非編碼RNA研究進(jìn)展

非編碼RNA研究進(jìn)展長非編碼RNA長非編碼RNA長度在200bp以上。啟動子相關(guān)長鏈RNA（promoterassociatedlongRNAs，PARs）；轉(zhuǎn)錄超保守區(qū)域（transcribedultraconservedregions，T-UCR）；長鏈非編碼RNA（longnon-codingRNAs，lncRNAs）；假基因（pseudogenes）；反義RNA（antisenseRNA,asRNAs）。小RNA（SmallRNA）SmallRNA包含miRNA(microRNA)、ncRNA(non-codingRNA)、siRNA(smallinterferingRNA)、snoRNA(smallnucleolarRNA)、piRNA(piwi-interactingRNA)、rasiRNA(RepeatassociatedsmallinterferingRNA)等。高通量測序技術(shù)在SmallRNA研究中的應(yīng)用包括：靶基因功能研究，生命活動調(diào)節(jié)，發(fā)育進(jìn)化研究，生物Marker,致病機(jī)理研究，藥物開發(fā)等。Smallnon-codingRNA（小非編碼RNA)小非編碼RNA的RNA長度在20-35bp；微小RNA（microRNAs,miRNAs）；源于核糖體RNA片段（tRNA-derivedfragment，tRF)；PIWI蛋白作用RNA（PIWI-interactingRNAs，piRNAs）；核仁小分子RNA（C/DsnoRNA-derivedRNA,sdRNA）；小干擾RNA（smallinterferingRNAs，siRNAs）。miRNAs與siRNAs與ARGONAUTE(AGO)/PIWI蛋白家族中的AGO亞族結(jié)合。小RNA在基因表達(dá)、表觀遺傳、疾病發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮著重要功能。高豐度、高穩(wěn)定性和高特異性預(yù)示其在臨床分子標(biāo)志物(biomarker)研究中具有高潛在價值。SmallRNA轉(zhuǎn)錄組測序是鑒定和定量解析smallRNA的新方法和有力工具。RocheGSFLXTitanium、IlluminaSolexaGAIIx和ABSOLID4均可以對SmallRNA進(jìn)行大規(guī)模測序(Large-scalesequencing)分析，IlluminaSolexaGAIIx和ABISolid的讀長正好配合了smallRNA的短序列且通量大，可以得到更高覆蓋率，IlluminaSolexaGAIIx在smallRNA測序中廣泛應(yīng)用。通過對SmallRNA大規(guī)模測序(Large-scalesequencing)分析，可以從中獲得物種全基因組水平的SmallRNA圖譜，實現(xiàn)包括新SmallRNA分子的挖掘，其作用靶基因的預(yù)測和鑒定、樣品間差異表達(dá)分析、SmallRNA聚類和表達(dá)譜分析等科學(xué)應(yīng)用。圖釋：A：piRNA和miRNA在PAGE凝膠上的片段分布區(qū)域十分接近；B：同時對這兩片段區(qū)域的RNA進(jìn)行測序。SmallRNA測序有什么樣的樣品要求？(1)樣品純度要求：OD值應(yīng)在1.8至2.2之間；電泳檢測28S:18S至少大于1.5。(2)樣品濃度：totalRNA濃度不低于750ng/μg；提取總RNA時請不要使用過柱法提取總RNA，樣品總量不低于40μg?(SmallRNA:totalRNA大于0.3%)。或提供濃度大于2ng/μg，總量大于180ng的SmallRNA樣品。(3)SmallRNA樣品請置于-20℃保存；請?zhí)峁㏒mallRNA樣品具體濃度、體積、制備時間、溶劑名稱及物種來源。請同時附上QC數(shù)據(jù)，包括電泳膠圖、分光光度或Nanodrop儀器檢測數(shù)據(jù)。如需進(jìn)行多次樣品制備，需要提供多次樣品制備所需樣品。(4)樣品運輸：樣品請置于1.5ml管中，管上注明樣品名稱、濃度以及制備時間，管口使用Parafilm封口。建議使用干冰運輸，并且盡量選用較快的郵遞方式，以降低運輸過程中樣品降解的可能性。SmallRNA分離方法？現(xiàn)行的RNA純化方法包括有機(jī)溶劑抽提+乙醇沉淀，或者是采用更加方便快捷的硅膠膜離心柱的方法來純化RNA。由于硅膠膜離心柱通常只富集較大分子的RNA(200nt以上)，SmallRNA往往被淘汰掉，不適用于SmallRNA分離純化。有機(jī)溶劑抽提能夠較好的保留SmallRNA，但是后繼的沉淀步驟比較費時費力。目前還有另外一些SmallRNA分離專用的試劑盒。如MirVanamiRNAIsolationKit是采用玻璃纖維濾膜離心柱(glassfiberfilter，GFF)，既能夠富集10mer以上的RNA分子，又兼?zhèn)潆x心柱快速離心純化的特點。對于SmallRNA測序，采用PAGE膠電泳對小RNA進(jìn)行分離?？梢赃x擇感興趣的SmallRNA長度進(jìn)行研究。SmallRNA的長度為18-30nt。推薦的測序長度為35bp，之后對序列信息進(jìn)行修剪，去除接頭序列僅留下SmallRNA序列。由于Solexa的讀長足夠滿足SmallRNA測序的讀長要求，且數(shù)據(jù)讀取量大，性價比高，因此Solexa在SmallRNA測序方面得到廣泛的應(yīng)用。采用Solexa進(jìn)行SmallRNA測序其文庫構(gòu)建方法如下：(1)PAGE膠純化特定大小的小RNA分子；(2)5′接頭連接和純化；(3)3′接頭連接純化；(4)RT-PCR擴(kuò)增；(5)SmallRNA文庫的純化；(6)文庫的檢測。SmallRNA文庫需要通過電泳檢測和AgilentTechnoligies2100分析儀檢測以分析測序文庫中片段的大小、純度和濃度。SmallRNA測序文庫的構(gòu)建方法及質(zhì)量控制？高通量測序研究SmallRNA優(yōu)勢？(1)可以直接從核苷酸水平上研究SmallRNA分子，不存在傳統(tǒng)芯片雜交的熒光模擬信號帶來的交叉反應(yīng)和背景噪音問題，利于區(qū)分相同家族以及序列極為相似的不同SmallRNA分子；(2)可以對任意物種進(jìn)行高通量分析，無需任何預(yù)先的序列信息以及二級結(jié)構(gòu)信息；(3)靈敏度高，測序通量大，為SmallRNA分子的發(fā)現(xiàn)和研究提供了極大數(shù)據(jù)深度與覆蓋率，能夠檢測豐度極低的稀有轉(zhuǎn)錄；(4)測序產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)可以與多種分析軟件兼容，可以注釋SmallRNA的基因組信息，并分析其表達(dá)水平，能夠隨時使用公用SmallRNA數(shù)據(jù)庫注釋已知的SmallRNA，還可以進(jìn)一步分析未匹配的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)新的SmallRNA種類及異構(gòu)體，尋找更深入的研究信息。SmallRNA測序的影響因素？(1)樣本的質(zhì)量：進(jìn)行SmallRNA測序過程中，需要對SmallRNA進(jìn)行分離，分離SmallRNA的質(zhì)量和純度直接影響測序結(jié)果。由于RNA容易降解，因此RNA的抽提、純化等操作一定要嚴(yán)格按照實驗要求進(jìn)行，以保證樣品的質(zhì)量。(2)構(gòu)建文庫的質(zhì)量：文庫構(gòu)建需要PAGE膠分離純化SmallRNA，然后連接接頭進(jìn)行純化后才能進(jìn)行RT-PCR，在此過程中，要小心操作保證SmallRNA無降解，同時純化過程要保證接頭去除干凈，殘余的接頭會對后續(xù)的測序產(chǎn)生影響。(3)測序文庫的上樣量控制：這個因素也會很大程度影響簇生成的密度，由于上樣量非常小，只有1-8pg，所以能否準(zhǔn)確定量微量樣品也是影響測序通量的重要因素。piRNA

[Piwi-interactingRNA(piRNA)]

piRNA的發(fā)現(xiàn)piRNA的發(fā)現(xiàn)為非編碼小分子RNA的研究開辟了一個新領(lǐng)域，被Science評為2006年十大科技進(jìn)展之一。2006年，四個獨立的研究小組幾乎同時在果蠅、小鼠、大鼠和人等物種生殖系細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了一類特異地與PIWI家族蛋白質(zhì)相互作用的新型小分子RNA。Aravin等發(fā)現(xiàn)了該種小RNA，他們在3個月大的C57BL/6J雄性小鼠從小鼠全睪丸組織的全細(xì)胞裂解液中利用免疫共沉淀技術(shù)純化并獲得MILI核糖核蛋白復(fù)合體。該復(fù)合體中含有26-28ntRNA進(jìn)行凝膠純化，克隆和測序。他們根據(jù)Piwi蛋白家族的成員MILI與這些小RNA的相互作用，命名為PiwiinteractingRNAs，即piRNAs。AravinA，GaidatzisD，PfefferS，etal．《AnovelclassofsmallRNAsbindtoMILIproteininmousetestes》．Nature，2006，442（7099）：203～207.GirardA，SachidanandamR，HannonGJ，etal．《AgermlinespecificclassofsmallRNAsbindsmammalianPiwiproteins》．Nature，2006，442（7099）：199～202Argonaute蛋白的一種亞家族——Piwi蛋白家族，為無脊椎動物的精子和干細(xì)胞的發(fā)育所必需。兩種Piwi蛋白家族成員：MILI和MIWI是小鼠精子形成所必需的。Girard等在睪丸總RNA分離過程中也檢測到了這種小RNA，它與MIWI蛋白（一種鼠科的Piwi蛋白）結(jié)合。這些小分子RNA在減數(shù)分裂起始期積累。所確證的這些1,000多條獨特小分子RNA序列均具有強(qiáng)的5'尿嘧啶偏愛性。這些小分子RNA的遺傳圖譜顯示了數(shù)量有限的基因簇，表明這些小分子RNA由較長的初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物加工而成。這些小分子RNA的長度為26–31個核苷酸。明顯與21–23個核苷酸的microRNAs和短siRNAs不同。因此我們稱其為“Piwi相互作用RNA”或者piRNAs。他們用小鼠17號染色體，大鼠20號染色體和人的6號染色體進(jìn)行分析，發(fā)有類似的piRNA，大多數(shù)基因簇出現(xiàn)在同線位置上。直系同源（Orthologous）的人類染色體區(qū)域也能產(chǎn)生具有piRNAs特性的小分子RNA，但序列不同。該類新型小分子RNA的證實為確定哺乳動物中精子形成過程中的Piwi蛋白的作用提供了起點。LauNC，SetoAG，KimJ，etal．《CharacterizationofthepiRNAcomplexfromrattestes》．Science，2006，313（5785）：363～367GrivnaST，BeyretE，WangZ，etal．《AnovelclassofsmallRNAsinmousespermatogeniccells．Genes&Dev，2006，20（13）：1709～1714此外，相繼有3篇文章也分別報道了在小鼠的生精細(xì)胞、生殖系細(xì)胞以及睪丸中發(fā)現(xiàn)了piRNA。其中日本的實驗室根據(jù)來源將其命名為germlinesmallRNA（gsRNA），由于命名原則的不同，故在名稱上存在一定的差異。YukaW.Iwasaki,MikikoC.Siomi,andHaruhikoSiomi,《PIWI-InteractingRNA:ItsBiogenesisandFunctions》，AnnualReviewofBiochemistry，2015，Vol.84:405-433piRNA的起源piRNA來源于基因組中的piRNA簇(piRNAcluster)或轉(zhuǎn)座子區(qū)域，由長的單鏈轉(zhuǎn)錄本切割產(chǎn)生。成熟的piRNA24-32nt。piRNA在動物界廣泛表達(dá)，目前尚未在植物中檢測到。除線蟲外，從海綿動物(sponges)到高等哺乳動物中保守存在兩條piRNA生成途徑：初級生成途徑（primarypathway）：初級生成途徑主要發(fā)生在體細(xì)胞中，主要由單鏈piRNA簇、雙鏈piRNA簇、基因來源的piRNA和轉(zhuǎn)座子來源的生成途徑。單鏈的piRNA前體加工成piRNA中間體后于Piwi蛋白結(jié)合發(fā)生細(xì)胞核或者細(xì)胞質(zhì)沉默事件。次級生成途徑（secondarypathway）：次級生成途徑主要發(fā)生在生殖細(xì)胞中，PIWI家族在果蠅中有3個成員——Piwi、Aub和Ago3，其中Piwi和Aub結(jié)合初級piRNA。由初級加工途徑生成的Aub-piRNA大多來源于轉(zhuǎn)座子的反義鏈，可以通過序列互補(bǔ)配對識別正義鏈的轉(zhuǎn)錄本，然后由Aub切割形成次級piRNA的5'端，并裝載到Ago3上，再通過與初級加工途徑類似的3'端修剪、甲基化修飾等過程得到正義鏈來源的次級piRNA。Ago3-次級piRNA復(fù)合物再以同樣的機(jī)制剪切產(chǎn)生反義鏈的Aub-次級piRNA，即被稱作乒乓循環(huán)(ping-pangcycle)的piRNA次級加工途徑。小鼠睪丸中同樣存在由Mili和Miwi2介導(dǎo)的乒乓循環(huán)。piRNA是最近從哺乳動物睪丸組織中發(fā)現(xiàn)的一類能與PIWI蛋白質(zhì)相互作用的新型小RNA；長度比一般的小RNA略長，分布在26～31nt之間，大部分集中在29～30nt、5′端具有尿嘧啶(U)偏向性(約86%)；piRNA是單鏈小分子RNA；piRNA與Argo蛋白家族中的Piwi亞家族蛋白相互結(jié)合，在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的功能十分活躍；piRNA的表達(dá)具有組織特異性；無明顯特殊性的二級結(jié)構(gòu)特異基序和特征。piRNA的結(jié)構(gòu)特征piRNA在染色體上的分布極不均勻，在小鼠中主要分布在17、5、4、2染色體上，基本上不分布在性染色體上；piRNA主要存在于基因間隔區(qū)，而很少存在于基因區(qū)和重復(fù)序列區(qū)；它們一般集中成簇分布在1～100kb相對較短的基因組位點，一個這樣的位點一般包含10～4500個小分子RNA；每一個成簇的piRNA幾乎都具有同一取向，說明同一簇piRNA可能來源于同一個初始轉(zhuǎn)錄體；有很少一部分成簇的piRNA其取向會突然發(fā)生改變，這些具有雙向特點的成簇piRNA則可能從同一個中心啟動子轉(zhuǎn)錄而來。BetelD,SheridanR,MarksDS,etal.《ComputationalanalysisofmousepiRNAsequenceandbiogenesis》.PLoSComputBiol,2007,3(11):e222.piRNA生物學(xué)功能A.piRNA調(diào)控果蠅早期胚胎發(fā)育2001年，Aravin等發(fā)現(xiàn)，果蠅Y染色體上與Stellate同源的假基因Su(Ste)編碼一類小RNA，其長度大于siRNA，與PIWI家族蛋白Aub相互作用，即現(xiàn)在熟知的piRNA。Su(Ste)基因缺失或aub突變即檢測不到Su(Ste)來源的piRNA，同時導(dǎo)致Stellate蛋白積累、果蠅雄性不育。后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)，Aub-Su(Ste)piRNA通過在轉(zhuǎn)錄后水平降解成熟的mRNA，實現(xiàn)對Stellate基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控。B.piRNA參與家蠶性別決定家蠶piRNA的最新研究發(fā)現(xiàn)，來自性染色體的FempiRNA通過直接切割靶mRNA參與性別決定。家蠶采用ZW性別決定系統(tǒng)，即雄性攜帶兩條Z染色體，而雌性攜帶1條Z染色體和1條W染色體。決定性別的W染色體幾乎全部為轉(zhuǎn)座子序列，至今未鑒定出蛋白質(zhì)編碼基因。W染色體的轉(zhuǎn)錄本可以作為piRNA前體，加工成29nt的FempiRNA，在雌性家蠶中特異性表達(dá)。在家蠶胚胎中轉(zhuǎn)染FempiRNA的反義鏈RNA或通過siRNA下調(diào)家蠶PIWI蛋白Siwi表達(dá)，均導(dǎo)致雌性家蠶出現(xiàn)雄性化特征。C.piRNA介導(dǎo)mRNA衰減PIWI/piRNA調(diào)控基因表達(dá)研究的新進(jìn)展》DOI:10.13376/j.cbls/20150462010年，Rouget等報道發(fā)現(xiàn)果蠅piRNA參與早期胚胎中母源mRNA的降解。胚胎發(fā)育早期，隨著早期胚胎轉(zhuǎn)錄機(jī)器的啟動，母源mRNA逐漸被胚胎mRNA取代，被稱作母源-合子過渡(maternal-to-zygonictransition)。過渡過程中，母源mRNA的降解通過CCR4-NOT脫腺苷酸復(fù)合物介導(dǎo)。D.piRNA調(diào)控基因表達(dá)的機(jī)制線蟲piRNA由單個的轉(zhuǎn)錄小單元編碼，其序列可覆蓋幾乎所有的蛋白質(zhì)編碼基因。線蟲piRNA執(zhí)行生殖細(xì)胞的全基因組轉(zhuǎn)錄本監(jiān)測任務(wù)，一方面通過可遺傳的RNA誘導(dǎo)的表觀遺傳沉默途徑(RNA-inducedepigeneticsilencingpathway,RNAe)沉默外源的“非我”(non-self)基因；一方面保護(hù)內(nèi)源基因mRNA的穩(wěn)定性，并激活其表達(dá)。21U-RNA加載到線蟲PIWI蛋白PRG-1上，通過序列不完全互補(bǔ)配對識別靶mRNA，招募RNA依賴的RNA聚合酶(RdRP)合成與mRNA完全互補(bǔ)配對的22G-RNA。22G-RNA可以與兩種Argonaute蛋白結(jié)合，與WAGO蛋白結(jié)合則招募組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶啟動RNAe，抑制外源mRNA表達(dá)；與CSR-1結(jié)合則保護(hù)內(nèi)源靶mRNA不受RNAe沉默，并激活其表達(dá)。21U-RNA對基因表達(dá)雙向調(diào)控的確切機(jī)制還有待于進(jìn)一步的研究。E.piRNA調(diào)控轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)座元件是一類存在于多細(xì)胞生物基因組中的不穩(wěn)定元素，它們可以通過頻繁跳躍將自身插入到基因組的其它位點，從而實現(xiàn)對基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)的改變，對物種進(jìn)化具有重要意義。如果轉(zhuǎn)座元件在基因組中毫無約束地隨意移動，則會破壞基因組的穩(wěn)定性和完整性，危害個體的生存。因生殖細(xì)胞擔(dān)負(fù)著傳代的重任，其基因組的穩(wěn)定性和完整性尤為重要。因此，在選擇壓力下，動物生殖系細(xì)胞可能就進(jìn)化獲得了PIWI/piRNA這樣一條獨特小RNA通路，用于控制轉(zhuǎn)座子、逆轉(zhuǎn)座子等自私性基因元件的活性，維持生殖細(xì)胞基因組穩(wěn)定性及完整性。piRNA生物學(xué)功能核心組件PIWI蛋白Argonaute蛋白家族可分為AGO和PIWI兩個亞家族成員，它們在物種間高度保守，并在小分子非編碼RNA調(diào)控途徑中發(fā)揮核心作用。AGO蛋白質(zhì)成員特異性地與小分子干擾RNA(smallinterferingRNA,siRNA)和microRNA(miRNA)結(jié)合，在多種組織器官中發(fā)揮重要功能。PIWI蛋白質(zhì)特異性地在動物生殖系細(xì)胞中表達(dá)，特異性地結(jié)合piRNA，在動物生殖細(xì)胞發(fā)育和配子生成過程中發(fā)揮多種重要功能。Argonaute家族蛋白質(zhì)含有保守的PAZ(PiwiArgonautandZwille)結(jié)構(gòu)域和PIWI結(jié)構(gòu)域。結(jié)構(gòu)及生化研究表明，AGO/PIWI蛋白質(zhì)通過PAZ結(jié)構(gòu)域與小分子RNA的3′末端結(jié)合，而PIWI結(jié)構(gòu)域及MID結(jié)構(gòu)域(themiddledomain)結(jié)合RNA分子的5′末端。PIWI結(jié)構(gòu)域含有RNaseH的催化結(jié)構(gòu)域，一部分Argonaute成員具有核酸內(nèi)切酶活性，可在對應(yīng)于向?qū)NA分子第10位與11位堿基之間切割靶RNA鏈piwi是進(jìn)化上非常保守的一類基因，最早在果蠅中被發(fā)現(xiàn)，對果蠅生殖干細(xì)胞的自我更新和維持是必需的。piwi基因缺失也導(dǎo)致線蟲、斑馬魚及小鼠等模式生物生殖細(xì)胞發(fā)育受阻。這些研究表明，PIWI蛋白主要在動物生殖細(xì)胞中表達(dá)，其功能與生殖事件相關(guān)。在小鼠中，PIWI蛋白家族包括三個成員：MIWI2、MILI和MIWI，它們在小鼠雄性生殖細(xì)胞的發(fā)育分化過程中呈現(xiàn)高度時空特異性表達(dá)。piRNA在腫瘤中的研究迎來井噴piRNA在體細(xì)胞中表達(dá)具有組織特異性在乳腺，肺和胃組織中進(jìn)行piRNA測序和表達(dá)譜分析，發(fā)現(xiàn)piRNA具有組織特異性piRNA在腫瘤中異常表達(dá)Piwi相互作用RNA（piRNA）是一類新發(fā)現(xiàn)的非編碼小RNA，又稱第三類小RNA。它們具有基因表達(dá)調(diào)控的功能，但與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系非常仍然不太清晰。寧波大學(xué)郭俊明在胃癌中（1）發(fā)現(xiàn)了在胃癌組織中異常表達(dá)的piRNA。經(jīng)piRNA芯片檢測胃癌組織和癌旁組織中piRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)一些差異表達(dá)的piRNA，其中piR-651和piR-823的表達(dá)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。（2）揭示了胃癌組織與癌旁組織piRNA表達(dá)譜的差異。發(fā)現(xiàn)胃癌組織中piR-823的表達(dá)水平明顯低于癌旁組織中的表達(dá)水平，而piR-651的表達(dá)則相反。發(fā)現(xiàn)piR-651和piR-823分別高表達(dá)于和低表達(dá)于胃癌組織中，并于胃癌患者的臨床病理因素相關(guān)。（3）胃癌細(xì)胞株與正常胃上皮細(xì)胞中piR-823表達(dá)差異的研究。發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞中piR-823的表達(dá)明顯低于正常胃上皮細(xì)胞中的表達(dá)。（4）多種腫瘤組織中piR-823表達(dá)差異的研究。發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌和肺癌組織中，piR-823的表達(dá)高于相應(yīng)癌旁組織。（5）piR-823類似物抑制胃癌細(xì)胞的生長。把piR-823類似物導(dǎo)入到胃癌細(xì)胞中，MTT結(jié)果顯示MGC-803和SGC-7901的生長均以劑量依賴方式受到抑制。（6）piR-651抑制劑通過影響細(xì)胞周期抑制胃癌細(xì)胞的生長，機(jī)制研究說明其阻止胃癌細(xì)胞于G2/M期。（7）動物實驗說明piR-823具有抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用。（8）外周血piRNA檢測用于胃癌診斷的價值研究。胃癌患者外周血piR-651和piR-823的水平明顯不同于正常人外周血中的水平；腺癌患者外周血piR-651的水平明顯高于印戒細(xì)胞癌的水平；piR-823的水平與TNM分期和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)。piR-651、piR-823單獨使用和聯(lián)合使用的ROC曲線下面積分別為0.890、0.810和0.892；它們的陽性檢測率均高于CEA的檢測率。目的：利用piRNA測序篩選新型乳腺癌預(yù)后生物標(biāo)記物前言Piwi-interactingRNAs(piRNAs)是一類26到32nt的非編碼小RNA，在維持生殖細(xì)胞系上發(fā)揮重要作用，目前還認(rèn)為其在體細(xì)胞中對基因表達(dá)起到轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的作用。Piwi蛋白是piRNA生物合成和作用途徑的中心，對基因的表達(dá)起表觀調(diào)控作用。piRNAs/PIWIs已被報道可作為多種癌癥的潛在生物標(biāo)記物，但其在乳腺癌中的作用尚未得到全面的研究。研究者分別對來自104個病人的石蠟包埋乳腺腫瘤組織和11個凍存正常乳腺組織進(jìn)行小RNA測序。結(jié)果正常組織獲得10Mreads數(shù)，腫瘤組織獲得165Mreads數(shù)，piRNA序列總數(shù)4,207,022條，被注釋到676個piRNA上。發(fā)現(xiàn)25個差異表達(dá)的piRNA，包括17個上調(diào)和8個下調(diào)piNRA。圖1.差異表達(dá)piRNAs的聚類熱圖然后，進(jìn)行病例對照(Case–control)和純病例(Case–only)統(tǒng)計分析，鑒定出8個piRNA可作為新的預(yù)后標(biāo)記。同時利用基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫GEO對PIWI基因進(jìn)行預(yù)后標(biāo)記評價，發(fā)現(xiàn)PIWIL3和PIWIL4也跟預(yù)后相關(guān)。圖2.利用差異piNRA構(gòu)建的危險評分與生存的關(guān)系利用PIWI基因構(gòu)建的危險評分與生存的相關(guān)性最后，利用mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)庫對這些預(yù)后差異顯著的piRNA進(jìn)行靶標(biāo)分析，發(fā)現(xiàn)306個靶標(biāo)基因與piRNA的表達(dá)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。對鑒定的這些靶標(biāo)基因富集分析發(fā)現(xiàn)主要富集到血管生成、轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞信號傳導(dǎo)等功能上。總的來說，該研究捕獲了piRNA異常表達(dá)途徑的整個級聯(lián)事件,并發(fā)現(xiàn)了乳腺癌預(yù)后的新型生物標(biāo)記物。是真核生物轉(zhuǎn)錄后加工過程中RNA剪接體（spilceosome）的主要成分，參與mRNA前體的加工過程。

snRNA（小核RNA）2016年1月8日，清華大學(xué)生命學(xué)院施一公教授研究組在《科學(xué)》（Science）就剪接體的結(jié)構(gòu)與機(jī)理研究再發(fā)長文（ResearchArticle），題為《U4/U6.U5三小核核糖核蛋白復(fù)合物3.8埃的結(jié)構(gòu)：對剪接體組裝及催化的理解》（The3.8AStructureoftheU4/U6.U5tri-snRNP:InsightsintoSpliceosomeAssemblyandCatalysis）報道了釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）剪接體組裝過程中的一個關(guān)鍵復(fù)合物U4/U6.U5tri-snRNP高達(dá)3.8埃分辨率的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，并在此基礎(chǔ)上分析了剪接體的組裝機(jī)制，為進(jìn)一步理解剪接體的激活及前體信使RNA（pre-mRNA）剪接反應(yīng)的催化機(jī)制提供了重要分子基礎(chǔ)。該結(jié)構(gòu)與2015年8月施一公研究組報道的分辨率為3.6埃的裂殖酵母（Schizosaccharomycspombe）剪接體結(jié)構(gòu)的對比揭示了剪接體在pre-mRNA剪接反應(yīng)過程中作為核酶（ribozyme）的催化本質(zhì)，是RNA剪接研究領(lǐng)域的又一重大進(jìn)展。U4/U6.U5tri-snRNP是剪接體組裝過程中最大也是最保守的預(yù)組裝復(fù)合物，它由U5小核核糖核蛋白（snRNP），U4、U6snRNA和其他蛋白因子組成。在該復(fù)合物中，U6snRNA呈現(xiàn)失活構(gòu)象。U4/U6.U5tri-snRNP與A復(fù)合物結(jié)合形成B復(fù)合物，再經(jīng)過一系列成分、構(gòu)象重組后，U1、U4snRNP解離，剪接體形成，U6snRNA從而被激活。所以，tri-snRNP的加入是組裝成具有催化活性的剪接體這個過程中不可或缺的一步，其高分辨率結(jié)構(gòu)的解析對于揭示pre-mRNA剪接反應(yīng)的分子機(jī)理至關(guān)重要。

U4/U6.U5tri-snRNP電鏡密度及三維結(jié)構(gòu)示意圖他們探索并優(yōu)化了蛋白提純方案，獲得了性質(zhì)良好的釀酒酵母U4/U6.U5tri-snRNP復(fù)合物的蛋白樣品，并利用單顆粒冷凍電鏡技術(shù)重構(gòu)出了總體分辨率為3.8埃的三維結(jié)構(gòu)，核心區(qū)域分辨率更是高達(dá)3.0-3.5埃，從而首次將該復(fù)合物分辨率推進(jìn)至近原子分辨率，并搭建了該復(fù)合物的原子模型。此高分辨率的結(jié)構(gòu)中，一個出人意料的發(fā)現(xiàn)是U4/U6.U5tri-snRNP復(fù)合物中存在著與之結(jié)合的pre-mRNA。該pre-mRNA通過與U5snRNA和U6snRNA堿基互補(bǔ)配對被識別，其5‘剪接位點中高度保守的鳥嘌呤核糖核苷酸（Guanine）被關(guān)鍵蛋白Prp8特異性識別。這一發(fā)現(xiàn)為剪接體的組裝和剪接反應(yīng)的催化提供了新的見解。pre-mRNA與tri-snRNP結(jié)合非編碼RNA與其它組學(xué)整合研究（一）非編碼RNA與表觀遺傳學(xué)調(diào)控表觀遺傳學(xué)的特點可遺傳的，即這類改變通過有絲分裂或減數(shù)分裂，能在細(xì)胞或個體世代間遺傳；可逆性的基因表達(dá)調(diào)節(jié)，也有較少的學(xué)者描述為基因活性或功能的改變；沒有DNA序列的改變或不能用DNA序列變化來解釋。表觀遺傳修飾主要包括DNA以及一些與DNA密切相關(guān)的蛋白質(zhì)(例如組蛋白)的化學(xué)修飾.某些非編碼的RNA也在表觀遺傳修飾中起著重要的作用。EpigeneticRegulationofCancerSiteSpecificHypermethylationGlobalHypomethylationHistoneModificationsRegulatingFactorsDietaryHormonalGeneticVermaM,SrivastavaS.LancetOncol.(2002)3:755-63.DNAMethyltransferasesHistoneMethyltransferasesHistoneAcetylases/DeacetylasesEpigeneticsRegulates:CellCycleControlDNADamageApoptosisInvasionX-ChromosomeInactivationImprintingAging表觀遺傳修飾從多個水平調(diào)控基因表達(dá)

DNA:DNA甲基化蛋白質(zhì)：組蛋白修飾

染色質(zhì)：染色質(zhì)重塑

RNA：非編碼RNADNA甲基化

DNA甲基化(DNAmethylation)是研究得最清楚、也是最重要的表觀遺傳修飾形式，通過將S一腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，并在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNAmethyltransferase，DNMT)的催化下，CpG二核苷酸中的胞嘧啶環(huán)上5′位置的氫被活性甲基所取代，從而轉(zhuǎn)變成為5甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5mC)。83哺乳動物基因組中5mC占胞嘧啶總量的2%-7%，約70%的5mC存在于CpG二連核苷。在結(jié)構(gòu)基因的5’端調(diào)控區(qū)域,

CpG二連核苷常常以成簇串聯(lián)形式排列，這種富含CpG二連核苷的區(qū)域稱為CpG島(CpGislands)，其大小為500-1000bp，約56%的編碼基因含該結(jié)構(gòu)?；蛘{(diào)控元件(如啟動子)所含CpG島中的5mC會阻礙轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體與DNA的結(jié)合。DNA甲基化一般與基因沉默相關(guān)聯(lián)；非甲基化一般與基因的活化相關(guān)聯(lián)；而去甲基化往往與一個沉默基因的重新激活相關(guān)聯(lián)。癌細(xì)胞的整個基因組水平處于低甲基化狀態(tài)，比正常低20%～60%，這種低甲基化大多發(fā)生于編碼區(qū)和內(nèi)含子區(qū)域，以及約占人類基因組20%～30%的重復(fù)序列區(qū)抑癌基因啟動子區(qū)域CpG島高度甲基化，且與DNA結(jié)合的組蛋白廣泛去乙酰化85組蛋白修飾組蛋白修飾(histonemodification)是表觀遺傳研究的重要內(nèi)容。組蛋白的N端是不穩(wěn)定的、無一定組織的亞單位，其延伸至核小體以外，會受到不同的化學(xué)修飾，這種修飾往往與基因的表達(dá)調(diào)控密切相關(guān)。被組蛋白覆蓋的基因如果要表達(dá)，首先要改變組蛋白的修飾狀態(tài)，使其與DNA的結(jié)合由緊變松，這樣靶基因才能與轉(zhuǎn)錄復(fù)合物相互作用。組蛋白是重要的染色體結(jié)構(gòu)維持單元和基因表達(dá)的負(fù)控制因子。組蛋白修飾的種類染色質(zhì)重塑染色質(zhì)重塑（chromatinremodeling）是一個重要的表觀遺傳學(xué)機(jī)制。染色質(zhì)重塑是由染色質(zhì)重塑復(fù)合物介導(dǎo)的一系列以染色質(zhì)上核小體變化為基本特征的生物學(xué)過程。組蛋白尾巴的化學(xué)修飾（乙?；⒓谆傲姿峄龋┛梢愿淖?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)，從而影響鄰近基因的活性。88MicroRNAmiRNA是近年來生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點，是一組生物體基因組編碼的內(nèi)源性非編碼小RNA。miRNA主要采用降解靶mRNA和抑制靶mRNA的翻譯兩種作用方式在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)。降解靶mRNA的方式與siRNA的作用方式相似，直接作用于靶mRNA，直接導(dǎo)致mRNA表達(dá)水平下降。但絕大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞中的miRNAs并不導(dǎo)致靶mRNA的降解，而是通過與靶mRNA的3’端非翻譯區(qū)（UTR）不完全匹配結(jié)合，抑制mRNA翻譯成蛋白質(zhì)，使靶基因的蛋白質(zhì)表達(dá)水平下降。89

miRNA與腫瘤發(fā)生的關(guān)系存在兩種可能的模式[Caldas,etal.（NatureMedicine2005）]：1、若miRNA表達(dá)上調(diào)，其對應(yīng)抑癌基因表達(dá)下調(diào)時，則可能導(dǎo)致腫瘤發(fā)生；2、若miRNA表達(dá)下調(diào)，其對應(yīng)癌基因表達(dá)上調(diào)時，同樣可能導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。

許多瘤基因和腫瘤抑制基因都受到miRNAs分子的調(diào)控，此時的miRNAs可能起到癌基因或是腫瘤抑制基因的作用。miRNA癌基因的活化和miRNA抑癌基因失活導(dǎo)致腫瘤抑瘤基因表達(dá)下調(diào)以及這些miRNA基因與蛋白編碼癌基因、抑癌基因協(xié)同作用導(dǎo)致腫瘤發(fā)生.miRNA的甲基化修飾92RNA甲基化近兩年，科學(xué)家們首次發(fā)現(xiàn)了一種可逆性的RNA甲基化—m6A。定位了哺乳動物轉(zhuǎn)錄組中的m6A，鑒定了這種動態(tài)修飾的「讀」、「寫」和「擦除」蛋白，解析了m6A在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中的一些功能。RNA甲基化（m6A）研究在表觀遺傳領(lǐng)域開始嶄露頭角，成為最前沿的熱點！N6-甲基腺嘌呤(m6A）是真核生物最常見和最豐富的RNA分子修飾。m6A修飾是METTL3甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體催化的，而最近新發(fā)現(xiàn)的RNA去甲基化酶FTO和ALKBH5可以通過一種α-酮戊二酸和Fe2+依賴型的形式對m6A去甲基化。METTL3(methyltransferaselike3)，F(xiàn)TO和ALKBH5被證明在很多生物過程中起重要作用，從發(fā)育和代謝到生殖。m6A存在于很多物種質(zhì)中，占到了RNA堿基甲基化修飾的80%。m6A主要分布在mRNA中，也出現(xiàn)在非編碼RNA如tRNA，rRNA和snRNA。在轉(zhuǎn)錄成的RNA中相對高的m6A含量會影響RNA的代謝過程，比如剪切，核轉(zhuǎn)運，翻譯能力和穩(wěn)定性，以及RNA轉(zhuǎn)錄2014年發(fā)現(xiàn)了WTAP(wilms"tumour1-associatingprotein)蛋白作為m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物調(diào)控亞基，調(diào)節(jié)m6A甲基轉(zhuǎn)移酶催化亞基METTL3和METTL14在細(xì)胞體內(nèi)的定位和活性。WTAP結(jié)合RNA并招募METTL3/METTL14復(fù)合物對RRACH特異序列進(jìn)行甲基化修飾研究成果MammalianWTAPIsaRegulatorySubunitoftheRNAN6-Methyla