基因工程與基因組學(xué)

2023/1/231第九章基因工程和基因組學(xué)

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§1．基因工程(Geneengineering)一、基因工程概述

1、基因工程的概念20世紀(jì)70年代隨著DNA重組技術(shù)的發(fā)展在遺傳學(xué)上產(chǎn)生了一門新的分支遺傳工程（Geneticsengineering）遺傳工程:又稱遺傳操作（Geneticmanipulation）,是以分子遺傳學(xué)為基礎(chǔ)，以現(xiàn)代物理、化學(xué)等為手段，按照人們設(shè)計(jì)的生物藍(lán)圖在細(xì)胞、染色體和基因等不同水平上，對生物的遺傳性狀進(jìn)行定向改造，創(chuàng)造新的生物類型。廣義的遺傳工程：包括細(xì)胞工程、染色體工程、細(xì)胞器工程、基因工程。狹義的遺傳工程：即基因工程2023/1/233

2.基因工程的發(fā)展：

基因工程的產(chǎn)生和發(fā)展在遺傳學(xué)的發(fā)展史上是一次大革命，它打破了種、屬的界線，可以在生物大系統(tǒng)內(nèi)交流基因。其發(fā)展情況如下：1971年，史密斯（SmithH.O.）等人從細(xì)菌中分離出的一種限制性酶

酶切病毒DNA分子，標(biāo)志著DNA重組時(shí)代的開始。

1972年伯格（BergP.）等用限制性酶分別酶切猿猴病毒和噬菌體DNA，將兩種DNA分子用連接酶連接起來得到新的DNA分子。

1982年，美國食品衛(wèi)生和醫(yī)藥管理局批準(zhǔn)，用基因工程在細(xì)菌中生產(chǎn)人的胰島素投放市場。自從1983年第一株轉(zhuǎn)基因煙草獲得以來，至今已有120種植物轉(zhuǎn)基因獲得成功。1996年全球大面積種植，并不斷擴(kuò)大。1996年，克隆羊誕生。2004年3月英國批準(zhǔn)大面積種植轉(zhuǎn)基因，但要求非常嚴(yán)格。2005年德國通過法案，嚴(yán)格限制（包括實(shí)驗(yàn)室研究）。

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目前世界轉(zhuǎn)基因作物主要為大豆、玉米、棉花和油菜等，以轉(zhuǎn)基因大豆面積最大。

我國是世界上第一個(gè)商品化種植轉(zhuǎn)基因作物的國家。到1999年我國已批準(zhǔn)中試的轉(zhuǎn)基因作物有48項(xiàng)：包括水稻、小麥、玉米、番茄、白菜、番木瓜、甜瓜、花生、棉花、煙草、廣藿香等11種作物；主要目標(biāo)性狀是抗蟲、抗病、耐鹽、抗凍、耐儲藏和抗衰老等。已批準(zhǔn)環(huán)境釋放的有49個(gè)品種，涉及水稻、玉米、大豆、馬鈴薯、番茄、甜椒、線辣椒、棉花、楊樹、煙草等10種作物。

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3．基因工程研究內(nèi)容：

①．從細(xì)胞和組織中分離和純化DNA；②．利用能識別特異性DNA序列的限制性內(nèi)切酶剪切DNA分子，制備含有目的基因的DNA片段，或采用酶學(xué)和化學(xué)合成的方法人工合成基因；

③．將DNA片段或人工合成的基因與能夠自我復(fù)制并具有選擇標(biāo)記的載體在體外連接，形成重組DNA分子；

④．將重組的DNA分子引入受體（宿主）細(xì)胞中，使重組DNA分子在受體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，產(chǎn)生多個(gè)拷貝，即克隆；

⑤．重組DNA能隨宿主細(xì)胞的分裂而分配到子細(xì)胞中，使子代群體細(xì)胞均具有重組的DNA分子的拷貝；

⑥．從繁殖的大量細(xì)胞群體中篩選和鑒定含有目標(biāo)基因的重組DNA，受體細(xì)胞的克隆；⑦.能從選出的宿主細(xì)胞中回收、純化和分析克隆的重組的DNA分子；⑧.克隆的基因能夠正常表達(dá)。2023/1/236二、限制性內(nèi)切核酸酶限制性內(nèi)切核酸酶，是一種核酸水解酶，主要從細(xì)菌中分離得到，這些酶能識別特定的核苷酸序列，所以稱之為限制性內(nèi)切酶。是基因工程的常用工具酶。⑴．限制性內(nèi)切酶的命名：

根據(jù)其來自的生物名稱，用英文字母和數(shù)字表示；

①.EcoRI來自大腸桿菌（Escherichiacoli）；

②.HindⅢ來自嗜血桿菌（Haemophilusinfluenzae）。2023/1/237⑵．限制性內(nèi)切酶的類別：

根據(jù)限制性內(nèi)切酶的作用特點(diǎn)，可分為兩類：第Ⅰ類酶、第Ⅱ類酶第Ⅰ類酶

：如EcoB(大腸桿菌B株)、EcoK(大腸桿菌K株)分子量較大(約300，000)，由于這類酶的切割部位無特異性，是隨機(jī)的，每隔一段DNA序列隨機(jī)切割雙鏈DNA分子，切割點(diǎn)不固定，所以在基因工程中很少應(yīng)用。

第Ⅱ類酶（）：

如EcoRI(大腸桿菌)、HindⅢ(嗜血桿菌)，分子量較小(約20，000-100，000)，這類酶的切割部位有特異性，可準(zhǔn)確切割DNA雙鏈的特異序列，因此在基因工程中廣泛應(yīng)用。

2023/1/238這類酶的切割點(diǎn)是對稱序列。如回文對稱序列（又稱反向重復(fù)序列，即從兩個(gè)方向閱讀，其序列相同的序列）。識別特定的堿基序列，交錯(cuò)切割產(chǎn)生二個(gè)粘性末端。二個(gè)平齊末端。

EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’PstI5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’

產(chǎn)生粘性末端EcoRV5’-GATATC-3’3’-CTATAG-5’

產(chǎn)生平齊末端2023/1/239三、載體

載體是將“目的”基因即重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞的運(yùn)載工具。

DNA載體：質(zhì)粒、噬菌體、病毒、細(xì)菌或酵母菌人工染色體等，現(xiàn)在使用的載體都是采用基因工程的方法構(gòu)建的。載體的條件：

①.具有復(fù)制原點(diǎn)，能自我復(fù)制，并能帶動攜帶的外源DNA一起復(fù)制。

②.具多克隆位點(diǎn)，即有多種限制酶的切點(diǎn)；且切點(diǎn)不存在于復(fù)制原點(diǎn)或抗性選擇標(biāo)記內(nèi)，即切點(diǎn)不影響復(fù)制和標(biāo)記性狀的表現(xiàn)。

③.至少有一個(gè)選擇標(biāo)記基因，便于鑒定進(jìn)入宿主細(xì)胞與否，如抗生素基因或某種酶的基因，而宿主細(xì)胞沒有這些基因。

④.易從宿主細(xì)胞中回收克隆。

2023/1/2310一些常用的載體：

㈠、細(xì)菌質(zhì)粒

：質(zhì)粒是細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立于細(xì)菌染色體而自然存在的、能自我復(fù)制、易分離和導(dǎo)入的環(huán)狀雙鏈DNA分子，是質(zhì)粒具有重組表型檢測標(biāo)記，可檢測是否攜帶外源DNA片段?？捎糜诳寺》肿恿啃∮?0kb(1kb=1000bp)的外源DNA片段。經(jīng)典的大腸桿菌質(zhì)粒載體1.pSC101第一個(gè)成功地用于克隆實(shí)驗(yàn)的大腸桿菌質(zhì)粒載體。（1）類型天然質(zhì)粒，屬低拷貝型。（2）長度9.09kb（3）選擇標(biāo)記四環(huán)素抗性Tetr6個(gè)克隆位點(diǎn)：EcoRI、XhoI、PvuI、HindIII、BamHI、SalI主要使用EcoRI。（其中HindIII、BamHI、SalI3個(gè)位于選擇標(biāo)記Tetr的內(nèi)部）（4）克隆位點(diǎn)當(dāng)帶有抗菌素抗性基因的載體進(jìn)入受體菌后，受體菌才能生長。含有抗菌素的培養(yǎng)基（選擇培養(yǎng)基）中能夠生長抗菌素抗性基因的受體菌抗菌素選擇原理活死抗性基因抗菌素2023/1/2315另：pUC18質(zhì)粒具有以下特點(diǎn)：

①.分子量小，可接受較大外源片段；

②.拷貝數(shù)多，500個(gè)／細(xì)胞；

③.克隆位點(diǎn)的酶切位點(diǎn)多，克隆方便；

④.具有用于檢測重組質(zhì)粒的選擇標(biāo)記（如α–互補(bǔ)的顯色表型）。

③lacZ的肽互補(bǔ)1）-肽（lacZ’

）：-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片斷（11-41氨基酸）。lacZ只有在4聚體的狀態(tài)下才有功能此酶由500kd的四聚體構(gòu)成

C端大部分N端的11-41aaC端大部分N端的11-41aaC端大部分N端的11-41aaC端大部分N端的11-41aa4聚體2）受體菌lacZ突變（lacZ?M15）受體菌基因組的-半乳糖苷酶基因的氨基端有缺失（缺失肽），不能形成4聚體的活性酶，不能分解X-gal受體菌株：JM系列、TG1、TG2、XL1-blue、XS127、XS101、KK2186、MV1184、DH5apUC質(zhì)粒載體上的lacZ’

編碼肽與這個(gè)缺失突變的-半乳糖苷酶“互補(bǔ)”，使它能形成4聚體，從而能分解X-gal，產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)。C端大部分N端的11-41aapUClacZ’受體菌lacZ?3）載體lacZ’與互補(bǔ)4）互補(bǔ)的插入失活pUC載體上LacZ’的5‘端有一段多克隆位點(diǎn)(MCS)區(qū)，本身雖不干擾LacZ’的合成，但插入外源基因就會阻止LacZ’的合成。不能互補(bǔ)。

lacZ’5’3’肽移碼突變lacZ’5’3’肽不互補(bǔ)互補(bǔ)MCS外源DNA④IPTG的誘導(dǎo)作用IPTG是乳糖的類似物。能誘導(dǎo)lac操縱子的啟動轉(zhuǎn)錄，使受體菌基因組中的lacZ的C端部分和載體的lacZ’肽都表達(dá)。從而互補(bǔ)。但載體MCS上插入外源DNA后，仍然不能產(chǎn)生肽！IPTG通過看培養(yǎng)皿上的菌斑的顏色就能直接知道是否有DNA插入。MCS無插入時(shí)，互補(bǔ)，藍(lán)菌斑。MCS有插入時(shí)，不互補(bǔ)，白菌斑。IPTG誘導(dǎo)的結(jié)果：2023/1/2323㈤、細(xì)菌人工染色體(bacterialartificialchromosome，BAC)：

BAC載體一般可攜帶大于50kb的外源DNA片段。F因子改造成BAC載體，甚至可用于克隆100kb以上的DNA片段。㈥、酵母人工染色體(yeastartificialchromosome，YAC)：

YAC具有自主復(fù)制序列、克隆位點(diǎn)和可在細(xì)菌和酵母菌中選擇的標(biāo)記基因；還具有酵母菌染色體一些特點(diǎn)；

2023/1/2324四、基因的分離與鑒定一般而言，一個(gè)基因是編碼一條多肽鏈的一個(gè)DNA片段包括啟動子、終止子及內(nèi)含子等。在DNA重組技術(shù)出現(xiàn)之前，由于DNA分子量大而結(jié)構(gòu)單一，DNA是細(xì)胞中最難分析的大分子。DNA重組技術(shù)發(fā)展成功之后，DNA已成為細(xì)胞中最易操作分析的大分子。DNA的體外重組：1.體外通過限制性內(nèi)切酶的修剪和DNA連接酶的連接；2.目標(biāo)DNA分子+載體DNA，共價(jià)連接；3.獲得重組DNA分子。2023/1/2325㈠、從基因庫中分離基因：

1.基因庫（genelibrary）：

是一組DNA和cDNA序列克隆的集合體。從基因庫中分離基因，首先要構(gòu)建基因庫。

根據(jù)克隆核酸序列、來源，基因庫可分為：核基因庫、染色體庫、cDNA庫、線粒體庫等2023/1/2326①.核基因庫：

核基因庫(genomiclibrary)：將某生物全部基因組DNA酶切后與載體連接構(gòu)建而成。

構(gòu)建文庫可采用不同的載體：

質(zhì)粒載體：重組質(zhì)粒導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞收集菌落。

噬菌體或柯斯質(zhì)粒(cosmid)載體：將重組DNA包裝進(jìn)噬菌體感染細(xì)菌收集噬菌斑。

BAC(細(xì)菌人工染色體)或YAC(酵母人工染色體)載體：重組人工染色體導(dǎo)入宿主細(xì)胞收集細(xì)胞。

②.染色體基因庫：

將染色體用來構(gòu)建基因庫,可選擇特異基因和分析染色體結(jié)構(gòu)和組織。如果蠅的多線染色體：對染色體進(jìn)行微切割，可以構(gòu)建染色體區(qū)段的基因文庫。③.cDNA庫：

以mRNA為模板反轉(zhuǎn)錄酶合成互補(bǔ)DNA構(gòu)建基因庫。cDNA庫與核DNA庫不同：cDNA庫僅具有細(xì)胞或組織內(nèi)表達(dá)基因的mRNA序列僅包括基因組的部分基因序列。

2023/1/23272.篩選基因庫：

根據(jù)待選基因相關(guān)信息確定篩選方法和條件從基因庫中篩選、分離基因。多數(shù)方法是利用一段核苷酸序列(DNA、cDNA或寡聚核苷酸)或抗體作探針(Probe)，用放射性同位素或非放射性同位素標(biāo)記探針篩選基因庫。

篩庫過程：

將噬菌體感染形成的噬菌斑印影在硝酸纖維膜上變性帶有目的基因的放射性DNA或cDNA作探針進(jìn)行雜交放射性自顯影雜交信號（黑點(diǎn)）對應(yīng)的噬菌斑即為陽性克隆。2023/1/23283.陽性克隆的分析與鑒定：

從基因庫中篩選出陽性克隆，分析、鑒定，得到目的基因。

⑴.限制性酶圖譜：

根據(jù)同源性分析，了解陽性克隆片段的酶切位點(diǎn)及相對位置用于進(jìn)一步亞克隆或同已知的其它序列比較。右圖為一個(gè)15kbDNA片段的限制性酶圖譜構(gòu)建方法。

2023/1/2329⑵.核酸分子雜交：

①.Southern雜交分析：

將瓊脂糖中的DNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜進(jìn)行DNA分子雜交分析的方法。②.Northern雜交分析：與Sorthern雜交的原理和程序相同。

用于分析克隆的基因在某一細(xì)胞或組織的轉(zhuǎn)錄水平，檢測mRNA的存在。③.Western雜交分析：用于蛋白質(zhì)的分析。

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㈡、PCR擴(kuò)增基因：

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction，PCR)可以體外快速擴(kuò)增DNA。

美國Mullis(1986)發(fā)明(現(xiàn)代生物學(xué)發(fā)展史上的里程碑)。

PCR反應(yīng)三個(gè)步聚(一個(gè)循環(huán))：

1.變性：94－95℃使模板DNA雙鏈變成單鏈；

2.復(fù)性：50－70℃下，引物分別與互補(bǔ)DNA單鏈互補(bǔ)配對；

3.延伸：在引物的引導(dǎo)和Taq酶作用下，72℃下合成模板DNA的互補(bǔ)鏈。

PCR反應(yīng)通常有25－35個(gè)循環(huán)，一般可擴(kuò)增5kb左右的片段。㈢、（三）、人工合成基因：根據(jù)已知的基因或氨基酸序列，將化學(xué)合成寡核苷酸的方法與酶促合成DNA的方法結(jié)合起來，可很快地人工合成基因

2023/1/2331五、基因工程的應(yīng)用：目前，基因工程研究發(fā)展迅速，已取得一系列重大突破。基因工程技術(shù)已廣泛用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)、醫(yī)學(xué)、法學(xué)等領(lǐng)域，為人類創(chuàng)造了巨大的財(cái)富。2023/1/2332㈠、基因工程工業(yè)：

最早應(yīng)用基因工程生產(chǎn)人的蛋白質(zhì)的方法是在細(xì)菌中表達(dá)人的胰島素(1982)。

基因工程生產(chǎn)人的胰島素的方法如左下圖所示。

現(xiàn)已在細(xì)菌中生產(chǎn)10多種藥品，例如表皮生長因子、人生長激素因子、干擾素、乙型肝炎工程疫苗等。

目前，酵母菌、植物懸浮細(xì)胞、植株和動物培養(yǎng)細(xì)胞均成功地應(yīng)用于表達(dá)外源蛋白。

2023/1/2333㈡、植物基因工程：

植物基因轉(zhuǎn)化是指將外源基因轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞內(nèi)、并整合到植物基因組中穩(wěn)定遺傳和表達(dá)的過程。

許多植物基因已經(jīng)被分離、克隆。

農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法和基因槍轉(zhuǎn)化法應(yīng)用最多。

2023/1/2334根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化技術(shù)：

根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化技術(shù)應(yīng)用最早（雙子葉植物單子葉植物）。

過程：將目的基因與啟動子（花椰菜病毒35S）及終止子組成嵌合DNA分子插入到Ti衍生質(zhì)粒RB與LB內(nèi)構(gòu)成重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌細(xì)胞，利用重組農(nóng)桿菌去感染植物細(xì)胞使質(zhì)粒部分DNA包括目的基因，整合到植物染色體，實(shí)現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化。

利用抗草甘磷(glyphosate)E.coli中分離克隆的EPSP合成酶基因，已培育出高抗除草劑轉(zhuǎn)基因植物。

2023/1/2335第二節(jié)．基因組學(xué)(Genomics)

基因組學(xué)(geno