HCBP6在原發(fā)性膽汁性膽管炎患者中的表達(dá)及意義

HCBP6在原發(fā)性膽汁性膽管炎患者中的表達(dá)及意義高麗麗;張亦瑾;高學(xué)松;李洪杰;劉楠;高萍;徐琍;段雪飛期刊名稱】《《新醫(yī)學(xué)》》年(卷),期】2019(050)012【總頁數(shù)】5頁（P906-910）【關(guān)鍵詞】HCBP6;原發(fā)性膽汁性膽管炎;病理分期【作者】高麗麗;張亦瑾;高學(xué)松;李洪杰;劉楠;高萍;徐琍;段雪飛【作者單位】100015北京首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院綜合科【正文語種】中文原發(fā)性膽汁性膽管炎（PBC）又稱原發(fā)性膽汁性肝硬化，是一種由自身免疫介導(dǎo)的慢性肝病，中老年女性為好發(fā)人群。臨床上以慢性膽汁淤積、血清抗線粒體抗體（AMA）陽性、IgM升高、肝臟生化指標(biāo)異常為特征，病理上主要表現(xiàn)為肝內(nèi)小膽管進(jìn)行性非化膿性破壞性炎癥，可慢性進(jìn)展至肝纖維化，最終導(dǎo)致肝硬化［1］關(guān)于PBC的發(fā)病機(jī)制，目前沒有定論，除遺傳、環(huán)境等因素以外，多種免疫細(xì)胞細(xì)胞因子、基因均參與了疾病的發(fā)生。丙型肝炎病毒核心蛋白結(jié)合蛋白6（HCBP6）又名FUNDC2、HCC3、DC44PD03104，是由我們課題組通過酵母雙雜交技術(shù)篩選并命名的一個(gè)基因。其可以與丙型肝炎病毒核心蛋白結(jié)合，生物學(xué)功能尚不十分明確［2］。課題組初步的研究表明，HCBP6在甘油三酯代謝過程中發(fā)揮重要作用［3］。近期有研究認(rèn)為代謝綜合征在PBC的發(fā)病及疾病進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，提示與甘油三酯代謝密切相關(guān)的HCBP6可能在PBC的發(fā)病及疾病進(jìn)展中發(fā)揮重要作用［4］。本研究主要檢測PBC患者與正常對照者之間血清和肝組織中HCBP6的表達(dá)差異，分析HCBP6與臨床相關(guān)指標(biāo)、肝組織的病理分期之間的關(guān)系，進(jìn)而闡述HCBP6在PBC發(fā)生發(fā)展中可能的作用。對象與方法一、 研究對象選取2015年1月至2019年1月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院確診的PBC患者60例。PBC的診斷主要依據(jù)2018年美國肝病研究學(xué)會(huì)（AASLD）更新的PBC診斷和治療指南，需符合3項(xiàng)診斷標(biāo)準(zhǔn)中的2項(xiàng)：AMA陽性；提示膽汁淤積的生化學(xué)表現(xiàn)；組織學(xué)表現(xiàn)為非化膿性破壞性膽管炎和小葉間膽管損傷［5］。排除合并其他自身免疫性肝病、系統(tǒng)自身免疫性疾病、各種急慢性病毒性肝炎、半年內(nèi)使用可疑肝損傷藥物、長期大量飲酒及臨床資料不完整者。60例PBC患者外周血標(biāo)本作為PBC血清組，另選取10名同期健康體檢者外周血標(biāo)本作為正常對照組1。選取2015年1月至2019年1月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院PBC患者肝穿刺標(biāo)本40例（PBC肝組織組），PBC患者入組標(biāo)準(zhǔn)及排除標(biāo)準(zhǔn)同上。病理分期主要依據(jù)Scheuer評(píng)分系統(tǒng)：小膽管炎期為I期，細(xì)小膽管增生期為口期，瘢痕期為皿期，肝硬化期為IV期［6］。各病理分期PBC患者各10例，另選同期10名肝移植供肝組織的肝穿刺標(biāo)本為正常對照組2。研究方案獲首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。二、 方法主要試劑用于ELISA的試劑盒購自武漢艾伯維公司，兔抗人HCBP6抗體購自臺(tái)灣Anova公司，DakoREALEnVision免疫組化檢測試劑盒購自美國Dako公司。ELISA法測定血清HCBP6水平PBC血清組、正常對照組1的外周靜脈血5ml,2h內(nèi)1000xg離心10min,取上層血清，并保存于-80°C,依據(jù)ELISA試劑盒的方法檢測血清HCBP6的表達(dá)水平，具體步驟參照試劑盒說明書。3?肝組織HCBP6免疫組織化學(xué)（組化）染色PBC肝組織組、正常對照組2的肝組織標(biāo)本用4%甲醛溶液固定，石蠟包埋，以4pm厚連續(xù)切片，以二甲苯、乙醇梯度脫蠟。磷酸鹽緩沖液洗滌3次，由3%H2O2作用15min以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性。再由檸檬酸鹽緩沖液熱修復(fù)15min，自然緩慢冷卻至室溫。由羊血清在室溫下封閉30min后滴加兔抗人HCBP6抗體（濃度為1:100）,4C過夜。次日再滴加二抗，經(jīng)二氨基聯(lián)苯胺顯色后蘇木精復(fù)染，然后中性樹膠封片。最后在顯微鏡下（x400）隨機(jī)選取5個(gè)門管區(qū)，主要計(jì)數(shù)每個(gè)門管區(qū)的陽性細(xì)胞數(shù)量，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。免疫組化評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。表1肝組織標(biāo)本免疫組化評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)注：總分為陽性細(xì)胞比例的得分加上其免疫組化染色強(qiáng)度的得分，即得到其總分為0、2、3、4、5或6；0為（-），2為（+）,3~4為（++）,5~6為（+++）項(xiàng)目0123陽性細(xì)胞比例（%）0%v30%30%~70%>70%染色強(qiáng)度陰性弱中強(qiáng)三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS17.0。計(jì)量資料以表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用百分比表示，組間比較采用Fisher確切概率法。等級(jí)資料間的相關(guān)性采用Spearman秩相關(guān)分析。Pv0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果一、一般資料比較PBC血清組共60例，其中男6例、女54例，年齡(46.8±8.8)歲；正常對照組1共10例，男2例、女8例，年齡(50.2±9.6)歲。PBC血清組與正常對照組1的性別構(gòu)成、年齡比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均〉0.05)。PBC肝組織組40例，其中男5例、女35例，年齡(43.0±10.5)歲。I期10例，其中男1例、女9例，年齡(30.5±11.7)歲?？谄?0例，其中男2例、女8例，年齡(40.2±10.6)歲。皿期10例，其中男1例、女9例，年齡(39.6±12.8)歲°IV期10例，其中男1例、女9例，年齡(41.4±8.4)歲。正常對照組2共10名，其中男2名、女8名，年齡(32.3±12.6)歲。PBC肝組織各分期組之間與正常對照組2的性別構(gòu)成、年齡比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＞0.05)。二PBC血清組與正常對照組1的HCBP6水平表達(dá)比較PBC血清組HCBP6水平比正常對照組1低(t二6.815,P＜0.001)，見圖1。圖1PBC血清組與正常對照組1的HCBP6水平比較三、PBC肝組織各分期組與正常對照組2的臨床特征、肝組織HCBP6表達(dá)差異及其與病理分期的相關(guān)性與正常對照組相比,PBCI期、PBC口期、PBC皿期、PBCIV期的白蛋白、甘油三酯差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05);PBCI期、PBC皿期、PBCIV期血小板差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05);PBCm期、PBCIV期膽紅素、總膽固醇差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05)。與PBCI期相比,PBCH期、PBC皿期總膽固醇、甘油三酯差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05);PBCm期、PBCIV期白蛋白差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05);PBCIV期膽紅素差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。PBCH期相比，PBCIV期甘油三酯差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表2。免疫組化的染色結(jié)果顯示，HCBP6陽性染色主要定位于肝細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，呈棕褐色，細(xì)胞核中有少量染色。PBC患者中HCBP6陽性的細(xì)胞較正常肝組織明顯減少，正常對照組2與PBC肝組織各分期組間HCBP6陽性細(xì)胞數(shù)量比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均v0.01），見圖2、表3。秩相關(guān)分析顯示，HCBP6陽性細(xì)胞數(shù)量與肝組織病理分期呈負(fù)相關(guān)（rs=-0.583,Pv0.001）。討論原發(fā)性膽汁性肝硬化是一種自身免疫介導(dǎo)的慢性進(jìn)行性膽汁淤積性肝病，其病理特征為慢性進(jìn)行性小葉間膽管的破壞性炎癥改變，同時(shí)伴隨小膽管增生，肝內(nèi)結(jié)締組織增生，最終形成肝硬化。其主要臨床表現(xiàn)為門脈高壓和肝功能衰竭［7］。關(guān)于PBC的發(fā)病原因，目前大多學(xué)者認(rèn)為與自身免疫反應(yīng)相關(guān)，遺傳因素是主要的決定因素。另外雌激素、性染色體、泌尿道或陰道感染及環(huán)境因素也是重要的發(fā)病因素［8-16］。目前有研究認(rèn)為代謝綜合征在PBC的發(fā)病及疾病進(jìn)展中發(fā)揮重要作用［4］。而甘油三酯代謝異常是引發(fā)代謝綜合征的重要因素，所以甘油三酯的代謝異常在PBC的發(fā)病和疾病進(jìn)展中有可能起到重要作用。我們的初步研究表明HCBP6可下調(diào)甘油三酯，并隨甘油三酯的升高而上調(diào)［3］。提示我們HCBP6可能在PBC的發(fā)病及病程進(jìn)展中起重要作用。而我們的本次研究證實(shí)了這個(gè)觀點(diǎn)。通過比較健康人與PBC患者血清及組織中HCBP6的表達(dá)量，我們發(fā)現(xiàn)PBC患者中HCBP6的含量明顯下降，提示HCBP6可能參與了PBC的發(fā)病。表2PBC肝組織各分期組與正常對照組2的臨床特征比較（）注：INR為國際標(biāo)準(zhǔn)化比值；與正常對照組2相比，aPv0.05;與PBCI期組相比，bPv0.05;與PBC口期組相比，cPv0.05項(xiàng)目正常對照組2（10例）PBCI期（10例）PBCH期（10例）PBC皿期（10例）PBCIV期（10例）F值P值血小板計(jì)數(shù)（x109/L）226±44241±63a185±44162±97a139±92a0.8970.068白細(xì)胞計(jì)數(shù)（x109/L）5.2±0.55.1±1.35.1±1.05.9±1.74.6±1.70.1690.981膽紅素（pmol/L）11.8±2.210.1±5.517.2±11.838.0±36.6a27.4±20.6ab0.9220.066白蛋白（g/L）42.8±2.139.5±4.3a36.0±5.0a33.8±5.7ab35.0±1.6ab22.580v0.001INR0.97±0.070.95±0.050.93±0.590.94±0.101.00±0.903.3240.328總膽固醇（mmol/L）3.9±0.64.2±1.26.6±2.4b9.2±4.0ab8.3±6.6a18.9330.003甘油三酯（mmol/L）0.92±0.282.10±0.39a1.95±0.66ab1.80±0.90ab1.70±1.10ac23.010v0.001圖2PBC肝組織各分期組與正常對照組2免疫組化的染色結(jié)果（x400）A:正常對照組2;B:PBCI期；C:PBC口期；D:PBC皿期；E:PBCIV期表3肝組織HCBP6蛋白表達(dá)水平［例（％）］注：陽性染色為HCBP6染色半定量評(píng)分（++）或（+++）；aFisher確切概率法項(xiàng)目正常對照組2I期口期皿期V期rsP值HCBP6表達(dá)（-）00121-0.583v0.001（+）08879（++）22110（+++）80000陽性染色10（100）2（20）1（10）1（10） 0（0）-v0.001a關(guān)于代謝綜合征在PBC發(fā)病及進(jìn)展中的機(jī)制尚無相關(guān)研究。那HCBP6在PBC發(fā)病中的作用機(jī)制又是怎樣的呢？近期美國和意大利合作開展了一項(xiàng)多中心的研究給了我們一些提示［17］。這項(xiàng)研究選擇同卵雙胞胎，而在雙胞胎中一個(gè)患有PBC，另一個(gè)沒有PBC,利用全基因組研究分析2組的基因組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HCBP6的啟動(dòng)子甲基化與PBC的發(fā)病相關(guān)。而近期Gershwin團(tuán)隊(duì)的研究又證實(shí)了上述結(jié)論，他們認(rèn)為PBC患者中CD8+T淋巴細(xì)胞的HCBP6啟動(dòng)子存在高甲基化狀態(tài)，并且這種高甲基化與PBC的發(fā)病相關(guān)［18］。這都提示我們HCBP6在PBC的發(fā)病中的作用機(jī)制可能是啟動(dòng)子的甲基化，這將是我們下一步的研究內(nèi)容。綜上所述，HCBP6可能在PBC的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用，然而其作用機(jī)制是否為通過啟動(dòng)子甲基化，目前尚待進(jìn)一步研究。參考文獻(xiàn)相關(guān)文獻(xiàn)】王璐，常英昊，韓英.原發(fā)性膽汁性膽管炎的發(fā)病機(jī)制及治療進(jìn)展.國際消化病雜志，2019，39（2）：81-85.李克，王琳，成軍，張玲霞，段惠娟，陸蔭英，楊繼珍，劉妍，夏小兵，王剛，董菁，李莉，鐘彥偉，洪源，陳菊梅.HCV核心蛋白結(jié)合蛋白基因6的克隆.中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志，2002,16（4）：351-353.GaoLL，LiM，WangQ，LiuSA，ZhangJQ，ChengJ.HCBP6modulatestriglyceridehomeostasisinhepatocytesviatheSREBP1c/FASNpathway.JCellBiochem，2015，116（10）：2375-2384.HindiM,LevyC,CoutoCA,BejaranoP,MendesF.Primarybiliarycirrhosisismoresevereinoverweightpatients.JClinGastroenterol，2013，47（3）：e28-e32.王璐，韓英.《2018年美國肝病學(xué)會(huì)原發(fā)性膽汁性膽管炎實(shí)踐指導(dǎo)》摘譯.臨床肝膽病雜志，2018，34（11）：44-48.ScheuerP.Primarybiliarycirrhosis.ProcRSocMed，1967，60（12）：1257-1260.KaplanMM，GershwinME.Primarybiliarycirrhosis.NEnglJMed，2005，353（12）：1261-1273.StintonLM，SwainM，MyersRP，ShaheenAA，F(xiàn)ritzlerMJ.AutoantibodiestoGWbodiesandotherautoantigensinprimarybiliarycirrhosis.ClinExpImmunol，2011，163（2）：147-156.ChenRR，HanZY，LiJG，ShaheenAA，F(xiàn)ritzlerMJ.CytotoxicT-lymphocyteantigen4gene+49A/Gpolymorphismsignificantlyassociatedwithsusceptibilitytoprimarybiliarycirrhosis：ameta-analysis.JDigDis，2011，12（6）：428-435.SelmiC，MariaPA，PuglieseP，ClaudiaAM，GershwinME.Environmentalpathwaystoautoimmunediseases：thecasesofprimarybiliarycirrhosisandmultiplesclerosis.ArchMedSci，2011，7（3）：368-380.MitchellMM，LleoA，ZammataroL，MayoMJ，InvernizziP，BachN，ShimodaS，GordonS，PoddaM，GershwinME，SelmiC，LaSalleJM.EpigeneticinvestigationofvariablyXchromosomeinactivatedgenesinmonozygoticfemaletwinsdiscordantforprimarybiliarycirrhosis.Epigenetics，2011，6（1）：95-102.InvernizziP.Humanleukocyteantigeninprimarybiliarycirrhosis：anoldstorynowreviving.Hepatology，2011，54（2）：714-723.TanakaA，InvernizziP，OhiraH，KikuchiK，NezuS，KosoyR，SeldinMF，GershwinME，TakikawaH.Replicatedassociationof17q12-21withsusceptibilityofprimarybiliarycirrhosisinaJapanesecohort.TissueAntigens，2011，78（1）：65-68.SmykDS，RigopoulouEI，MuratoriL，BurroughsAK，BogdanosDP.Smokingasariskfactorforautoimmuneliverdisease：whatwecanlearnfromprimarybiliarycirrhosis.AnnHepatol，2012，11（1）：7-14.[15]BourniaVK,VlachoyiannopoulosPG.SubgroupsofSjogrensyndromepatientsaccordingtoserologicalprofiles.JAutoimmun，2012，39（1-2）：15-26.TunccanOG,TufanA,TelliG,AkyurekN,Pamuk^uogluM,YilmazG,HizelK.Visceralleishmaniasismimickingautoimmunehepatitis，primarybiliarycirrhosis，andsystemiclupuserythematosusoverlap.