實時熒光定量介紹

實時熒光定量介紹1February2,2023第一頁，共五十頁，2022年，8月28日主要內(nèi)容RealTimePCR基礎(chǔ)知識12RealTimePCR實驗方法3RealTimePCR解析方法4RealTimePCR應(yīng)用實例實時熒光定量PCR介紹2February2,2023第二頁，共五十頁，2022年，8月28日RealTimePCR基礎(chǔ)知識1.RealTimePCR的用途及原理2.RealTimePCR的檢測方法RealTimePCR基礎(chǔ)知識1實時熒光定量PCR介紹3February2,2023第三頁，共五十頁，2022年，8月28日RealTimePCR的用途RealTimePCR用途定性分析定量分析病毒及病原菌定量分析導(dǎo)入基因拷貝數(shù)解析GMO定量檢測差異顯示結(jié)果驗證基因芯片結(jié)果驗證siRNA效果確認(rèn)mRNA表達(dá)量分析病毒及病原菌檢測物種鑒定基因分型絕對定量相對定量實時熒光定量PCR介紹4February2,2023第四頁，共五十頁，2022年，8月28日RealTimePCR的原理

激發(fā)光發(fā)射光使用RealTimePCR擴(kuò)增裝置實時監(jiān)測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物并進(jìn)行分析的方法。RealTimePCRCt值實時熒光定量PCR介紹5February2,2023第五頁，共五十頁，2022年，8月28日RealTimePCR基礎(chǔ)知識1.RealTimePCR的用途及原理2.RealTimePCR的檢測方法RealTimePCR基礎(chǔ)知識1實時熒光定量PCR介紹6February2,2023第六頁，共五十頁，2022年，8月28日TaqManProbeCyclingProbeMolecularBeaconetc.SYBRGreenI熒光染料嵌合法熒光探針法RealTimePCR的檢測方法實時熒光定量PCR介紹7February2,2023第七頁，共五十頁，2022年，8月28日熒光染料嵌合法（SYBRGreenI）SYBRGreenI：是一種能結(jié)合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的 具有綠色激發(fā)波長的染料。SYBRGreenI實時熒光定量PCR介紹8February2,2023第八頁，共五十頁，2022年，8月28日Primer退火FFFFSYBRGreenI法作用機(jī)理示意圖Pol.FPrimerPol.延伸FFFFFFPrimer熱變性FFFF實時熒光定量PCR介紹9February2,2023第九頁，共五十頁，2022年，8月28日TaqMan法作用機(jī)理TaqMan探針為一寡核苷酸，5’端標(biāo)記一個報告基團(tuán)（Reporter），3’端標(biāo)記一個淬滅基團(tuán)（Quencher）。RQ實時熒光定量PCR介紹10February2,2023第十頁，共五十頁，2022年，8月28日RQPrimerRQPrimerRQPrimerPol.Pol.熱變性退火延伸TaqManProbe法原理示意圖

實時熒光定量PCR介紹11February2,2023第十一頁，共五十頁，2022年，8月28日One-StepRT-PCR特異性高多重PCR檢出Probe設(shè)計要求高

Probe法

Probe合成費(fèi)用高SYBRGreenI法與Probe法比較常用于mRNA表達(dá)量分析等SYBRGreenI法

簡便易行價格便宜要求反應(yīng)的特異性不能進(jìn)行多重PCR常用于SNP解析，病毒、病源菌檢測實時熒光定量PCR介紹12February2,2023第十二頁，共五十頁，2022年，8月28日主要內(nèi)容2RealTimePCR實驗方法反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)RealTimePCR反應(yīng)實時熒光定量PCR介紹13February2,2023第十三頁，共五十頁，2022年，8月28日RT

Primer的選擇

RandomPrimer

OligodTPrimerGeneSpecificPrimerRandom6merPrimerGeneSpecificPrimerOligodTPrimerPCRR-PrimerPCRF-Primer實時熒光定量PCR介紹14February2,2023第十四頁，共五十頁，2022年，8月28日目的片段在距Poly(A)Tail1.5kbp以內(nèi)適用，RT效率較高。OneStepRT-PCR只能使用GeneSpecificPrimer，但不適用于復(fù)數(shù)基因的檢出。5’3’GeneSpecificPrimer目的片段RFAAA···5’3’目的片段RF1,500baseOligodTPrimerRandom目的片段5’3’RF目的片段在mRNA任何位置都能使用。通常mRNA表達(dá)量分析最適。OligodTPrimer5’3’RFAAA···目的片段Random適用于mRNA表達(dá)量分析，提升反應(yīng)檢測的靈敏度。RT

Primer的選擇實時熒光定量PCR介紹15February2,2023第十五頁，共五十頁，2022年，8月28日RealTimePCR引物設(shè)計目的是獲得目的基因，對非特異性反應(yīng)和引物二聚體要求不嚴(yán)格。目的是讓目的基因按照理論值進(jìn)行擴(kuò)增，對非特異性反應(yīng)和引物二聚體要求嚴(yán)格。RealTimePCR用引物與普通PCR引物設(shè)計要求不同=>對引物設(shè)計要求嚴(yán)格普通PCR引物RealTimePCR引物實時熒光定量PCR介紹16February2,2023第十六頁，共五十頁，2022年，8月28日兩條引物的Tm值盡量接近，應(yīng)用專用軟件計算Tm值★★★Tm值40-60%(最好45-55%)

★GC含量Primer長度80-150bp(盡量限制在300bp以內(nèi))★擴(kuò)增片段大小★17-25base使用BLAST檢索，確認(rèn)引物特異性★★★特異性

△

引物內(nèi)部或兩條引物之間避免3base以上的互補(bǔ)序列

△

引物3’末端避免2base以上的互補(bǔ)序列★★★互補(bǔ)性3’末端序列

△

整體上堿基不能過偏

△

個別部分避免GCrich或ATrich(特別是3’端)

△

避免T/C連續(xù)，A/G連續(xù)★序列★

△

3’末端避免GCrich或ATrich

△

3’末端堿基最好為G或C

△

3’末端堿基盡量避免為T盡量在Exonjunction上設(shè)計引物，限制基因組DNA擴(kuò)增★★★RT-PCR用引物RealTimePCR引物設(shè)計原則實時熒光定量PCR介紹17February2,2023第十七頁，共五十頁，2022年，8月28日探針的Tm比引物高8-10℃★★★Tm值20-24bp★★Probe長度探針5’末端的第一個堿基不能是G★5’末端序列△目的序列GC含量相對較高的區(qū)域設(shè)計

△整體上堿基不能過偏

△個別部分避免GCrich或ATrich(特別是3’端)；避免T/C

連續(xù)，A/C連續(xù)★序列Probe內(nèi)部或Probe與兩條引物之間避免3base以上的互補(bǔ)序列★★★互補(bǔ)性BLAST檢索確認(rèn)Probe特異性★★★特異性RealTimePCR用TaqMan探針設(shè)計原則RealTimePCR探針設(shè)計原則實時熒光定量PCR介紹18February2,2023第十八頁，共五十頁，2022年，8月28日線性關(guān)系、擴(kuò)增效率確認(rèn)檢測靈敏度確認(rèn)PCR擴(kuò)增效率（E）：35Cycles內(nèi)可得到好的定量結(jié)果。如果采用SYBR檢測方法，30Cycles內(nèi)無非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增。NoTemplateControl確認(rèn)30Cycles內(nèi)無引物二聚體產(chǎn)生。相關(guān)系數(shù)（r2）：大于0.98反應(yīng)性能確認(rèn)實時熒光定量PCR介紹19February2,2023第十九頁，共五十頁，2022年，8月28日主要內(nèi)容3RealTimePCR解析方法1.標(biāo)準(zhǔn)曲線分析2.融解曲線分析3.絕對定量和相對定量解析方法實時熒光定量PCR介紹20February2,2023第二十頁，共五十頁，2022年，8月28日標(biāo)準(zhǔn)曲線制作擴(kuò)增曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)品梯度的選擇：5～6個梯度標(biāo)準(zhǔn)品稀釋倍數(shù)的選擇：標(biāo)準(zhǔn)品稀釋倍數(shù)通常為10105104103102101100

105

104103102101100實時熒光定量PCR介紹21February2,2023第二十一頁，共五十頁，2022年，8月28日標(biāo)準(zhǔn)品的種類基因組DNA

質(zhì)粒TotalRNA&cDNA

體外轉(zhuǎn)錄RNADNA樣品定量標(biāo)準(zhǔn)品

RNA樣品定量標(biāo)準(zhǔn)品實時熒光定量PCR介紹22February2,2023第二十二頁，共五十頁，2022年，8月28日質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建流程基因組DNAPCR目的基因克隆目的基因目的基因目的基因質(zhì)粒質(zhì)粒提取，OD值定量。將質(zhì)粒梯度稀釋至105-101copies/ul，作為標(biāo)準(zhǔn)品。實時熒光定量PCR介紹23February2,2023第二十三頁，共五十頁，2022年，8月28日體外轉(zhuǎn)錄RNA標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建流程RNA純化后，測OD定量。將RNA梯度稀釋至105-101copies/ul，作為標(biāo)準(zhǔn)品。T7RNApolymerase體外轉(zhuǎn)錄RNATotalRNAPCRcDNARTT7PromoterTTTT???TPCR產(chǎn)物目的基因目的基因目的基因AAAA???AAAAA???A實時熒光定量PCR介紹24February2,2023第二十四頁，共五十頁，2022年，8月28日理想的標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線基線平整NegativeControl為水平線指數(shù)區(qū)較明顯，陡度大平臺區(qū)匯于一起線性范圍寬實時熒光定量PCR介紹25February2,2023第二十五頁，共五十頁，2022年，8月28日理想的標(biāo)準(zhǔn)曲線

相關(guān)系數(shù)（r2）：大于0.98，越接近1，結(jié)果可信度越高。擴(kuò)增效率（E）：，越接近1，越理想。擴(kuò)增效率

相關(guān)系數(shù)

擴(kuò)增效率（E）計算方法

標(biāo)準(zhǔn)曲線X軸表示起始模板濃度（log10)，Y軸表示Ct值時

E=10-1/a-1

標(biāo)準(zhǔn)曲線X軸表示Ct值，Y軸表示起始模板濃度（log10)E=10-a-1實時熒光定量PCR介紹26February2,2023第二十六頁，共五十頁，2022年，8月28日RealTimePCR解析方法3RealTimePCR解析方法1.標(biāo)準(zhǔn)曲線分析2.融解曲線分析3.絕對定量和相對定量解析方法實時熒光定量PCR介紹27February2,2023第二十七頁，共五十頁，2022年，8月28日融解曲線分析

Tm值是指雙鏈DNA分子解鏈一半時的溫度。

SYBRGreenI法進(jìn)行檢出時，要根據(jù)融解曲線確認(rèn)PCR產(chǎn)物的特異性。實時熒光定量PCR介紹28February2,2023第二十八頁，共五十頁，2022年，8月28日特異性產(chǎn)物非特異產(chǎn)物引物二聚體對PCR產(chǎn)物特異性進(jìn)行分析融解曲線分析實時熒光定量PCR介紹29February2,2023第二十九頁，共五十頁，2022年，8月28日3RealTimePCR解析方法1.標(biāo)準(zhǔn)曲線分析2.融解曲線分析3.絕對定量和相對定量解析方法RealTimePCR解析方法實時熒光定量PCR介紹30February2,2023第三十頁，共五十頁，2022年，8月28日絕對定量解析方法提取樣品引物設(shè)計標(biāo)準(zhǔn)品制備RealTimePCR反應(yīng)數(shù)據(jù)分析流程實時熒光定量PCR介紹31February2,2023第三十一頁，共五十頁，2022年，8月28日絕對定量解析方法通過制作標(biāo)準(zhǔn)曲線來確定樣品的初始模板拷貝數(shù)或濃度。通常應(yīng)用于病毒、細(xì)菌、衣原體、支原體的定量檢測及轉(zhuǎn)基因食品的檢測。105104103101擴(kuò)增曲線圖標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

檢測樣品檢測樣品102實時熒光定量PCR介紹32February2,2023第三十二頁，共五十頁，2022年，8月28日相對定量解析方法以上條件不可能同時得到滿足，必須用內(nèi)對照基因（管家基因）校正，進(jìn)行相對表達(dá)量分析。SampleBSampleA目的基因擴(kuò)增效率相同RNA提取效率相同細(xì)胞起始數(shù)相同進(jìn)行相對表達(dá)量分析必要性實際上目的基因表達(dá)量分析實時熒光定量PCR介紹33February2,2023第三十三頁，共五十頁，2022年，8月28日相對定量解析方法管家基因

維持細(xì)胞基本代謝活動所必須的基因,如：GAPDH、β-actin等。篩選方法

根據(jù)文獻(xiàn)提供通過具體實驗篩選實時熒光定量PCR介紹34February2,2023第三十四頁，共五十頁，2022年，8月28日主要內(nèi)容RealTimePCR基礎(chǔ)知識12RealTimePCR實驗方法3RealTimePCR解析方法4RealTimePCR應(yīng)用實例

對SARS病毒培養(yǎng)液中所含SARS病毒RNA進(jìn)行定量分析絕對定量相對定量

分析小鼠某目的基因藥物處理不同時間點(diǎn)表達(dá)量變化實時熒光定量PCR介紹35February2,2023第三十五頁，共五十頁，2022年，8月28日絕對定量應(yīng)用例

對SARS培養(yǎng)液中所含SARS病毒RNA進(jìn)行定量檢測方法

TaqMan?

probe法

檢測樣品3個從SARS病毒培養(yǎng)液中提取的TotalRNA

目的基因

SARS病毒RNA

內(nèi)參

SARSInternalControl

RNA

標(biāo)準(zhǔn)品

SARSControlRNA

試劑

OneStepPrimeScript?RT-PCRKit（PerfectRealTime）（DRR064）

儀器

SmartCyclerⅡ?qū)崟r熒光定量PCR介紹36February2,2023第三十六頁，共五十頁，2022年，8月28日

SYN247F02SYN247R03SYN247F01SYN247R02SYN247R01SYN247F01BamHⅠ

HindⅢpBluescriptIISK(+)VectorT7PromoterBamHⅠ

HindⅢSacⅠsiteSARSControlRNA構(gòu)建絕對定量應(yīng)用例

對SARS培養(yǎng)液中所含SARS病毒RNA進(jìn)行定量實時熒光定量PCR介紹37February2,2023第三十七頁，共五十頁，2022年，8月28日

純化的SARSControlRNAOD值測定結(jié)果

體外轉(zhuǎn)錄的SARSControlRNA電泳照片M1M2M1:-HindⅢdigestM2:DL2,000MarkerDNaseI處理前DNaseI處理后絕對定量應(yīng)用例

對SARS培養(yǎng)液中所含SARS病毒RNA進(jìn)行定量實時熒光定量PCR介紹38February2,2023第三十八頁，共五十頁，2022年，8月28日DNA

BNITMSARAs2AdaptorRSacⅠsiteBamHⅠsiteBNITMSARS1AdaptorFT7PromoterSARSInternalControlRNA的構(gòu)建AApBluescriptIISK(+)Vector

絕對定量應(yīng)用例

對SARS培養(yǎng)液中所含SARS病毒RNA進(jìn)行定量實時熒光定量PCR介紹39February2,2023第三十九頁，共五十頁，2022年，8月28日探針的選擇

TemplatePrimerTaqMan?Probe5’端報告基團(tuán)3’端淬滅基團(tuán)SARSControlRNAorSARSGenomicRNA共用FAM標(biāo)記Eclipse標(biāo)記SARSInternalControlRNA共用ROX標(biāo)記Eclipse標(biāo)記絕對定量應(yīng)用例

對SARS培養(yǎng)液中所含SARS病毒RNA進(jìn)行定量實時熒光定量PCR介紹40February2,2023第四十頁，共五十頁，2022年，8月28日SARSControlRNA105-101擴(kuò)增曲線SARSGenomicRNASample1、２、３擴(kuò)增曲線

SARSInternalControlRNA擴(kuò)增曲線

標(biāo)準(zhǔn)曲線絕對定量應(yīng)用例

對SARS培養(yǎng)液中所含SARS病毒RNA進(jìn)行定量實時熒光定量PCR介紹41February2,2023第四十一頁，共五十頁，2022年，8月28日定量結(jié)果對三個樣品所含SARS病毒RNA進(jìn)行了準(zhǔn)確定量。絕對定量應(yīng)用例

對SARS培養(yǎng)液中所含SARS病毒RNA進(jìn)行定量實時熒光定量PCR介紹42February2,2023第四十二頁，共五十頁，2022年，8月28日相對定量應(yīng)用例

分析小鼠不同組織中PAH基因表達(dá)量的變化情況檢測方法

SYBRGreenI熒光嵌合法管家基因

GAPDH基因目的基因

PAH基因標(biāo)準(zhǔn)品

cDNA試劑

PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser（DRR047）

SYBR?

PremixExTaqTMII(TliRNaseHPlus)（DRR820）

儀器

ThermalCyclerDice?RealTimeSystem（TP800）

實時熒光定量PCR介紹43February2,2023第四十三頁，共五十頁，2022年，8月28日TotalRNA提取TotalRNA基因組DNA去除標(biāo)準(zhǔn)品RNA制備標(biāo)準(zhǔn)曲線制作及預(yù)實驗詳細(xì)的實驗資料獲取實驗設(shè)計及引物設(shè)計、合成樣品RealTimePCR反應(yīng)相對定量計算及數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)整理及論文撰寫相對定量應(yīng)用例

分析小鼠不同組織中PAH基因表達(dá)量的變化情況實時熒光定量PCR介紹44February2,2023第四十四頁，共五十頁，2022年，8月28日提取TotalRNA后電泳照片提取試劑：TaKaRaRNAisoPlus

（D9108）相對定量應(yīng)用例

分析小鼠不同組織中PAH基因表達(dá)量的變化情況MCLBMM：DL2,000DNAMarkerC：ControlRNAL：LiverRNAB：BrainRNA實時熒光定量PCR介紹45February2,2023第四十五頁，共五十頁，2022年，8月28日目的基因標(biāo)準(zhǔn)曲線制作結(jié)果擴(kuò)增曲線圖融解曲線圖標(biāo)準(zhǔn)曲線圖管家基因標(biāo)準(zhǔn)曲線制作結(jié)果相對定量應(yīng)用例

分析小鼠不同組織中PAH基因表達(dá)量的變化情況實時熒光定量PCR介紹46February2,2023第四十六頁，共五十頁，2022年，8月28日擴(kuò)增曲線圖樣品目的基因定量結(jié)果樣品管家基因定量結(jié)果管家基因GAPDH目的基因PAH定量結(jié)果平均值定量結(jié)果平均值通過GAPDH校正的PAH校正值小鼠肝臟和腦中PAH的相對表達(dá)量樣品a12288002221751966002011750.9053757212700204400樣品a2227300207100219900196600樣品b133360034097576.8082.182.41×10-4134030092.65樣品b235410082.4633590076.80相對定量應(yīng)用例

分析小鼠不同組織中PAH基因表達(dá)量的變化情況實時熒光定量PCR介紹47February2,2023第四十七頁，共五十頁，2022年，8月28日通過雙標(biāo)準(zhǔn)曲線方法計算得出，苯丙氨酸羥化酶（PAH）基因在小鼠肝臟中的表達(dá)量明顯高于其在腦組織中的表達(dá)水平，二者的表達(dá)量比例約為3757：1。相對定量應(yīng)用例

分析小鼠不同組織中PAH基因表達(dá)量的變化情況實時熒光定量PCR介紹48February2,2023第四十八頁，共五十頁，2022年，8月28日RealTimePCR試劑使用熒光探針檢測使用Cycling探針檢測擴(kuò)