菊花組織培養(yǎng)

課題一菊花的組織培養(yǎng)學(xué)習(xí)目標(biāo)：掌握植物細(xì)胞的全能性，明確植物細(xì)胞體現(xiàn)全能性的條件。了解植物組織培養(yǎng)技術(shù)在生產(chǎn)中的應(yīng)用。熟悉植物組織培養(yǎng)的基本過程。了解影響植物組織培養(yǎng)的各種因素。掌握植物組織培養(yǎng)的基本技術(shù)。有絲分裂受精卵細(xì)胞分化

在個(gè)體發(fā)育中，由一個(gè)或一種細(xì)胞增殖產(chǎn)生的后代，在形態(tài)、結(jié)構(gòu)和生理功能上發(fā)生穩(wěn)定性差異的過程。1、細(xì)胞分化的概念一、知識回顧黑色素細(xì)胞在體外培養(yǎng)30多代后仍能合成黑色素；離體培養(yǎng)的上皮細(xì)胞，始終保持為上皮細(xì)胞，而不會(huì)變成其他類型的細(xì)胞。2、穩(wěn)定性3、不可逆性細(xì)胞分化發(fā)生在整個(gè)生命進(jìn)程中。1、持久性2、細(xì)胞分化的特點(diǎn)造血干細(xì)胞原紅細(xì)胞早幼紅細(xì)胞中幼紅細(xì)胞晚幼紅細(xì)胞成熟紅細(xì)胞死亡4、普遍性

細(xì)胞分化是否意味著細(xì)胞中遺傳物質(zhì)的改變？

遺傳物質(zhì)沒有改變，不同組織的細(xì)胞共同來源于受精卵，經(jīng)有絲分裂產(chǎn)生。3、細(xì)胞分化的實(shí)質(zhì)ABDCEEDCABEDCABEDCABEDCAB基因在個(gè)體發(fā)育過程中，不同細(xì)胞中遺傳信息的執(zhí)行情況不同即基因的選擇性表達(dá)的過程

紅細(xì)胞合成血紅蛋白

(不合成肌動(dòng)蛋白)肌細(xì)胞肌動(dòng)蛋白基因開啟合成肌動(dòng)蛋白

(不合成血紅蛋白)肌動(dòng)蛋白基因關(guān)閉血紅蛋白基因關(guān)閉血紅蛋白基因開啟試一試:現(xiàn)在你能解釋這些現(xiàn)象了嗎?4、細(xì)胞分化的結(jié)果

細(xì)胞產(chǎn)生了不同種類的蛋白質(zhì)即出現(xiàn)了不同的結(jié)構(gòu)和功能愈傷組織胚狀體1958，美國，斯圖爾德

植物組織培養(yǎng)離體二、基礎(chǔ)知識（一）植物組織培養(yǎng)概念關(guān)鍵詞：外植體、脫分化、再分化、愈傷組織在無菌和人工控制條件下，將離體的植物（）

培養(yǎng)在人工配置的培養(yǎng)基上，給予適宜的培養(yǎng)條件，誘導(dǎo)其脫分化產(chǎn)生愈傷組織再分化形成叢芽，最終形成

。又稱：植物離體培養(yǎng)器官、組織、細(xì)胞完整的植株

由高度分化的植物組織或細(xì)胞產(chǎn)生愈傷組織的過程。

：脫分化產(chǎn)生的愈傷組織繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，又可以重新分化成根或芽等器官的過程。

：用于離體培養(yǎng)的植物器官或組織片段。

：細(xì)胞排列疏松、無規(guī)則、高度液泡化的無定形的薄壁細(xì)胞。外植體脫分化（或去分化）：再分化愈傷組織切取形成層無菌接種誘導(dǎo)愈傷組織的形成試管苗的形成培養(yǎng)室移栽脫分化再分化（二）植物組織培養(yǎng)的基本過程植物組織培養(yǎng)過程離體組織或細(xì)胞植物體脫分化細(xì)胞分裂素≈生長素愈傷組織芽根細(xì)胞分裂素>生長素細(xì)胞分裂素<生長素再分化植物細(xì)胞培養(yǎng)不需要光需要光（三）植物組織培養(yǎng)的理論基礎(chǔ)---細(xì)胞全能性概念：高度分化的植物細(xì)胞，仍然具有發(fā)育成完整個(gè)體的潛能?；A(chǔ)：生物體的每一個(gè)細(xì)胞都包含有該物種所特有的全套遺傳物質(zhì)。表達(dá)條件：離體條件無菌操作適宜物質(zhì)的誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)（植物激素）適宜的營養(yǎng)物質(zhì)溫度、酸堿度、光照等條件的控制思考這個(gè)試驗(yàn)說明了已經(jīng)分化的細(xì)胞核具有什么特性？高度分化的動(dòng)物體細(xì)胞的細(xì)胞核有發(fā)育成完整個(gè)體的潛能對比：多利羊的誕生動(dòng)物細(xì)胞有沒有這種能力？已經(jīng)分化的細(xì)胞（核），仍然具有發(fā)育成完整個(gè)體的潛能。細(xì)胞全能性思考為什么已經(jīng)分化的細(xì)胞具有全能性呢？高度分化的細(xì)胞含有保持物種發(fā)育所需要的全套基因植物組織培養(yǎng)技術(shù)動(dòng)物的克隆技術(shù)1、培育無病毒植株2、大規(guī)模培養(yǎng)愈傷組織（提取紫草素，治療燙傷和割傷的藥物以及染料和化妝品的原料）4、基因工程中亦需用到植物組織培養(yǎng)的方法（受體細(xì)胞為植物細(xì)胞）（四)植物組織培養(yǎng)的應(yīng)用：

3、人工種子（解決有些作物品種繁殖能力差，結(jié)子困難或發(fā)芽率低等問題）人工種子三、影響植物組織培養(yǎng)的因素1、材料的種類、年齡及保存時(shí)間長短等2、營養(yǎng)3、植物激素4、PH、溫度、光照等條件1、植物材料的選擇

---直接關(guān)系實(shí)驗(yàn)的成敗

①不同植物的組織培養(yǎng)難度不同eg：煙草和胡蘿卜的組織培養(yǎng)較為容易

枸杞愈傷組織的芽誘導(dǎo)比較難菊花的組織培養(yǎng)一般選擇未開花植株的莖上部新萌生的側(cè)枝②同一種植物材料，材料的年齡、保存時(shí)間的長短等也會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2、營養(yǎng)---MS培養(yǎng)基A、大量元素（）

B、微量元素（）C、有機(jī)物：()D、植物激素：()赤霉素等

Ｎ、Ｐ主要影響蛋白質(zhì)、核酸的合成；

K、Ca、Mg、S主要影響酶的活性。無機(jī)鹽蔗糖既是碳源也是調(diào)節(jié)滲透壓的物質(zhì)；維生素能促進(jìn)細(xì)胞分裂和誘導(dǎo)器官分化；甘氨酸是蛋白質(zhì)的組成成分，也是有機(jī)氮源。N、P、K、Ca、Mg、SB、Mn、Cu、Zn、Fe、Mo、I、Co甘氨酸、煙酸、肌醇、維生素、蔗糖生長素、細(xì)胞分裂素、MS固體培養(yǎng)基成分及比例討論：你能說出各種營養(yǎng)物質(zhì)的作用嗎？同專題2中微生物培養(yǎng)基的配方相比，MS培養(yǎng)基的配方有哪些明顯的不同？答：微量元素和大量元素提供植物細(xì)胞生活所必需的無機(jī)鹽；蔗糖提供碳源，同時(shí)能夠維持細(xì)胞的滲透壓；甘氨酸、維生素等物質(zhì)主要是為了滿足離體植物細(xì)胞在正常代謝途徑受到一定影響后所產(chǎn)生的特殊營養(yǎng)需求。微生物培養(yǎng)基以有機(jī)營養(yǎng)為主。與微生物的培養(yǎng)不同，MS培養(yǎng)基則需提供大量無機(jī)營養(yǎng)，無機(jī)鹽混合物包括植物生長必須的大量元素和微量元素兩大類。常用植物激素：生長素、細(xì)胞分裂素和赤霉素

生長素、細(xì)胞分裂素是啟動(dòng)細(xì)胞分裂、脫分化和再分化的關(guān)鍵性激素在生長素存在的情況下，細(xì)胞分裂素的作用呈加強(qiáng)的趨勢激素的使用順序、使用的量及比例影響植物細(xì)胞的發(fā)育方向3、植物激素的影響生長素類：2，4－二氯苯氧乙酸（2，4－D）、吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）等。細(xì)胞分裂素類：激動(dòng)素（KT）、6－芐基嘌呤（6－BA）、玉米素（ZT）等。赤霉素類：赤霉酸（GA3）等作用：2，4－D有利于愈傷組織的生長；

IAA、NAA、IBA有利于器官分化。作用：促進(jìn)細(xì)胞的分裂與分化，其中KT能明顯促進(jìn)芽的分化而抑制根的形成。作用：促進(jìn)不定芽和幼株伸長。使用順序?qū)嶒?yàn)結(jié)果先使用生長素，后使用細(xì)胞分裂素有利于細(xì)胞分裂，但不利分化先使用細(xì)胞分裂素后使用生長素細(xì)胞既分裂、也分化同時(shí)使用分化頻率高使用比例實(shí)驗(yàn)結(jié)果生長素細(xì)胞分裂素>生長素細(xì)胞分裂素<生長素細(xì)胞分裂素＝有利于根的分化有利于芽的分化，抑制根的分化促進(jìn)愈傷組織生長激素的使用順序、使用量及比例影響植物細(xì)胞的發(fā)育方向：植物組織培養(yǎng)過程離體組織或細(xì)胞植物體脫分化細(xì)胞分裂素≈生長素愈傷組織芽根細(xì)胞分裂素>生長素細(xì)胞分裂素<生長素再分化植物細(xì)胞培養(yǎng)不需要光需要光需光否abABC補(bǔ)充下圖（注：a、b過程，A、B、C為激素使用比例）a過程分裂方式（）b過程分裂方式（）有絲分裂有絲分裂思考：以下培養(yǎng)基出現(xiàn)的現(xiàn)象反應(yīng)了什么問題？生長素/細(xì)胞分裂素高利于根的形成適中利于愈傷組織的形成供參考的配方1、誘導(dǎo)菊花愈傷組織：在MS培養(yǎng)基中加入BA和NAA，質(zhì)量濃度均為0.5mg／Ｌ２、誘導(dǎo)菊花從芽：在MS培養(yǎng)基中加入BA和NAA，質(zhì)量濃度分別為2---3mg／Ｌ和0.02—0.03mg／Ｌ3、誘導(dǎo)菊花生根：在MS培養(yǎng)基各成分用量減半，并添加入NAA或IAA，質(zhì)量濃度均為0.1mg／Ｌ4．溫度、光照、pH的影響光照：菊花每日用日光燈照射12h。溫度：

大多數(shù)植物組織培養(yǎng)控制在23～27℃，低于15℃時(shí)植物組織會(huì)表現(xiàn)生長停止；高于35℃時(shí)對植物生長不利。菊花的組織培養(yǎng)控制在18～22℃。pH：

不同植物對培養(yǎng)基最適pH的要求不同，大多數(shù)控制在5～6.5。

菊花的組織培養(yǎng)控制在5.8左右。制備MS固體培養(yǎng)基外植體消毒接種培養(yǎng)栽培四、實(shí)驗(yàn)操作移栽沖洗—酒精—無菌水沖洗—氯化汞—無菌水沖洗至少三次之上配制各種母液配制培養(yǎng)基滅菌（一）制備MS固體培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基包括20多種營養(yǎng)成分，實(shí)驗(yàn)室一般使用4℃保存配制好的培養(yǎng)基母液來制備1、配制各種母液①無機(jī)物中大量元素濃縮10倍，微量元素濃縮100倍，常溫保存②激素類、維生素類以及用量較小的有機(jī)物一般可按1mg/ml的質(zhì)量濃度單獨(dú)配制成母液③用母液配制培養(yǎng)基時(shí)，需要根據(jù)各種母液的濃縮倍數(shù)，計(jì)算用量2、配制培養(yǎng)基分裝到錐形瓶中，每瓶分裝50ml或100ml①（）②（）③（）

由于菊花的莖段的組織培養(yǎng)比較容易，因此不必添加植物激素3、滅菌分裝好的培養(yǎng)基連同其他器械一起進(jìn)行高壓蒸汽滅菌配制培養(yǎng)液調(diào)PH培養(yǎng)基的分裝在植物組織培養(yǎng)的過程中，為什么要進(jìn)行一系列的消毒、滅菌，并且要求無菌操作？1、植物組織培養(yǎng)所利用的植物材料體積小、抗性差，對培養(yǎng)條件的要求較高：2、用于植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基同樣適合于某些微生物的生長,微生物產(chǎn)生的代謝廢物會(huì)毒害培養(yǎng)的對象；培養(yǎng)物一旦受到微生物的污染，就會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)前功盡棄；因此要進(jìn)行嚴(yán)格的無菌操作。無菌操作的原因？1、選材：

（二）外植體消毒2、消毒①流水沖洗菊花莖段用流水沖洗后可少許洗衣粉，用軟刷輕輕刷洗，刷洗后在

下沖洗20min左右②酒精處理用無菌吸水紙吸干外植體表面的水分，放入

中搖動(dòng)2－3次，持續(xù)6－7s，立即將外植體取出，在無菌水中清洗③消毒液處理取出后用

吸干外植體表面的水分，放入

中1－2min，取出后在無菌水中至少清洗3次，漂凈消毒液流水菊花莖段，取生長旺盛的嫩枝體積分?jǐn)?shù)為70％的酒精質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1％的氯化汞溶液無菌吸水紙（三）接種1、接種前用體積分?jǐn)?shù)70%酒精擦拭工作臺(tái)，點(diǎn)燃酒精燈，所有操作在酒精燈旁邊進(jìn)行，每次使用器械后都要灼燒滅菌2、將裝有培養(yǎng)基的錐形瓶整齊的排列在酒精燈左側(cè)，將消過毒的菊花莖段在無菌培養(yǎng)皿中切成小段（0.5-1cm）3、左手持錐形瓶，右手拉開捆扎錐形瓶的繩子，并將封口膜攥于右手手心，以避免封口膜接觸瓶口的一面被污染。左手持瓶，使瓶口旋轉(zhuǎn)通過火焰。4、右手用鑷子夾取菊花莖段，插入培養(yǎng)基中，不要倒插，每瓶6-8塊外植體，接種后，將封口膜重新扎好。5、接種注意事項(xiàng)①每接種一塊外植體前，鑷子需放入體積分?jǐn)?shù)為70％的酒精溶液中消毒一次，然后在酒精燈火焰上燒一遍，冷卻后再接種②外植體在培養(yǎng)基中要分布均勻，放置外植體數(shù)量根據(jù)錐形瓶的大小確定，一般胡蘿卜3－4塊，菊的莖或葉6－8塊，也不要太少，以充分利用培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分和光照條件③插入時(shí)應(yīng)注意方向：（）不要倒插。莖段、莖尖基部插入培養(yǎng)基利于吸收水分和養(yǎng)分形態(tài)學(xué)上端朝上，形態(tài)學(xué)下端朝下思考：你打算做幾組重復(fù)？你打算設(shè)置對照實(shí)驗(yàn)嗎？答：每種材料或配方至少要做一組以上的重復(fù)。設(shè)置對照實(shí)驗(yàn)可以取用一個(gè)經(jīng)過滅菌的裝有培養(yǎng)基的錐形瓶，與接種操作后的錐形瓶一同培養(yǎng)，用以說明培養(yǎng)基制作合格，沒有被雜菌污染。（四）培養(yǎng)接種后的錐形瓶最好放在無菌箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)期間應(yīng)定期消毒培養(yǎng)溫度控制在18-22℃每日用日光燈光照12h正常苗污染苗1、外植體帶菌2、培養(yǎng)基及接種器具滅菌不徹底3、接種操作時(shí)帶入4、環(huán)境不清潔污染途徑（五）移栽移栽生根的菊花試管苗之前，應(yīng)先打開培養(yǎng)瓶的封口膜，讓試管苗在培養(yǎng)間生長幾日。一般放置在20～25℃的遮蔭環(huán)境中，適應(yīng)5～7d。試管苗不萎蔫，有新生長的趨勢，便可移栽。1、打開封口膜2、清洗轉(zhuǎn)移用流水清洗根部的培養(yǎng)基，將幼苗移植到消過毒的蛭石或珍珠巖等環(huán)境下生活一段時(shí)間3、移栽幼苗長壯后，移栽到土壤中固體基質(zhì)型，含水量高、蓄水性強(qiáng)、透性好，適合栽培珍珠巖

,珍珠巖是一種火山噴發(fā)的酸性熔巖，經(jīng)急劇冷卻而成的玻璃質(zhì)巖石，有弧形或圓形裂隙，如珍珠的結(jié)構(gòu)，所以被命名為珍珠巖。蛭石是一種天然、無毒的礦物質(zhì)，在高溫作用下會(huì)膨脹的礦物。它是一種比較少見的礦物，屬于硅酸鹽。（六）栽培幼苗移栽后，每天觀察并記錄幼苗的生長情況，適時(shí)澆水、施肥，直至開花1、培養(yǎng)基的滅菌（高壓蒸汽滅菌）2、外植體的消毒（酒精、氯化汞）3、接種的無菌操作（酒精、酒精燈——灼燒）4、無菌箱中的培養(yǎng)；5、移栽到消過毒的環(huán)境中生存一段時(shí)間。小組討論：在整個(gè)操作過程中，是如何來實(shí)現(xiàn)無菌環(huán)境的？結(jié)果分析與評價(jià)（一）對接種操作中污染情況的分析（二）是否完成了對植物組織的脫分化和再分化（三）是否進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)、對照與記錄（四）生根苗的移栽是否合格五、課題延伸1、一般來說，容易進(jìn)行無性繁殖的植物，也容易進(jìn)行組織培養(yǎng)2、實(shí)例：蘆薈、豆瓣綠、秋海棠、月季營養(yǎng)繁殖扦插嫁接壓條

扦插嫁接壓條

探究植物激素的使用比例（A=生長素/細(xì)胞分裂素）對植物組織培養(yǎng)的影響

例如：設(shè)計(jì)對照實(shí)驗(yàn)

（1）不加植物激素（2）A＝1

（3）A＞1

（4）A＜1菊花的組織培養(yǎng)再分化材料性質(zhì)、營養(yǎng)物質(zhì)、調(diào)節(jié)物質(zhì)、環(huán)境條件外植體的消毒接種基本原理:細(xì)胞的全能性基本過程:脫分化愈傷組織影響因素：操作流程：配制MS固體培養(yǎng)基培養(yǎng)移栽栽培練習(xí)1.答：植物組織培養(yǎng)所利用的植物材料體積小、抗性差，對培養(yǎng)條件的要求較高。用于植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基同樣適合于某些微生物的生長，如一些細(xì)菌、真菌等的生長。而培養(yǎng)物一旦受到微生物的污染，就會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)前功盡棄，因此要進(jìn)行嚴(yán)格的無菌操作。2.答：外植體的生理狀態(tài)是成功進(jìn)行組織培養(yǎng)的重要條件之一。生長旺盛的嫩枝生理狀況好，容易誘導(dǎo)脫分化和再分化。達(dá)標(biāo)檢測1．下列四個(gè)選項(xiàng)中，肯定沒有采用植物組織培養(yǎng)技術(shù)的一項(xiàng)是（）

A．花藥離體培養(yǎng)得到單倍體植株

B．秋水仙素處理萌發(fā)的種子或幼苗得到多倍體植株

C．基因工程培育的抗棉鈴蟲的棉花植株

D．細(xì)胞工程培育“番茄－馬鈴薯”雜種植株基礎(chǔ)鞏固2．菊花的花粉經(jīng)組織培養(yǎng)可發(fā)育成一株幼苗，這一過程不涉及下列哪一項(xiàng)（）A．有絲分裂、細(xì)胞分化、組織器官的形成B．呼吸作用、光合作用、相關(guān)激素的調(diào)控C．DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)