第41章基因工程及蛋白質工程12

第41章基因工程及蛋白質工程Chapter41.GeneandProteinEngineering1第一節(jié)概述基因工程（geneengineering）:是對攜帶遺傳信息的分子進行施工的分子工程，包括基因重組、克隆和表達?；蚬こ踢@個術語既可用來表示特定的基因施工項目，也可泛指它所涉及的技術體系，其核心是構建重組體DNA的技術，因此基因工程和重組體DNA技術(DNArecombination)有時也就成為同義詞。

蛋白質工程（proteinengineering):是在基因工程基礎上發(fā)展起來的。是指通過對蛋白質已知結構與功能的認識，借助計算機輔助設計，利用基因定位誘變等技術改造蛋白質，以達到改進其某些性能的目的。21972年美國斯坦福大學的Berg和他的同事將λ噬菌體基因和大腸桿菌乳糖操縱子插入猴病毒SV40DNA中，首次構建出DNA的重組體。1973年，Cohen和Boyer獲得了抗四環(huán)素和新霉素的重組菌落，標志著基因工程的誕生。EcoRIDNALigaseTetracyclinepSC101Kanamycin

R6-5KanrandTetr3

技術上的三大發(fā)現(xiàn)

限制性內切酶和DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)（標志著DNA重組時代的開始）。載體的使用。逆轉錄酶的發(fā)現(xiàn)。4

第二節(jié)工具酶

DNA分子的剪切、重組、合成及修飾涉及一系列酶促反應，催化這些反應的酶是基因操作的基本工具，故又稱為工具酶。工具酶在基因克隆中占有非常重要的地位，只有了解其作用機制后，才能加以靈活應用。5

用于核酸操作的工具酶限制性核酸內切酶DNA連接酶DNA聚合酶核酸酶核酸修飾酶反轉錄酶6一、限制性核酸內切酶

限制性核酸內切酶(restrictionendonuclease)又稱限制性內切酶，簡稱為限制酶。這類酶能識別雙鏈DNA分子內部的特異位點并且裂解磷酸二酯鏈。主要存在于原核細菌中，幫助細菌限制外來DNA的入侵。1968年，Smith等人首先從流感嗜血桿菌d株中分離出HindII和HindIII。7（一)限制酶的命名和分類1.限制性核酸內切酶的命名屬名種名株名Haemophilus

influenzae

d

（嗜血流感桿菌d株）HindII

HindIII同一菌株中所含的多個不同的限制性核酸內切酶82.限制性核酸內切酶的分類主要特性I型II型

III型蛋白結構限制修飾輔助因子識別序列切割位點雙功能異源三聚體ATPMg2+SAMTGAN8TGCT（EcoB）AACN6GTGC（EcoC）距識別序列1kb處隨機性切割單功能同源二聚體Mg2+旋轉對稱序列

識別序列內或附近特異性切割雙功能異源二聚體ATPMg2+SAMGAGCCCAGCAG距識別序列下游24-26bp處9（二)II型限制酶的識別和切割位點II型限制性核酸內切酶的基本特性:識別雙鏈DNA分子中4-8對堿基的特定序列,大部分酶的切割位點在識別序列內部或兩側,識別切割序列呈典型的旋轉對稱型回文結構(palindrome).EcoRI的切割位點EcoRI的識別序列5‘…GCTGAATTCGAG…3’3‘…CGACTTAAGCTC…5’5‘…GCTGAATTCGAG…3’3‘…CGACTTAAGCTC…5’10中英聯(lián)合實驗室EcoRI等產生的5‘粘性末端(Stickyend)退火4-7℃3‘…C-G-A-G

A-C-G-T-C-C-T-C…5’POH5‘…G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G…3’HOPEcoRI37℃3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’11PstI等產生的3‘粘性末端5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’PstI37℃3‘…C-G-A-G-P

OH-A-C-G-T-C-C-T-C…5’5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G…3’退火4-7℃5‘…G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G

A-C-G-T-C-C-T-C…5’POHHOP12PvuII等產生的平頭末端(blundend)5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C…5’PvuII37℃3‘…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C…5’5‘…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G…3’13

現(xiàn)巳提純供商品用的限制酶有400余種，其中常用者列舉于表下表14

使用限制酶時應注意提供適宜的反應條件，如DNA底物的純度、濃度、分子結構和構型、緩沖液的PH及離子強度等。如果反應體系不能滿足最適條件，則可能導致酶產生第二活性，又稱星活性(staractivity)，即限制酶嚴格的識別特異性降低，導致其在DNA分子內產生附加切割。如EcoRI，當反應條件改變時，其特異性可由原來6bp的GAATTC降為4bp的AATT，一般用EcoRI＊表示，稱為EcoRI的星活性。15

由不同微生物分離得到的限制酶，如果識別位點和切割位點完全一樣，稱為同裂酶（isoschizomers）；如僅僅是粘性末端突出的單鏈相同，稱為同尾酶（isocaudamers）。由同尾酶切割的限制片段彼此相連，不能再被原來的限制酶切割。例如，BamHI限制片段與BglII的限制片段相連后，其序列變?yōu)?，與原來兩個限制酶的識別序列均不相同，因此不再為原來的酶所切割。同裂酶、同尾酶16同裂酶GCCTAGGATCTA5'-3'--3'-5'GCCTAGGATCCGGATCCTAG5'-3'--3'-5'BamHI

BglII5'-A3'-TT-3'A-5'同尾酶17二.DNA連接酶

DNA連接酶(DNALigase)的作用是催化DNA片段之間的5’磷酸基和3’羧基間形成3’，5’-磷酸二酯鍵，主要用于連接兩個獨立的DNA片段或修復雙鏈DNA中一條鏈上的切口。現(xiàn)常用的有：

T4DNA連接酶：粘性末端、平頭末端，需ATP

大腸桿菌DNA連接酶：只能連接粘性末端，需NAD+。18OHPOHP修復雙鏈DNA上缺口處的磷酸二酯鍵5‘…G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G

A-C-G-T-C-C-T-C…5’nicknickDNA連接酶5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’19連接多個平頭雙鏈DNA分子：5‘…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G

…3’3‘…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C

…5’T4-DNA連接酶5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G

…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C

…5’20三、DNA聚合酶

基因克隆中常用的DNA聚合酶(DNApolymerase)：大腸桿菌DNA聚合酶I（DNApolI）K1enow片段T4DNA聚合酶。1.大腸桿菌DNA聚合酶I（DNApolI）

大腸桿菌DNA聚合酶I的基本性質：5‘→3‘的DNA聚合酶活性

5‘→3‘的核酸外切酶活性

3‘→5‘的核酸外切酶活性

21由于它具有5’→3’核酸外切酶活性，當用缺口平移法(nicktranslation)標記DNA探針時，常用DNA聚合酶I。DNApolIMg2+5‘dNTP5‘pppdA（a-32P-dATP）DNaseI5’…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3’…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5’

5’…G-C-T-CA-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3’…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5’

5’…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3’…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5’

222.大腸桿菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）

Klenow酶的基本性質：大腸桿菌DNA聚合酶I經枯草桿菌蛋白酶處理，獲得N端三分之二的大肽段，即為Klenow酶。Klenow酶仍擁有5‘→3‘的DNA聚合酶活性和3‘→5‘的核酸外切酶活性，但失去了5‘→3‘的核酸外切酶活性。23Klenow酶的基本用途：補平由核酸內切酶產生的5‘粘性末端DNA片段的同位素末端標記cDNA第二鏈的合成雙脫氧末端終止法測定DNA序列24Klenow酶的基本用途：補平由核酸內切酶產生的5‘粘性末端5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’KlenowdATPdTTP5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-T-T-A-A-G-C-T-C…5’25Klenow酶的基本用途：DNA片段的同位素末端標記Klenowa-32P-pppdATPdTTP5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-T-T-A-A-G-C-T-C…5’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’263.T4-DNA聚合酶T4-DNA酶的基本特性：5‘→3‘的DNA聚合酶活性和3‘→5‘的核酸外切酶活性在無dNTP時，可以從任何3‘-OH端外切在只有一種dNTP時，外切至互補核苷酸暴露時停止在四種dNTP均存在時，聚合活性占主導地位27T4-DNA聚合酶的基本用途I：切平由核酸內切酶產生的3’粘性末端5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-P

HO-A-C-G-T-C-C-T-C…5’T4-DNA聚合酶5‘…G-C-T-C-OH

P-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-P

HO-C-C-T-C…5’注意：該酶也能降解雙鏈DNA，只是其活性比單鏈降解活性低很多28T4-DNA聚合酶的基本用途II：DNA片段的同位素末端標記5‘G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T3’3‘C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A5‘T4-DNApol5‘G-C-T-CA-G-C-T-G-OHHO-T-C-G-A-C-C-T-C-A5‘T4-DNApolMg2+5‘pppdN5‘ppp

dA（a-32P-dATP）5‘G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T

3’3‘C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A5‘29四、反轉錄酶（依賴于RNA的DNA聚合酶，AMV、M-MuLV）反轉錄酶的基本特性：以RNA為模板聚合cDNA鏈3’AAAAAAAAAAAAAA5’mRNA5’TTTTTTTTTTTToligo(dT)12-183’AAAAAAAAAAAAAA5’mRNA5’TTTTTTTTTTTTTT3’cDNA反轉錄酶Mg2+dNTP303’RNA5’

DNA3’5’3’RNA5’

DNA3’5’5’

DNA3’反轉錄酶的基本特性：雙向外切DNA-RNA雜合鏈中的RNA鏈反轉錄酶反轉錄酶31大腸桿菌的核酸外切酶VII不需要Mg2+單鏈核酸外切酶：核酸外切酶VII（ExoVII）五、核酸酶ExoVII3’5’3’5’3’5’3’5’32ExoVII3’5’3’5’Mg2+3’5’3’5’大腸桿菌的核酸外切酶III特異性地從3‘-OH端外切，并且優(yōu)先切3‘凹陷端。雙鏈核酸外切酶：核酸外切酶III（ExoIII）33lExo3’5’3’5’Mg2+3’5’3’5’雙鏈核酸外切酶：l核酸外切酶（lExo）l核酸外切酶特異性地從5‘端外切34單鏈核酸內切酶：S1核酸酶來自稻谷曲霉菌（Aspergillusoryzae）5‘…G-C-T-C-A-GC-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5‘5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C

A-C-C-T-C-A…5‘nickgapS1Zn2+5‘…G-C-T-C-A-G3‘…C-G-A-G-T-CT-G-G-A-G-T…3’A-C-C-T-C-A…5‘S1核酸酶的基本反應：內切帶缺口或缺刻的雙鏈DNA或

RNA（雙鏈中的單鏈區(qū)）35DNAmRNA雜交S1EcoRIS1核酸酶的重要用途：在DNA上定位RNA（S1mapping）36Ca2+5‘dNMPs或5‘NMPsssDNAorRNACa2+Ca2+單鏈內切雙鏈外切的核酸酶：Bal31核酸酶來自艾氏交替單胞菌（A.espejiana）37EcoRIACEcoRIEcoRIBCABal31BCA環(huán)化ACBal31核酸酶的基本用途：誘發(fā)DNA缺失突變B38TdTMg2+

dATP5‘p3‘HOAAAAAAAAAOH3‘p5‘六、核酸修飾酶末端脫氧核苷酰轉移酶（TdT）來自小牛胸腺5‘p3‘HOOH3‘p5‘不需要模板的DNA聚合酶，隨機摻入dNTPs395‘p3‘HOOH3‘p5‘TdTCo2+

dATP5‘p3‘HOAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOH3‘p5‘5‘p3‘HOOH3‘p5‘TdTCo2+

dATP5‘p3‘HOAAAAAAAAAAAAAAOH3‘p5‘AAAAAAAAAAA405‘pOH3‘

DNAorRNA5‘pppdN5‘pppNBAP/CIPOH3‘

5‘HO5‘HOdN5‘HON堿性磷酸單酯酶來自小牛胸腺的堿性磷酸單酯酶（CIP）來自大腸桿菌的堿性磷酸單酯酶（BAP）415‘HO3‘HOOH3‘OH5‘T4-PNPMg2+

pppATP（g-32P-ATP）5‘p3‘HOOH3‘p5‘T4-多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP）T4-PNP的基本特性：在DNA、RNA的5‘-OH上加磷用于探針的末端同位素標記：42第三節(jié)載體

用來插人外源DNA片段構建重組DNA分子，并能將外源DNA攜帶進入宿主細胞的DNA稱作基因克隆裁體，簡稱為載體(vector)。載體的功能運送外源基因高效轉入受體細胞為外源基因提供復制能力或整合能力為外源基因的擴增或表達提供必要的條件43載體應具備的條件具有自主復制的能力

攜帶易于篩選的選擇標記含有多種限制酶的單一識別序列，以供外源基因插入除保留必要序列外，載體應盡可能小，便于導入細胞和進行繁殖使用安全

44一、質粒載體1.質粒的基本特征質粒（plasmid)是生物細胞內固有的、能獨立于寄主染色體而自主復制、并被穩(wěn)定遺傳的一類核酸分子質粒常見于原核細菌和真菌中絕大多數(shù)的質粒是DNA型的絕大多數(shù)的天然DNA質粒具有共價、封閉、環(huán)狀的分子結構，即cccDNA.質粒DNA的分子量范圍：1～300kb45

拷貝數(shù)的控制機制-保持恒定的拷貝數(shù)

野生型的質粒DNA上往往攜帶一個或多個遺傳標記基因物質抗性:抗生素、重金屬離子、毒性陰離子、有機物

物質合成:抗生素、細菌毒素、有機堿

這些標記基因對DNA重組分子的篩選具有重要意義462.常用的質粒載體pBR322：①分子量較小，4.3kb，能克隆較大外源DNA；②具有氨芐青霉素和四環(huán)素兩種抗生素的抗性基因；③在兩種抗生素抗性基因中間存在限制酶切位點，便于外源基因的插入和篩選④具有較高的拷貝數(shù)，這為重組DNA的制備提供了極大方便。47pUC18/19：

pUC質粒載體是在pBR322質粒載體的基礎上，組入了一個在其5’端帶有一段多克隆位點的1acZ’基因，而發(fā)展成為具有雙功能檢測特性的新型質粒載體系列。①來自于pBR322質粒的復制起始點(ori)；②氨芐青霉素抗性基因(Ampr)；③大腸桿菌b-半乳糖苷酶基因1acZ’的啟動子及其編碼。a-肽鏈的DNA序列；④位于lacz’基因中的靠近5’端的一段多克隆位點(MCS)區(qū)段；48PlaclacZ’MCSawX-galpUC18/19：正選擇標記lacZ’的顯色原理5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷b-半乳糖苷酶的a-肽段49二、噬菌體載體1.大腸桿菌的l噬菌體（lphage)l噬菌體是一種大腸桿菌噬菌體，由頭、尾兩部分組成。頭部呈六角型，裝載了噬菌體的整個基因組(即lDNA)。lDNA為雙鏈線狀分子，長約48.5kb，在分子兩端各有12bp的互補單鏈(是天然的粘性末端)，稱cos位點。當噬菌體吸附于宿主細胞膜后，lDNA自噬菌體的尾部注入宿主細胞，其兩個粘性末端互相結合，既可以裂解性生長，也可以溶解性生長。DNA重組技術一般需要l噬菌體進入溶菌狀態(tài)502.l噬菌體載體

野生型l-DNA包裝的包裝范圍為原來DNA的75-105%，即36-51kb，本身長度為48.5kb，只有當插入的外源DNA片段不大于2.5kb時，才能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒。因此縮短野生型l-DNA的長度，可以提高裝載量。其實野生型l-DNA上約有40-50%的片段是復制和裂解所非必需的。根據(jù)切除的多少，野生型噬菌體經突變和缺失等手段改造，已衍生出上百種克隆載體。

衍生載體有插入型載體和置換型載體。

A．插入型載體

將野生型l噬菌體的lDNA中多余限制酶切位點刪除，使其中心僅留有幾個單一酶切位點。這樣經限制酶切割的lDNA便能夠與經同樣限制酶消化的外源DNA片段結合，使之插入在這個位點上，而不導致噬茵體功能的喪失。51體外包裝插入位點體外包裝插入片段載體長度

37kb插入片段大?。?-14kb插入型載體

當插入的cDNA閱讀框與1acZ基因相一致時，能產生融合蛋白質，可以用免疫學方法，如蛋白質印跡分析進行檢測。此外，因外源基因插入使1acZ基因失活，故在含x-gal培養(yǎng)基中形成白斑，而未重組的形成藍色斑點，便于區(qū)分篩選。插入型載體有：Charon2、Charon6、lgt11等。52B.置換型載體

lDNA中心區(qū)段是一些非必需序列，將該區(qū)段刪除并替換上一個兩側多克隆位點是反向重復序列的外源DNA片段，即可建成置換型克隆載體。當外源DNA插入時，一對克隆位點之間的DNA片段即會被置換掉，從而有效地提高了克隆外源DNA片段的能力。載體有：lEMBL4、lgtlc、lNM762、Charon40等。插入片段最小裝載長度

10kb載體長度

26kb插入片段最大裝載長度

25kb體外包裝體外包裝533.M13噬菌體M13噬菌體的生物學特性：

生物結構M13噬菌體的外型呈絲狀M13

噬菌體由外殼包裝蛋白和正鏈DNA組成

M13

噬菌體不裂解宿主細胞，但抑制其生長

M13

DNA全長6407個核苷酸M13DNA上至少有10個基因2700個外殼蛋白分子54+DNA（+）DNARFDNARFDNARFDNA-DNA感染周期55

M13噬菌體的最大優(yōu)點是噬菌體顆粒中所含的是單鏈DNA，可作為模版用于DNA序列分析。

另外，利用單鏈M13克隆可制備成單鏈DNA探針，用于檢測DNA或RNA的雜交分析。

也可以用作基因定位誘變的載體。噬菌體成熟后分泌出細胞，可以從細胞培養(yǎng)液的上清液中獲得噬菌體，制備單鏈噬菌體DNA。雙鏈噬菌體DNA可通過裂解細胞進行制備。

但M13-DNA載體的最大缺陷是裝載量小，只有1.5kb56pHC796400bpTcrlfragmentcosoriAprPstIBamHISalI

考斯質粒（黏粒）是一類人工構建的含有l(wèi)-DNAcos序列和質粒復制子的特殊類型的載體。1978年Collins和Hohn發(fā)明。1.8kb的l-DNA片段+pBR322片段。裝載范圍為31-45kb。其本身分子較小，如pHC79僅6.4kb。由于非重組體質粒很小，不能在體外包裝，因而體外包裝的主要是重組體，有利于以后的篩選。4.考斯質粒（cosmid）57

三、表達載體

表達載體(expressionvector)是用來在宿主細胞中表達外源基因的載體。這類載體除具有克隆載體所具備的性質外，還帶有表達構件-轉錄和翻譯所必需的DNA序列。表達載體包括原核細胞表達載體,真核細胞表達載體（昆蟲細胞、哺乳動物細胞和植物表達載體）。581.原核細胞表達載體-大腸桿菌表達載體

一個良好的大腸桿菌表達載體應具備克隆載體所具備的特性。選擇標記的抗菌素抗性基因復制起始點克隆位點等此外，還應含有表達系統(tǒng)元件即啟動子核糖體結合位點終止子59大腸桿菌表達載體的基本結構特征60

啟動子trp一1ac啟動子又稱為tac啟動子，是一個雙啟動子或稱雜合啟動子，由trp啟動子加上1ac操縱子中的操縱基因、SD順序融合而成。整個tac啟動子受1ac阻抑物調控，在1ac阻抑物高水平表達的lacIq大腸桿菌菌株中，其轉錄可被抑制，異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)可誘導其表達。

l噬菌體PL啟動子是一種溫度誘導的啟動子，受控于溫度敏感的阻抑物。在低溫下(37℃)可以阻抑PL啟動子的轉錄，但在高溫下(42℃)則失去阻抑作用。含PL啟動子的表達載體需轉化到M5219茵株中才能調控表達。61

T7噬菌體啟動子是一個表達效率很高的啟動子，但需要特殊的受體菌，如JMl09(DE3)等。核糖體結合位點

mRNA在細菌中的翻譯效率依賴于是否有核糖體結合位點(ribosomeBidingSite，RBS)的存在。RBS包括起始密碼(ATG)和SD序列。SD(Shine-Dalgarno)序列,富含嘌呤核苷酸，16SrRNA3‘-末端富嘧啶的序列互補，mRNA于是與核糖體很好結合。

終止子

一個基因3’-末端的能被RNA聚合酶識別并停止轉錄的DNA序列稱為轉錄終止子。原核生物終止子序列有一段富含A／T的區(qū)域和一段富含G／C的區(qū)域，富含G／C區(qū)域具有回文對稱結構。這種終止子轉錄后形成的RNA具有莖環(huán)結構。622.真核細胞表達載體-哺乳動物表達載體

克隆基因要在哺乳動物細胞中進行表達，必須將基因重組到適當?shù)恼婧吮磉_載體中。哺乳動物表達載體含有必不可少的原核序列，如在大腸桿菌中能起作用的復制起始位點以及便于篩選重組質粒的抗生素抗性基因等，還含有在真核細胞中工作的遺傳元件，如增強子、啟動子、轉錄終止序列以及加多聚腺苷酸的信號序列等。63增強子一啟動子

有些來源于動物病毒的啟動子和增強子能被真核細胞識別。如SV40病毒早期基因增強子(SV40)、Rouse肉瘤病毒基因組長末端重復序列(Rsv)、人類原細胞病毒(heMV）等。轉錄終止和加poly(A)信號一是位點下游的GU富集區(qū)，二是Po1y(A)加尾信號：AAUAAA。64

第四節(jié)基因克隆的基本程序

基因克隆的基本程序包括五大步驟：①制備目的基因;②連接目的基因與裁體形成重組體;③將重組體轉入宿主細胞；④重組體的篩選和鑒定；⑤重組體的擴增和表達。65目的基因是指要克隆或表達的基因目的基因可以有如下幾種來源和制備方法：1．從基因文庫中篩選：將某一種基因組DNA用適當?shù)南拗泼盖袛嗪?，與載體DNA重組，再全部轉化宿主細胞，得到含全部基因組DNA的種群，稱為G-文庫(genomicDNAlibrary)。將某種細胞的全部mRNA通過逆轉合成cDNA，然后轉化宿主細胞，得到含全部表達基因的種群，稱為C-文庫(cDNAlibrary)。C-文庫具有組織細胞特異性。

一、目的基因的制備66

基因組文庫分離、純化基因組DNA

條件：溫和，在EDTA或SDS等存在下

↓RE

用蛋白酶K消化細胞、酚抽提大小不同酶切片段

片段分離：常用蔗糖梯度或電泳分離

↓分別與同樣RE消化的載體連接

常用噬菌體載體或質粒載體

↓

DNA連接酶連接。

導入細胞

進入宿主細胞內培養(yǎng)擴增。

↓篩選鑒定

用分子雜交、凝膠電泳等方法鑒定。67cDNA文庫（1）合成cDNA第一條鏈反應體系只有mRNA、逆轉錄酶、4種dNTP、引物。引物是與mRNA3ˊ端polyA互補的寡聚dT（12～18dT片段）（2）合成cDNA第二條鏈

RNase去掉模板mRNA（3）構建cDNA文庫①cDNA兩端加接頭②cDNA與載體相連。③導入宿主細胞進行克隆，這些菌體內保存cDNA集合體便是cDNA文庫。683.利用PCR合成：

如已知目的基因兩端的序列，則可采用聚合酶鏈反應（polymerasechainreaction,PCR）技術，在體外合成目的基因。694.人工合成：

根據(jù)已知多肽鏈的氨基酸順序，利用遺傳密碼表推定其核苷酸順序再進行人工合成。適應于編碼小分子多肽的基因。

二、目的基因與載體重組

目的基因片段與適當?shù)妮d體經限制酶剪切后，再在DNA連接酶的催化下即可相互連接，形成人工重組體。常用體外重組方法主要有以下四種。70粘性末端連接法：當載體DNA和目的基因均用同一種限制酶進行切斷時，二者即可帶有相同的粘性末端。如將載體與目的基因混合在一起，二者即可通過粘性末端進行互補粘合，再加入DNA連接酶，即可封閉其缺口，得到重組體。71722.同聚物加尾連接法:當載體和目的基因無法采用同一種限制酶進行切斷，無法得到相同得粘性末端時，可采用此方法。此法首先使用單鏈核酸酶將粘性末端切平，再在末端核苷酸轉移酶的催化下，將脫氧核糖核苷酸添加于載體或目的基因的3‘-端，如載體上添加一段polyG，則可在目的基因上添加一段polyC，故二者即可通過堿基互補進行粘合，再由DNA連接酶連接。733.人工接頭連接法：

將人工接頭（linker),即一段含有多種限制酶切點的DNA片段,連接到載體和目的基因上，即有可能使用同一種限制酶對載體和目的基因進行切斷，得到可以互補的粘性末端。744.平端連接法：

利用T4DNA連接酶可催化連接相同或不同限制酶切割的平端dsDNA。75

在基因克隆技術中，將質粒DNA及其重組體導入細菌稱為轉化(transformation)；將病毒及其重組體導入宿主細胞稱為轉染(transfection)；將噬菌體及其重組體才入宿主細胞稱為轉導(transduction)。

三、重組DNA導入宿主細胞76

將受體菌懸浮在低溫0℃和低滲CaCl2溶液中，菌菌體細胞壁通透性增加、膨脹成球形，易于吸收外源DNA，這種狀態(tài)的菌稱謂感受態(tài)菌（competant)。

1.氯化鈣法77

電穿孔法（electroporation)最早用于DNA導入真核細胞，現(xiàn)已用于大腸桿菌和其他細菌。將對數(shù)生長期的大腸桿菌與外源DNA混合于電穿孔杯中，在高頻電流作用下，細胞壁出現(xiàn)許多小孔，外源DNA即可進入細胞內。電轉化應在0℃～4℃進行。該法的優(yōu)點是無需制備感受態(tài)細胞，故操作較氯化鈣法簡單，其轉化率也比較高，可獲得108～109轉化子／mgDNA。其缺點是需特殊儀器。2.電穿孔法78

近年相繼發(fā)展了系列廣譜和高效的脂質體。脂質體是一類雙層的微囊結構，如DOSPER和infectAMINETM，含有一個親水性正電荷的精胺基團頭和疏水性脂酸尾，可與DNA分子結合成脂質體／多核苷酸復合物，使DNA免受DNase的降解，精胺基團可與帶負電荷的細胞表面非特異吸附，易于通過細胞內吞作用而進入細胞內。該方法的優(yōu)點是轉化率最高，轉化細胞類型廣泛。其缺點是脂質體價格昂貴。3.脂質體轉染法79

顯微注射法是在顯微鏡下，經細胞玻璃針將外源DNA直接注入細胞。該方法是將DNA準確注入細胞核中最可靠的方法，特別是借助于電腦技術更為精確快速。該法適用于多種貼壁生長細胞及懸浮生長細胞.其缺點是儀器昂貴，對實驗者的操作技巧和熟練程度的要求比較高。4.顯微注射法80根瘤土壤桿菌（Agrobacteriumtumefaciens）的Ti質粒（tumer-inducingplasmid）有一段T-DNA，即轉移DNA，能攜帶基因轉移到植物細胞內并整合到染色體DNA中。因此Ti質粒是目前植物基因工程最常見的基因載體。將外源基因插入Ti質粒載體的T-DNA

，借助土壤桿菌而將外源基因導入植物細胞。

5.根瘤土壤桿菌法81

基因槍法又稱微彈轟擊法，是利用壓縮氣體產生的動力，將包裹在金屬顆粒表面的表達載體DNA打入受體細胞中，使目的基因與其整合并表達的方法。6.基因槍法82四、重組體的篩選和鑒定

由于重組體導入宿主細胞的比例通常較低，因此需要對含有重組體的宿主細胞進行篩選并作鑒定。可采用以下方法進行：

1.根據(jù)重組體的表型進行篩選：對于帶有抗藥基因的質粒重組體，可采用插入滅活法進行篩選。如pBR322中帶有抗氨芐青霉素和抗四環(huán)素基因，當將目的基因插入抗四環(huán)素基因后，就可引起該基因失活，細菌對氨芐青霉素耐藥，而對四環(huán)素敏感。在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上能夠生長，而在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上不能生長的細菌即為帶重組體的細菌。還可以根據(jù)b-乳糖苷酶a-互補(alphacomplemention)的顏色反應進行篩選。83842.根據(jù)標志互補進行篩選：

當宿主細胞存在某種基因及其表達產物的缺陷時，可采用此方法篩選重組體。即在載體DNA分子中插入相應的缺陷基因，如宿主細胞重新獲得缺陷基因的表達產物，則說明該細胞中帶有重組體。組氨酸缺陷型大腸桿菌無組氨酸的培養(yǎng)基酵母咪唑甘油磷酸脫水酶基因促進組氨酸合成λDNA重組體853.根據(jù)DNA限制酶譜進行分析：

經過粗篩后的含重組體的細菌，還需進行限制酶譜分析進一步鑒定。將單一細菌進行擴增后分別提取其DNA，用重組時所用的同一限制酶進行酶切，再將其與不含目的基因的載體一起進行電泳比較分析，如發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)目的基因片段的電泳帶即證明重組體中帶有目的基因。864.用核酸雜交法進行分析鑒定：為了進一步鑒定重組基因體中的目的基因，可采用與目的基因部分互補的DNA片段作為探針，與含有重組體的細菌菌落進行雜交，經放射自顯影，如結果為陽性，即可確定重組體中帶目的基因。875.PCR篩選法:一些載體克隆位點外源DNA插入點兩側存在可作為PCR引物的已知序列，如pGEM載體系列的多克隆位點(MCS)兩側為SP6、T7，對抽提出的重組DNA進行PCR分析，不但可迅速擴增插入片段，而且可以直接進行DNA序列測定。6.免疫化學等方法:如果外源基因能夠在宿主細胞進行表達，合成外源蛋白質．可以采用免疫化學等方法檢測，即用已知的抗體來檢測目的基因編碼的抗原。88第五節(jié)真核基因在大腸桿菌中的表達根據(jù)被表達的基因和表達基因所用的系統(tǒng)可將表達分為四種：①原核基因在原核細胞中的表達；②真核基因在原核細胞中表達；③原核基因在真核細胞中表達；④真核基因在真核細胞中表達。89一、真核基因在大腸桿菌中表達的基本條件

①真核細胞的目的基因必須來自于cDNA；

②真核基因mRNA缺乏結合細菌核糖體的SD序列，因此

cDNA的起始密碼子(ATG)上游部分(5’端非編碼區(qū))是無用的，必須除去;③表達載體應是含有大腸桿菌RNA聚合酶所能識別的啟動子如PL、tac、T7等;④為提高表達效率，應根據(jù)啟動子類型和特定的蛋白質，選擇合適的菌株和誘導條件。90二、真核基因在大腸桿菌中的表達方式真核基因在E.coli中可以表達為:融合蛋白、非融合蛋白或分泌型表達。1.融合蛋白融合蛋白的氨基端是原核序列，羧基端是真核序列。融合蛋白中由于含有一段原核多肽序列。缺點：可能影響其真核蛋白的免疫原性；優(yōu)點：①在菌體內比較穩(wěn)定，容易實現(xiàn)高效表達；②基因操作比較簡單；③可以切除其氨基端的原核多肽，而獲得具有生物學活性的真核天然蛋白分子。91

非融合蛋白是指在細菌內表達的蛋白。以真核蛋白mRNA的AUG為起始，在其氨基端不含任何原核多肽序列。為此，表達非融合蛋白的操縱子須改建成原核啟動子—原核SD序列—真核基因的起始密碼子、結構基因及終止密碼子。3.蛋白分泌型表達

將真核基因重組于編碼原核蛋白信號肽序列的下游，以表達帶有原核蛋白信號肽的融合蛋白。這種融合蛋白當分泌到位于E.coli細胞內膜與外模之間的間質時，其信號肽可被信號肽酶切割，而真核蛋白分泌至胞外。2.非融合蛋白92優(yōu)點：①可減少所需蛋白質在宿主菌內的降解；②有些在細胞內表達時無活性的蛋白質分泌表達時則具有活性；③分泌后的蛋白質氨基端不含起始密碼子編碼的甲硫氨酸；④蛋白質分泌至胞外后便于提純。93第六節(jié)、蛋白質工程94一.蛋白質工程的理論和技術基礎蛋白質結構和功能的關系DNA重組技術和基因定點誘變等技術二.蛋白質工程的研究內容通過改變蛋白質的活性部位，提高其生物功效及獨立工作的能力；通過改變蛋白質的結構順序，提高其在極端條件(如酸、堿、熱等)下的穩(wěn)定性；通過改變蛋白質的結構順序使其便于分離純化。95三.蛋白質工程的目的1)研究蛋白質結構與功能的關系2)改變蛋白質的特性3)生產蛋白質和多肽類活性物質提高酶的產量和創(chuàng)建新型酶設計和研制新型抗體設計和研制多肽及蛋白質類藥物設計合成全新蛋白質96四、蛋白質工程的技術原理定點誘變(Site-directedMutagenesis)

蛋白質的結構決定功能，二者之間的關系是蛋白質組研究的重點之一。在體外對某個已知基因的特定堿基進行定點改變，通過取代、缺失或者插入，可以改變對應的氨基酸序列和蛋白質結構的技術叫定點誘變。對突變基因的表達產物進行研究不僅有助于我們了解蛋白質結構和功能的關系，還可以改造天然蛋白質的性質。97定點誘變的優(yōu)點

傳統(tǒng)的誘變技術（如化學或物理誘變劑）處理的生物體，具有突變頻率低且任何基因都可能發(fā)生突變等問題。定點誘變技術是一種通過改變基因中的特定位置的堿基，從而改造蛋白質的技術。跟傳統(tǒng)的誘變技術相比，具有高效、簡單、目的性和重復性強等特點，是我們在實驗室中改造、優(yōu)化基因常用的手段。98帶突變位點的寡核苷酸可介導定點誘變99Kunkel法Dut:dUTP酶Ung:N-尿嘧啶脫糖苷酶100PCR誘變法的步驟PCR誘變法的原理是利用人工合成帶突變位點的誘變引物，通過PCR擴增而獲得定點突變的基因或DNA片段。

PCR定點誘變法可分為重組PCR定點誘變法和大引物誘變法兩種。重組PCR定點誘變法：該方法是利用四種引物，三輪PCR反應來進行的,操作較為繁瑣。大引物誘變法：該方法是利用三種引物，兩輪PCR反應來進行的。101重組PCR定點誘變法102大引物PCR定點誘變法(分離擴增產物)103盒式誘變(cassettemutagenesis)104

利用定點誘變的方法對天然酶蛋白質進行改造已有很多成功的例子。然而，該方法僅適用于三維結構以及結構與功能的相互關系基本清楚的蛋白質，目前我們對這類關系的認識還很膚淺。對于那些結構與功能關系尚不清楚的酶蛋白，定點突變是無能為力的。近年來有人提出“定向進化”的觀點，為酶的結構與功能的研究開辟了嶄新的途徑。105

酶(蛋白質）的體外定向進化(directedevolutionofenzymeinvitro)是1993年,由美國科學家Aronld首先提出的概念，是改造酶蛋白質分子的一種新策略。它不需事先了解酶的定向結構和催化機制，在實驗室模擬自然進化機制，通過由易錯PCR、致突變菌株誘變等方法對編碼酶蛋白質的基因進行隨機誘變，由DNA改組(DNAshuffling)、隨機引發(fā)重組和交錯延伸等方法進行突變基因體外重組，設計高通量篩選方法來選出需要的突變株。不僅可快速生產工業(yè)上有用的新酶，而且為研究蛋白質的結構與功能的關系開辟了嶄新的途徑。2.定向進化106107定向進化的常用技術易錯PCRDNA改組隨機引發(fā)重組交錯延伸技術108易錯PCR易錯PCR（errorpronePCR）是指在擴增目的基因的同時引入堿基錯配，導致目的基因隨機突變。連續(xù)易錯PCR(sequentialerrorpronePCR)策略。即將一次PCR擴增得到的有用突變基因作為下一次PCR擴增的模板，連續(xù)反復地進行隨機誘變。109DNA改組

DNA改組(DNAshuffling)是Stemmer于1994年建立的模仿自然進化的一種DNA體外隨機突變方法。所謂DNA改組，就是將DNA拆散后重排，即將一種基因或具有結構同源型的幾種基因在DNaseI的作用下隨機酶切成小片段，這些小片段之間有部分的堿基序列重疊，它們通過自身引導PCR(self-primingPCR)延伸，并重新組裝成全長的基因，這一過程被稱為再組裝PCR(reassemblyPCR)。110DNA改組的基本過程目的基因的準備：根據(jù)需要選擇一個基因或其片段，也可以是幾個序列上具有較高同源性的基因；DNaseI酶切：將目的基因隨機切割成約10-50bp或300bp左右的小片段；不加引物的PCR：在Taq酶的作用下將DNaseI切割后的DNA重疊小片段重新連接起來，在此過程中可能發(fā)生許多突變和重組加入引物的PCR：加入目的基因片段兩端的引物，使連接好的DNA得到擴增，篩選正突變。得到正突變子又可以重復進行改組，使性狀進一步提高。111112隨機引發(fā)重組

隨機引發(fā)重組(random-primingrecombination，RPR)是Aronld于1998年首先報道。其基本原理是以單鏈DNA為模板，配合一套隨機序列引物，先產生大量互補于模板不同位點的DNA小片段，由于堿基的錯誤摻入和錯誤引發(fā)，在隨后的PCR反應中，它們互為引物進行合成，伴隨重組，再組裝成完整的基因，克隆到表達裁體上，隨后篩選。113114第七節(jié)、基因工程與蛋白質工程的應用與展望

基因工程技術已經在醫(yī)學、工業(yè)、農業(yè)等各個領域得到了廣泛的應用。

1151、基因工程技術與醫(yī)藥制造業(yè)

1982年,美國Lilly公司首先將重組胰島素投放市場,標志著世界上第一個基因工程藥物誕生。目前,以基因工程藥物為主導的基因工程應用產業(yè)已成為全球發(fā)展最快的產業(yè)之一,發(fā)展前景非常廣闊?；蚬こ趟幬镏饕毎蜃印⒖贵w、疫苗、激素和寡核苷酸藥物等。116117胰島素1000磅牛胰10克胰島素200升發(fā)酵液10克胰島素干擾素1200升人血1升發(fā)酵液2－3萬美元/病人200－300美元/病人1182、基因工程技術在工業(yè)生產中的應用

隨著石油、煤炭等不可再生資源的大量消耗，能源危機和環(huán)境污染已經成為影響人類可持續(xù)發(fā)展的最大障礙。以中國為例，按已探明儲量和年開采量計算，中國的石油資源有可能在20余年內枯竭。面對日益增加的危機，大力開發(fā)新的可再生性資源已經成為人類走可持續(xù)發(fā)展道路的前提條件。生物質資源是地球上數(shù)量最豐富的可再生資源，全球每年光合作用的生物質高達1500-2000億噸，其中80%以上為木質纖維素類物質，估計其年產量相當于目前所需能源的10倍，但這些可再生資源被作為能源利用的還不到1%。所以，開發(fā)利用生物質可再生資源是十分必要和迫切的。目前，利用生物質—如淀粉和纖維素等可再生資源轉化生產燃料酒精已經成為研究的熱點。119

但由于纖維素的組成和結構非常復雜，使得在纖維素的生物降解和纖維素水解產物的生物轉化上，都還存在著一些問題，如：纖維素酶活力低、微生物對纖維素水解底物利用率低等。為此，人們嘗試利用基因工程手段，對微生物進行定向改造來促進可再生資源的生物轉化。

已經從細菌和真菌中克隆到各種纖維素酶基因。如人們已成功將來自糞肥纖維單胞菌的內切和外切纖維素酶基因導入酵母中，發(fā)現(xiàn)其能向培養(yǎng)基中分泌纖維素酶，且活性提高了70%。120

通過基因工程育種可使植株獲得各種抗性，使品質和產量得到改良和提高3、基因工程技術在農業(yè)上的應用

1994年第1個轉基因作物產品延熟保鮮轉基因番茄獲得美國農業(yè)部和美國食品與藥品管理局批準進入市場,開創(chuàng)了轉基因食品商業(yè)應用的先河。截止1998年6月，國外批準商業(yè)化生產的各類轉基因作物已近90種，常用的有大米、玉米、棉花、油菜和馬鈴薯。1986年全世界被批準進入田間實驗的植物只有5例，到1997年達2,584例。大量的轉基因生物體作為食品或其他生活品進入人們的生活。121

我國人口眾多，土地資源相對貧乏，糧食生產壓力很大。GMO能改善食品品質、抗蟲、增產、增加作物對病菌的抵抗力，減少水土流失及農藥使用量，從而帶來顯著的農業(yè)效益和經濟效益。

2008年7月9日,國務院常務會議就審議通過“轉基因生物新品種培育科技重大專項”,該專項擬投入資金約240億元人民幣,將主要投入到優(yōu)勢基因的挖掘、轉基因品種選育和轉基因作物品種的產業(yè)化;其次,2009年中央一號文件中曾提到,我國將加快推進轉基因生物新品種培育科技重大專項,整合科研資源,加大研發(fā)力度,盡快培育一批抗病蟲、抗逆、高產、優(yōu)質、高效的轉基因新品種,并促進產業(yè)化。

2009年12月，我國轉基因玉米(中國農業(yè)科學院生物技術研究所)和轉基因水稻(華中農業(yè)大學)獲得安全證書.122轉基因作物123124125126127蘇云金桿菌在芽孢形成過程中，菌體內可產生大量具有高度特異性殺蟲活性的結晶蛋白組成，這種蛋白通常被稱之為殺蟲晶體蛋白或蘇云金桿菌毒蛋白（Bttoxin）。Bt基因是目前抗蟲轉基因中應用最為廣泛和成熟的一種基因。Bt對于鱗翅目某些昆蟲的幼蟲有特異的毒性作用。128Non-transgenicsTransgenicsHerbicideResistancetransgene=modifiedEPSPsynthaseorphosphinothricin-N-acetyltransferase129改善營養(yǎng)品質的轉基因植物TheGoldenRiceStory

VitaminAdeficiencyisamajorhealthproblem

Causesblindness

Influencesseverityofdiarrhea,measles

>100millionchildrensufferfromtheproblem

Formanycountries,theinfrastructuredoesn’texisttodelivervitamin