌合性狀的植株通過此方式再生時，往往導(dǎo)致嵌合性狀發(fā)生分離而失去原有價值。如觀賞植物色彩鑲嵌的葉子、帶金邊或者銀邊等性狀的植物，通過器官發(fā)生性途徑再生植株時，可能導(dǎo)致這些觀賞性狀消失。這類植株快繁時，應(yīng)通過叢生芽途徑進(jìn)行。10ABEC花燭葉片片離體培培養(yǎng)及植植株再生生11（四）胚胚狀體發(fā)發(fā)生型胚狀體發(fā)發(fā)生型是指外植植體在適適宜培養(yǎng)養(yǎng)環(huán)境中中，經(jīng)誘誘導(dǎo)產(chǎn)生生體細(xì)胞胞胚的繁繁殖方法法，從從而形成成小植株株的繁殖殖方法。。分為間接途徑徑（經(jīng)愈傷傷途徑））和直接途徑徑兩種。胚狀體發(fā)發(fā)生途徑徑具有成成苗數(shù)量量大、速速度快、、結(jié)構(gòu)完完整的特點(diǎn)，因而是是外植體體增殖系數(shù)數(shù)最大的的途徑。12胚狀體發(fā)發(fā)生型特點(diǎn)：①①胚狀體體發(fā)生數(shù)數(shù)量多、、速度快快、結(jié)構(gòu)構(gòu)完整、、繁殖系系數(shù)高。。②遺傳傳性穩(wěn)定定13菊花花瓣體細(xì)胞胚胎發(fā)生及體胚發(fā)育過程的掃描電鏡觀察14（五）原原球莖發(fā)發(fā)生型原球莖發(fā)發(fā)生型是蘭科植植物的一一種快繁繁方式，，它是指指莖尖或或腋芽外外植體經(jīng)經(jīng)培養(yǎng)產(chǎn)產(chǎn)生原球球莖（即即扁球狀狀體、基基部生假假根）的的繁殖類類型。15原球莖是是蘭花種種子發(fā)芽芽過程中中的一種種形態(tài)學(xué)學(xué)構(gòu)造。。種子萌萌發(fā)初期期并不出出現(xiàn)胚根根，只是是胚逐漸漸膨大，，以后種種皮的一一端破裂裂，腫脹脹的胚呈呈小圓錐錐狀，故故稱為原球莖。原球莖是是短縮的的、呈珠珠粒狀的的、由胚胚性細(xì)胞胞組成的的、類似似嫩莖的的器官，，它可以以增殖，，形成原球莖叢叢。由莖尖或腋腋芽外植體誘誘導(dǎo)產(chǎn)生生原球莖莖，切割割原球莖莖進(jìn)行增增殖，或或停止切切割使其其繼續(xù)培培養(yǎng)而轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)綠，產(chǎn)產(chǎn)生毛狀狀假根，，葉原基基發(fā)育成成幼葉，，將其轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移培養(yǎng)養(yǎng)生根，，形成完完整植株株。1617植物快繁繁的程序序包括四四個階段段：無菌（或或初代））培養(yǎng)的的建立繁殖體增增殖芽苗生根根小植株的的移栽馴馴化II植物快繁繁程序18一、無菌菌培養(yǎng)的的建立這個階段段的任務(wù)務(wù)是母株和外外植體的的選取、、無菌培培養(yǎng)物的的獲得及及外植體體的啟動動生長，以利于于離體材材料在適適宜培養(yǎng)養(yǎng)環(huán)境中中以某種種器官發(fā)發(fā)生類型型進(jìn)行增增殖。1921二、增殖殖培養(yǎng)1.培養(yǎng)材料料的增殖殖方式五種方式式。(取決于培養(yǎng)目的的和材料自身身的可能能性。)一般大多多數(shù)植物物采用無菌短枝枝或腋芽芽萌發(fā)或或誘導(dǎo)不不定芽產(chǎn)生，再再以芽繁殖芽芽的方式進(jìn)進(jìn)行增殖殖；蘭科科植物、、百合等等則采用用原球莖增增殖途徑徑，以保障障繁殖材材料的遺遺傳穩(wěn)定定性。222.增殖培養(yǎng)養(yǎng)基增殖率是植株快快速繁殖殖特別是是商業(yè)性性繁殖的的重要指指標(biāo)。外外植體在在每次繼繼代培養(yǎng)養(yǎng)中，應(yīng)應(yīng)能產(chǎn)生生最大數(shù)數(shù)量的有有效繁殖殖體?；九囵B(yǎng)養(yǎng)基一般般與啟動動生長培培養(yǎng)基相相同，而而細(xì)胞分分裂素和和礦物元元素的濃濃度水平平則高于于啟動生生長培養(yǎng)養(yǎng)基。一一般MS+BA1~3mg/ml+NAA0.1~1mg/ml。233.增殖體的的大小和和切割方方法一般攜帶帶一個莖莖節(jié)，但但第一次次增殖的的莖段一一般都有有2~4個莖節(jié)。。莖段可以以垂直插插入培養(yǎng)養(yǎng)基中，，但插入入的深度度不應(yīng)淹淹沒莖節(jié)節(jié)；或水水平放入入培養(yǎng)基基表面，，以刺激激側(cè)芽的的萌動。。24青花菜增增殖枇杷增殖殖2627三、芽苗苗生根將單個芽芽苗轉(zhuǎn)移移到生根根培養(yǎng)基基或適宜宜環(huán)境中中誘導(dǎo)生生根。1.離體生根根（試管管內(nèi)生根根）降低無機(jī)機(jī)鹽濃度度（1/2MS或者1/4MS），減少少或不需需要細(xì)胞胞分裂素素，增加加生長素素的濃度度。對有些植植物，如如果芽苗苗在含有有生長素素的培養(yǎng)養(yǎng)基中生生長1～2d，再轉(zhuǎn)移移至無生生長素的的培養(yǎng)基基中，或或芽苗在在含生長長素的生生根溶液液中浸蘸蘸后直接接插入無無生長素素的培養(yǎng)養(yǎng)基中，，濕度85%以上，溫溫度25℃，弱光或或黑暗條條件。28292.活體生根根（試管管外生根根）芽苗先在在生長素素中快速速浸蘸或或在含有有相對高高濃度生生長素的的培養(yǎng)基基中培養(yǎng)養(yǎng)5~10天，然后后在溫室室中栽入入培養(yǎng)基基質(zhì)，經(jīng)經(jīng)常噴霧霧，給予予高濕度度環(huán)境，，幾天后后便可自自行生根根。30四、移栽栽馴化試管小植植株的移移栽馴化化是試管管苗從異異養(yǎng)到自自養(yǎng)的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)變，有有一個逐逐漸適應(yīng)應(yīng)過程。。移栽前前需對試試管植株株進(jìn)行高高光強(qiáng)煉煉苗，使使植株生生長粗壯壯，并打打開瓶口口，降低低濕度，，使其逐逐漸適應(yīng)應(yīng)外界環(huán)環(huán)境。1.移栽2.馴化管理理31１.移栽首先應(yīng)洗洗去小植植株根部部附著的的培養(yǎng)基基，避免免微生物物的繁殖殖污染，，造成小小苗死亡亡。然后將小小植株栽栽入人工工配制的的混合培培養(yǎng)基質(zhì)質(zhì)中，基基質(zhì)用保保濕又透透氣的材材料，如如蛭石、、珍珠巖巖、粗沙沙、泥炭炭等按比比例混合合，以利利小植株株生長。。幾天后后小植株株可形成成新的功功能根系系。322.馴化管理理移栽的試試管小植植株和活活體生根根的小植植株，其其濕度的的控制十十分重要要。因試試管苗在在高濕（（90％～100％的相對對濕度））環(huán)境中中生長，，莖葉表表面防止止水分散散失的角角質(zhì)層等等幾乎全全無，根根系又不不發(fā)達(dá)，，移栽后后難以保保證水分分平衡，，即使根根系周圍圍有足夠夠的水分分也不行行。所以以，應(yīng)采采用加覆覆塑料薄薄膜、經(jīng)經(jīng)常噴霧霧的方法法，提高高小植株株周圍的的空氣濕濕度，減減少葉面面蒸騰。。同時，，逐漸降降低空氣氣相對濕濕度，使使其適應(yīng)應(yīng)自然環(huán)環(huán)境條件件。33移栽小植植株還應(yīng)應(yīng)注意光光、溫控控制。移栽初期期光照強(qiáng)強(qiáng)度應(yīng)較較弱，經(jīng)經(jīng)過一段段時間適適應(yīng)后，，增加光光照強(qiáng)度度（漫射射），如如1500～4000lx，甚至10000lx。移栽小植植株生長長所需的的適宜溫溫度與植植物種類類有關(guān)，，喜溫性性植物以以25℃左右為宜宜，喜涼性性植物則以以18～20℃為好。溫溫度過高導(dǎo)導(dǎo)致蒸騰作作用加強(qiáng)，，水分失衡衡，微生物物滋生等；；溫度過低低則使幼苗苗生長遲緩緩或不易存存活。如使使基質(zhì)溫度度高于空氣氣溫度2～3℃，則有利利于生根和和促進(jìn)根系系發(fā)育，提提高存活率率。34此外，在移移栽小植株株的馴化管管理階段，，還應(yīng)防止止菌類滋生生，適當(dāng)噴噴一定濃度度的殺菌劑劑（殺菌靈靈）可有效效保護(hù)移栽栽小植株的的正常生長長。3536III影響植物快快繁的因素素37植物快繁的的目的是以以盡可能高高的效率生生產(chǎn)試管苗苗，獲得最最大的經(jīng)濟(jì)濟(jì)效益。因因此，在快快繁時應(yīng)使使各種影響響因素處于于最適合快快繁的狀態(tài)態(tài)。一、外植體體38外植體的來來源：最適的為為莖尖、帶帶芽莖段，，也可以利利用葉片、、子葉、根根段、花器器官組織等等。外植體生理理年齡：幼嫩組織織分化能力力更強(qiáng)。外植體大小小：不能太小小，否則影影響成活率率。除非是是用于脫毒毒苗的生產(chǎn)產(chǎn)。二、培養(yǎng)基基39基本培養(yǎng)基基：MS培養(yǎng)基應(yīng)用用最為廣泛泛。對于某某些植物及及生根階段段，以1/4或1/2MS較好。蔗糖糖和葡萄糖糖濃度為2-4%。生根時稍稍低。植物生長調(diào)調(diào)節(jié)劑：主要以細(xì)細(xì)胞分裂素素和生長素素的配合使使用，調(diào)節(jié)節(jié)外植體的的生長和分分化。另外外ABA、GA、CCC等也具有不不同的作用用。培養(yǎng)基的物物理特性：以固體培培養(yǎng)較為普普遍，也有有采用液體體培養(yǎng)，如如蘭花原球球莖的增殖殖。三、培養(yǎng)條條件40溫度：與植物的原產(chǎn)地相應(yīng)。一般為25±2℃。有時可進(jìn)行高溫或低溫的預(yù)處理。濕度：要求環(huán)境相對濕度不能太低，一般在70-80%。氣體：要求培養(yǎng)基及培養(yǎng)瓶通氣良好，同時及時轉(zhuǎn)接。液體培養(yǎng)要求振蕩培養(yǎng)，促進(jìn)氧氣交換。四、繼代培培養(yǎng)主要指對階階段Ⅱ增殖形成的的芽叢、胚胚狀體或原原球莖等進(jìn)進(jìn)行轉(zhuǎn)接繼繼代。繼代代間隔時間間一般為20天左右。41五、移栽根系結(jié)構(gòu)不不完善的試試管苗移栽栽后不易存存活。要求求根系結(jié)構(gòu)完完整，具根根毛，再生生根的吸收收能力強(qiáng)。葉表皮組織織不發(fā)達(dá)的的試管苗也也不易移栽栽存活。移移栽要求打打開瓶口馴馴化2-3天；或在瓶瓶內(nèi)添加一一些生長延延緩劑如PP333、CCC等培育壯苗苗。42IV植物快繁的的商業(yè)化應(yīng)應(yīng)用植物快繁最最重要的用用途是進(jìn)行行植物的商商業(yè)化生產(chǎn)產(chǎn)。世界上快繁繁商業(yè)化開開始于上個個世紀(jì)美國國的蘭花工業(yè)。我國的香香蕉快繁苗苗占全國組組培苗的2/3。其次有甘甘蔗、蘭花花、馬鈴薯薯、甘薯等等。43園藝植物種苗工廠化生產(chǎn)44一、商業(yè)化生生產(chǎn)規(guī)模及工工藝流程1.試管苗生產(chǎn)規(guī)規(guī)模的確定商業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模的確定應(yīng)應(yīng)以市場需求為標(biāo)準(zhǔn)。試管苗生產(chǎn)規(guī)模的確定是是以無菌工作臺和和培養(yǎng)架的數(shù)量來衡量量的。年產(chǎn)100萬株，接種室室40~50m2，超凈工作臺臺8~10臺，培養(yǎng)室100-120m2。452.商業(yè)化實(shí)驗室室的設(shè)計根據(jù)已確定的的生產(chǎn)規(guī)模和組織培養(yǎng)的的生產(chǎn)程序，試管苗生產(chǎn)產(chǎn)的實(shí)驗室應(yīng)應(yīng)盡量布局合合理，使生產(chǎn)產(chǎn)程序能連續(xù)續(xù)、有效地進(jìn)進(jìn)行。46（1）環(huán)境要求遠(yuǎn)遠(yuǎn)離污染源（（2）水電、交通通（3）工藝流程（（4）節(jié)能（5）無菌3.商業(yè)化生產(chǎn)的的配套設(shè)施相應(yīng)配套設(shè)施施包括過渡培養(yǎng)室和和露地?zé)捗鐖鰣觥?74.商業(yè)化生產(chǎn)的的工藝流程試管苗商業(yè)化化生產(chǎn)的工藝藝流程是以其其快繁程序為為基礎(chǔ)建立起起來的，如最最成熟的草莓莓脫毒苗生產(chǎn)產(chǎn)流程和葡萄萄試管快繁流流程。通過莖莖尖脫毒建立立起來的草莓莓商業(yè)化試管管苗生產(chǎn)，除除必須配備的的培養(yǎng)和馴化化等條件外，，還應(yīng)增加病毒鑒定室。48二、商業(yè)化生生產(chǎn)及效益分分析1.試管苗增殖率率的估算試管苗的增殖殖率多數(shù)以芽芽或苗為單位位，但原球莖莖或胚狀體多多以瓶為單位位。（1）增殖率的理理論值是指接種一個個芽或一塊增增殖培養(yǎng)物，，經(jīng)過一段時時間培養(yǎng)后得得到的芽或苗苗數(shù)。49Y=mXn（Y—年繁殖數(shù)，m—無菌母株苗數(shù)數(shù)，X—每個培養(yǎng)周期期增殖的倍數(shù)數(shù)，n—全年可增殖的的周期數(shù)）（2）增殖率的實(shí)實(shí)際值是指接種一個個芽或一個苗苗，經(jīng)過實(shí)際際繁殖周期，，得到的實(shí)際際芽或苗數(shù)。。實(shí)際增殖數(shù)與與理論增殖數(shù)數(shù)出現(xiàn)很大差差異的原因是：①污染淘汰；②出售、轉(zhuǎn)讓和和實(shí)驗所用；；③移栽死亡；④培養(yǎng)容器等設(shè)設(shè)備的限制。。2.生產(chǎn)計劃的制制定和實(shí)施（1）生產(chǎn)計劃的的制定商業(yè)化生產(chǎn)計計劃制定的依依據(jù)是市場對對試管苗的種種類、品種及及數(shù)量的需求求及趨勢，實(shí)實(shí)驗室具備的的生產(chǎn)條件和和規(guī)模。首先先應(yīng)提出全年年銷售目標(biāo)，，再根據(jù)實(shí)際際生產(chǎn)中各個個環(huán)節(jié)的消耗耗，制定出相相應(yīng)的全年生生產(chǎn)計劃，一一般生產(chǎn)數(shù)量量應(yīng)比計劃銷銷售的數(shù)量增增加20％～30％。50（2）生產(chǎn)計劃的的實(shí)施生產(chǎn)計劃實(shí)施施的步驟為：：①準(zhǔn)備繁殖材料料。②合格繁殖材料料的快速增殖殖。存瓶增殖總瓶瓶數(shù)＝月計劃生產(chǎn)產(chǎn)苗數(shù)／每個個增殖瓶月可可產(chǎn)苗數(shù)月計劃生產(chǎn)苗苗數(shù)＝每個操作人人員每天可接接苗數(shù)×月工作日×人員數(shù)控制試管苗生生產(chǎn)中的增殖殖總瓶數(shù)，便便于在一個周周期內(nèi)全部更更新一次培養(yǎng)養(yǎng)基，使增殖殖材料處于不不同生長階段段的最佳狀態(tài)態(tài)，提高其質(zhì)質(zhì)量。513.產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)控控52如接種狀況、、污染率、生生長情況、生生根苗數(shù)量、、出瓶苗質(zhì)量量等，并建立立試管苗出瓶瓶標(biāo)準(zhǔn)。4.商業(yè)化生產(chǎn)效效益分析通過成本核算算可以了解：：①生產(chǎn)過程中的的各種消耗；；②管理工作的質(zhì)質(zhì)量；③各項技術(shù)措施施的效果；④產(chǎn)品價格的制制定標(biāo)準(zhǔn)。53試管苗商業(yè)化化的生產(chǎn)成本應(yīng)包包括：①人工費(fèi)用。②生產(chǎn)物資費(fèi)用用。③設(shè)備折舊費(fèi)用用。④水電費(fèi)用。⑤其他費(fèi)用。54三、降低商業(yè)業(yè)化生產(chǎn)成本本的措施針對試管苗生生產(chǎn)所需的費(fèi)費(fèi)用，應(yīng)采取取相應(yīng)措施降降低生產(chǎn)成本本，增強(qiáng)產(chǎn)品品競爭力，提提高試管苗經(jīng)經(jīng)濟(jì)效益。1.提高勞動生產(chǎn)產(chǎn)率2.減少設(shè)備投資資，延長使用用壽命3.降低消耗4.降低污染，提提高繁殖率和和成活率5.簡化培養(yǎng)基55四、離體快繁繁商業(yè)性生產(chǎn)產(chǎn)的范圍及應(yīng)應(yīng)用1．用于稀缺或或急需良種植植物的繁殖2．用于莖尖脫脫毒及無病毒毒苗木試管快快速繁殖3．用于自然界界無法用種子子繁殖或難以以保持后代一一致的三倍體體、單倍體及及基因工程植植株的快速繁繁殖4．瀕臨植物的的拯救5．用于種質(zhì)的的試管保存及及交換56蘭科植物生產(chǎn)產(chǎn)57無菌苗快速繁繁殖58無菌苗馴化596061五、商業(yè)化生生產(chǎn)應(yīng)注意的的問題（一）污染1.污染概念：在組培過程中中培養(yǎng)基和培培養(yǎng)材料滋生生雜菌，導(dǎo)致致培養(yǎng)失敗的的現(xiàn)象。2.污染原因：細(xì)菌、真菌菌為病源菌；；污染途徑有有外植體帶菌菌，培養(yǎng)基及及器皿滅菌不不徹底，操作作人員未遵守守操作規(guī)程，，環(huán)境不清潔潔。（1）真菌污染的的特點(diǎn)：污染部分長有有不同顏色的的霉菌，在接接種后3～10天才能發(fā)現(xiàn)。。（真菌菌落大，，顏色多樣，，表面呈毛絨絨狀，嗅之一一般有霉味，，真菌會產(chǎn)生生菌絲）原因：周圍環(huán)環(huán)境不清潔超凈工作臺的的過濾裝置失失效培養(yǎng)用器皿的的口徑過大等等為了減少損失失，提高工作作效率，必須須在每個操作作環(huán)節(jié)注意防防止污染的發(fā)發(fā)生。3.污染特點(diǎn)（2）細(xì)菌污染的的特點(diǎn)：菌斑呈粘液狀狀物，而且在在接種后1～2天即可發(fā)現(xiàn)。。（細(xì)菌菌落小，，表面呈乳脂脂狀光澤，嗅嗅之一般有酸酸臭味，細(xì)細(xì)菌污染沒有有菌絲）原因：材料帶帶菌培養(yǎng)基滅菌不不徹底操作人員未遵遵守操作規(guī)程程因此接種人員員的手應(yīng)經(jīng)常常用70%灑精擦凈，鑷鑷子和接種針針在使用前必必須在火焰上上燒紅。4.預(yù)防措施（1）防止材料帶帶菌：避免陰陰雨天在室外外采集外植體體；材料預(yù)培培養(yǎng)。（2）嚴(yán)格外植體體滅菌（3）接種用具滅滅菌徹底（4）嚴(yán)守?zé)o菌操操作規(guī)程（5）保持培養(yǎng)室室清潔（6）做好超凈工工作臺檢修、、養(yǎng)護(hù)防止材料帶菌菌的措施（1）用莖尖作外外植體時，可可在室內(nèi)或無無菌條件下對對枝條先進(jìn)行行預(yù)培養(yǎng)。枝條→水水洗凈→插插入無糖的的營養(yǎng)液或自自來水抽枝，，以這種新抽抽的嫩枝條作作為外植體接接種。這樣便便可大大減少少材料的污染染。在無菌條件下下對采自田間間的枝條進(jìn)行行暗培養(yǎng)，待待抽出徒長的的黃化枝條時時采枝，經(jīng)滅滅菌后接種也也可明顯減少少污染。（2）多次滅菌法法：如咖啡成熟葉片的滅滅菌即用這種種方法。首先先除去主脈（因因主脈與支脈脈交界處常有有真菌休眠孢孢子存在），，同時去掉葉葉的頂端、基基部和邊緣部部分，這樣可可大大減少污污染；其次，將切好的外外植體放入1.3%的次氯酸鹽溶溶液中（商品品漂白粉25%的溶液），滅滅菌30min；第三，在無菌蒸餾水水中沖洗3次；第四，將材料封閉在在無菌的培養(yǎng)養(yǎng)皿中過夜，，保持一定溫溫度；第五，次日將葉片用用2.6%次氯酸鈉滅菌菌30min，然后，用蒸蒸餾水洗3次。對層積過的種種子也可用多多次滅菌法，在種子吸脹脹前后都要滅滅菌，在層積積貯藏的第一一周還應(yīng)增加加1次滅菌處理。。（3）多種藥液交交替浸泡法對容易污染而而難滅菌的材材料：1.取莖尖、芽或或器官外植體體，用自來水水及肥皂充分分洗凈，表面面不可附著污污垢、灰塵，，用剪刀修剪剪掉外植體上上無用的部分分，剝?nèi)パ可仙削[片；2.將材料放入70%—75%醫(yī)用灑精中滅滅菌數(shù)秒鐘；；3.1：500RoccalB（一種商品滅滅菌劑名）稀稀釋液中浸5min4.放入5%—10%次氯酸鈉溶液液中并滴入““吐溫80”數(shù)滴，滅菌15—30min，或浸入0.1%—0.2%升汞溶液中并并加入“吐溫溫80”數(shù)滴，滅菌5—10min；5.用無菌水沖洗洗5次。也可以在在從次氯酸鈉鈉溶液中取出出后，再放入入無菌的0.1mol鹽酸（HCl）中浸片刻，，再用無菌水水沖洗數(shù)次。。5.組培苗污染的的處理（1）發(fā)現(xiàn)污染的的材料應(yīng)及時時處理，否則則將導(dǎo)致培養(yǎng)養(yǎng)室環(huán)境污染染。（2）對一些特別別寶貴的材料料，可以取出出再次進(jìn)行更更為嚴(yán)格的滅滅菌，然后接接入新鮮的培培養(yǎng)基中重新新培養(yǎng)。（3）要處理的污污染培養(yǎng)瓶最最好在打開瓶瓶蓋前，先集集中進(jìn)行高壓壓滅菌，再清清除污染物，，然后洗凈備備用后的處理理（二）褐變1.褐變的概念是指外植體在在培養(yǎng)過程，，自身組織從從表面向培養(yǎng)養(yǎng)基釋放出褐褐色物質(zhì)，以以致培養(yǎng)基逐逐漸變成褐色色，外植體也也隨之進(jìn)一步步變褐而死亡亡的現(xiàn)象。2.褐變原因

木質(zhì)素→→→→醌→積累造成毒害。多酚氧化酶[O]3.影響褐變的因因素（1）植物品種（（基因型）木>草（2）生理狀態(tài)材料年齡：幼幼齡期＜成年年型材料大?。盒⌒〔牧希即蟛牧辖M織：細(xì)嫩組組織＜老熟組組織（3）培養(yǎng)基成分無機(jī)鹽濃度過過高、CTK水平過高外植體在最適適宜的脫分化化條件下，細(xì)細(xì)胞大量增增殖，抑制褐褐變。液體培養(yǎng)不容容易褐變。PH高容易褐變。。（4）培養(yǎng)條件光照過強(qiáng)，溫溫度過高，培培養(yǎng)時間過長長，加速褐變變。（5）材料轉(zhuǎn)移時時間長>短4.褐變的防止措措施（1）選擇適宜的的外植體（2）選擇合適的的培養(yǎng)條件（3）外植體預(yù)處處理（還原劑劑浸泡）（4）加快繼代轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)接的速度（5）加抗氧化劑劑（VC、PVP、牛血清、牛牛蛋白）（6）0.1－0.5%活性炭（三）玻璃化化1.概念玻璃化是試管苗的一一種生理失調(diào)調(diào)癥，在植物物材料進(jìn)行離離體培養(yǎng)時，，有些培養(yǎng)物物的嫩莖或葉葉片呈現(xiàn)半透透明或水漬狀狀的現(xiàn)象。形態(tài)：植株矮矮小，節(jié)間短短，葉水漬狀狀、半透明、、脆易碎。2.原因：（1）激素濃度（（尤其CTK）增加或或CTK╱╱IAA高（2）瓊脂濃濃度低（3）光照時時間大于于15h（4）溫度低低，濕度度大（5）通風(fēng)條條件不好好（6）培養(yǎng)基基離子種種類及比比例不適適宜3.預(yù)防措施施：（1）適當(dāng)控控制培養(yǎng)養(yǎng)基中無無機(jī)鹽成成分，適適當(dāng)提高高蔗糖和和瓊脂濃濃度，減減少含氮氮化合物物的用量量，降低低培養(yǎng)基基的水勢勢。（2）適當(dāng)降降低CTK和GA的濃度。?？紤]加加入適當(dāng)當(dāng)?shù)拿撀渎渌帷＃?）增加自自然光照照，控制制光照時時間；增增加容器器通氣，，控制溫溫度。（4）加入其其他物質(zhì)質(zhì)（如活活性炭、、多效唑唑、間苯苯三本分分、根皮皮苷）。。（四）組組培其它它常見問問題1.材料死亡亡2.黃化3.變異和畸畸形4.增殖率低低下或過過盛5.組培苗瘦瘦弱或徒徒長6.不生根或或生根率率低7.過渡苗死死亡率高高1.材料死亡亡原因與與預(yù)防外植體滅菌過度滅菌濃度和時間適宜污染注意環(huán)境和個人衛(wèi)生，嚴(yán)格操作培養(yǎng)基不適宜或配制有問題選用合適培養(yǎng)基培養(yǎng)環(huán)境惡化改善培養(yǎng)環(huán)境，及時轉(zhuǎn)移和分瓶；加強(qiáng)組培苗的過渡管理2.黃化（1）原因：培養(yǎng)基中中Fe含量不足足；礦物營養(yǎng)養(yǎng)不均衡衡；培養(yǎng)環(huán)境境通氣不不良，瓶瓶內(nèi)乙烯烯量高；；激素配比比不當(dāng)；；光照不足足；糖用量不不足，長長期不轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移；培養(yǎng)溫度度不適（2）預(yù)防：：針對黃化化原因?qū)ΠY下藥藥3.變異和畸畸形（1）原因：：激素濃度度和選用用的種類類不當(dāng)；；環(huán)境惡化化和不適適。（2）預(yù)防：：降低CTK濃度，調(diào)調(diào)整生長長素與CTK的比例；；改善環(huán)境境條件。。4.增殖率低低下或過過盛（1）原因：：與品種特特性有關(guān)關(guān)；與激素濃濃度和配配比有關(guān)關(guān)。（2）預(yù)防：：確定一定定范圍的的激素比比試驗，，根據(jù)長長勢確定定配方，，并及時時調(diào)整；；交替使用用兩種培培養(yǎng)基；；考慮品種種的田間間表現(xiàn)和和特性，，調(diào)整培培養(yǎng)環(huán)境境。5.組培苗瘦瘦弱或徒徒長原因CTK過高，過過多不定定芽未及時轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移和和分切溫度過高高通氣不良良光照不足足培養(yǎng)基水水分過多多預(yù)防措施施減少CTK用量加速轉(zhuǎn)瓶瓶，降低低接種量量降低環(huán)境境溫度用透氣膜膜做封口口提高光強(qiáng)強(qiáng)，延長長光照時時間適當(dāng)增加加培養(yǎng)基基硬度6.不生根或或生根率率低原因：種類和品品種間的的差異激素種類類和濃度度環(huán)境條件件繁殖苗基基質(zhì)受損損預(yù)防：對難生根根品種，，從激素素種類和和水平、、環(huán)境條條件綜合合調(diào)控掌握種類類操作要要領(lǐng)和質(zhì)質(zhì)量要求求切割苗基基部時，，刀要快快，用力力均勻，，平整無無損傷生根苗基基部盡量量不帶愈愈傷組織織常用的策策略：a、降低培培養(yǎng)基鹽鹽濃度；；b、適當(dāng)增增大IAA用量，不不用或少少用CTK；c、減少糖糖供應(yīng)、、增加光光照以增增強(qiáng)植株株的自養(yǎng)養(yǎng)能力；；d、對難生生根材料料采取微體嫁接接、化學(xué)刺激激等方法處處理；7.過渡苗死死亡率高高原因：組培苗質(zhì)質(zhì)量差環(huán)境條件件不適管理不精精細(xì)預(yù)防：培育高質(zhì)質(zhì)量組培培苗及時出瓶瓶，盡快快移栽改善環(huán)境境條件采取配套套的管理理措施，，加強(qiáng)過過渡苗的的肥水水管理和和病蟲害害防治（五）遺遺傳穩(wěn)定定性1.影響遺傳傳穩(wěn)定性性的因素素①基因型。。培養(yǎng)材料料的基因因型不同同，發(fā)生生變異的的頻率也也不相同同。②繼代次數(shù)數(shù)。試管苗繼繼代培養(yǎng)養(yǎng)次數(shù)和和時間是是造成遺遺傳變異異的關(guān)鍵鍵因素，，一般隨隨繼代次次數(shù)和時時間的增增加，變變異頻率率呈上升升趨勢。。③器官發(fā)生生方式。。離體器官官5種發(fā)生方方式中，，以莖段段、莖尖尖等形成成的叢生生芽、單單芽、不不定芽的的方式繁繁殖，不不易發(fā)生生變異或或變異率率極低。。852.降低遺傳傳變異的的措施①選用不易易發(fā)生遺遺傳變異異的基因因型材料料；②縮短繼代代時間，，限制繼繼代次數(shù)數(shù)，繼代代一定時時間后，，重新開開始外植植體的繼繼代培養(yǎng)養(yǎng)；③采用不易易發(fā)生遺遺傳變異異的增殖殖途徑；；④采用適當(dāng)當(dāng)?shù)纳L長調(diào)節(jié)物物質(zhì)和較較低的濃濃度，減減少或不不使用易易引起誘誘變的物物質(zhì)，及及時剔除除生理和和形態(tài)異異常苗。。869、靜夜四四無鄰，，荒居舊舊業(yè)貧。。。1月-231月-23Sunday,January1,202310、雨中黃葉葉樹，燈下下白頭人。。。13:14:5513:14:5513:141/1/20231:14:55PM11、以我我獨(dú)沈沈久，，愧君君相見見頻。。。1月-2313:14:5513:14Jan-2301-Jan-2312、故故人人江江海海別別，，幾幾度度隔隔山山川川。。。。13:14:5513:14:5513:14Sunday,January1,202313、乍見見翻疑疑夢，，相悲悲各問問年。。。1月-231月-2313:14:5513:14:55January1,202314、他他鄉(xiāng)鄉(xiāng)生生白白發(fā)發(fā)，，舊舊國國見見青青山山。。。。01一一月月20231:14:55下下午午13:14:551月月-2315、比不不了得得就不不比，，得不不到的的就不不要。。。。。一月231:14下下午午1月-2313:14January1,202316、行動出出成果，，工作出出財富。。。2023/1/113:14:5513:14:5501January202317、做前，能夠夠環(huán)視四周；；做時，你只只能或者最好好沿著以腳為為起點(diǎn)的射線線向前。。1:14:55下午1:14下下午13:14:551月-239、沒沒有有失失敗敗，，只只有有暫暫時時停停止止成成功功?。?。。1月月-231月月-23Sunday,January1,202310、很多事情情努力了未未必有結(jié)果果，但是不不努力卻什什么改變也也沒有。。。13:14:5513:14:5513:141/1/20231:14:55PM