紫外分光光度法測定核苷酸含量

生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)：

核酸的紫外掃描及含量測定實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.了解紫外分光光度計(jì)的基本原理并掌握其使用方法。2.掌握使用紫外分光光度法測定核酸含量的原理和方法。實(shí)驗(yàn)原理

核酸、核苷酸及其衍生物都具有共軛雙鍵，具有紫外吸收。RNA和DNA的紫外吸收峰為260nm。一般在260nm波長下，每毫升含1mgDNA溶液的光吸收值約為0.020，每毫升含1mgRNA溶液的光吸收值為0.022。故測定待測濃度RNA或DNA溶液260nm的光吸收值即可計(jì)算出其中核酸的含量。此法操作簡便，迅速。若樣品內(nèi)混雜有大量的核苷酸或蛋白質(zhì)等能吸收紫外光的物質(zhì)，則測定誤差較大，故應(yīng)設(shè)法事先除去。純凈的RNA溶液，其A260/A280≥2；純凈的DNA溶液，其A260/A280≥1.8。

實(shí)驗(yàn)原理如果已知待測的核酸樣品不含酸溶性核苷酸或可透析的低聚多核苷酸，即可將樣品配制成一定濃度的溶液(20～50mg/mL)，在紫外分光光度計(jì)上直接測定。

蛋白質(zhì)由于含有芳香氨基酸，因此也能吸收紫外光。通常蛋白質(zhì)的吸收高峰在280nm處，在260nm處的吸收值僅為核酸的十分之一或更低，故核酸樣品中蛋白質(zhì)含量較低時對核酸的紫外測定影響不大。

RNA在260nm與280nm處的吸收比值在2.0以上，DNA的比值則在1.9左右。當(dāng)樣品中蛋白質(zhì)含量較高時，比值即下降。實(shí)驗(yàn)器材1.UV-1000型紫外可見分光光度計(jì)操作指南：1.打開儀器電源，系統(tǒng)自檢，并預(yù)熱20min。2.選擇“光度測量”，按“enter”進(jìn)入吸光度測量。3.關(guān)上暗盒蓋，將裝參比液的比色皿，推入光路中，按“enter”進(jìn)入后，系統(tǒng)自動調(diào)整投射比為100%和0%。4.關(guān)上暗盒蓋，將裝參比液的比色皿，推入光路中，按“zero”鍵調(diào)使吸光度A為0.000。5.測量樣品。將被測溶液推入光路中，待讀數(shù)穩(wěn)定后，讀取吸光度。6.儀器使用完畢，取出比色皿，洗凈、晾干。7.關(guān)閉電源開關(guān)，拔下電源插頭，復(fù)原儀器。8.登記《儀器使用記錄表》關(guān)于比色皿：比色皿的前后有2個光滑面，是用來對準(zhǔn)光路的，左右有2個粗糙面，手只能拿比色皿的粗糙面，不能接觸光滑面。比色皿的內(nèi)部的清洗只能用蒸餾水潤洗（用洗瓶），不可用衛(wèi)生紙或其他物品捅進(jìn)去擦洗，比色皿的2個光滑面一定要保持清潔，如發(fā)現(xiàn)有指紋或殘液，須用衛(wèi)生紙輕輕擦拭干凈。比色皿是成套發(fā)放的，嚴(yán)禁混用，本實(shí)驗(yàn)使用的是石英比色皿。使用完畢后先用自來水內(nèi)外沖洗干凈比色皿，再用洗瓶沖洗比色皿的內(nèi)外表面1次，將其粗糙面朝下斜靠在培養(yǎng)皿中。2.取樣器：參見實(shí)驗(yàn)一，10uL、200uL各1支/組。

使用指南：接好套頭（不漏氣）→通過旋鈕調(diào)節(jié)容量（如500表示5mL）→用活塞第一擋吸液→用活塞第一擋和第二擋放液→換套頭→繼續(xù)使用。注意，平時取樣器應(yīng)掛在架子上，絕不可倒置，以免溶液倒流入槍體中而損壞儀器。3.其他器材：試管，試管架、燒杯、衛(wèi)生紙。實(shí)驗(yàn)試劑1.

蒸餾水

2.

待測的DNA溶液樣品測定：1.取兩個比色皿，一個加蒸餾水做空白對照。一個用來加DNA樣品。2.取10uL的DNA樣品,加入90uL的蒸餾水稀釋10倍。進(jìn)行測定含量。4．清潔紫外分光光度計(jì)（尤其是比色槽內(nèi)）、清洗比色皿，整理好桌面上的儀器和試劑。數(shù)據(jù)處理第一組：試管1234567標(biāo)準(zhǔn)DNA溶液（ml）00.10.20.40.60.81蒸餾水（ml）54.94.84.64.44.24A26000.0270.0530.1210.1700.2550.324λ（nm）

240250260270280290A0.1780.2250.3230.2640.1850.081λm260

試管1234567A26000.0270.0530.1210.1700.2550.324

試管8對應(yīng)于標(biāo)準(zhǔn)DNA溶液的毫升數(shù)V1.9ml

待測的DNA溶液的濃度（μg/ml）38μg/ml由公式V*100/5計(jì)算待測DNA溶液的A260/A2801.8待測的DNA溶液是否純凈不純凈第二組：試管1234567標(biāo)準(zhǔn)DNA溶液（ml）00.10.20.40.60.81蒸餾水（ml）54.94.84.64.44.24A26000.0400.0690.1320.2100.2640.309λ（nm）240250260270280290A0.1770.2650.3090.2560.1710.080λm260試管8對應(yīng)于標(biāo)準(zhǔn)DNA溶液的毫升數(shù)V1.91ML待測的DNA溶液的濃度（μg/ml）38.1A260/A2801.76待測的DNA溶液是否純凈不純凈第三組：試管1234567標(biāo)準(zhǔn)DNA溶液（ml）00.10.20.40.60.81蒸餾水（ml）54.94.84.64.44.24A26000.0360.0640.1200.1730.2620.298λ（nm）240250260270280290A0.1740.2680.2980.2590.1670.079λm260試管8對應(yīng)于標(biāo)準(zhǔn)DNA溶液的毫升數(shù)V1.97ML待測的DNA溶液的濃度（μg/ml）39.4A260/A2801.77待測的DNA溶液是否純凈不純凈思考題1.若樣品中含有蛋白質(zhì)，應(yīng)如何排除干擾？答：當(dāng)樣品中蛋白質(zhì)含量較高時，將樣品移到試管中，加入一定量的吸煙溶液，用玻璃棒小心攪拌，使蛋白沉淀，滴加少量