微生物學(xué)：13厭氧菌（梭狀芽胞b）

（四）梭狀芽胞桿菌屬厭氧芽胞桿菌（anaerobicsporeformingbacilli）只有一個(gè)屬，即梭狀芽胞桿菌屬，簡稱梭菌屬（Clostridum）。本屬具有130個(gè)種的一大群厭氧或微需氧的粗大芽胞桿菌。革蘭染色陽性，但在陳舊培養(yǎng)物中菌體革蘭染色常為陰性，芽胞正圓形或卵圓形，直徑大于菌體，位于菌體中央，極端或次極端，使菌體膨大呈梭狀，故名。臨床有致病性的梭菌主要有破傷風(fēng)梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、肉毒梭菌與艱難梭菌。它們分別引起人類破傷風(fēng)、氣性壞疽、食物中毒和假膜性結(jié)腸炎等。一、破傷風(fēng)梭菌破傷風(fēng)梭菌（C.tetani）是梭菌屬中常見的一種芽胞桿菌，因它引起的疾病叫破傷風(fēng)，故名。（一）臨床意義

破傷風(fēng)梭菌廣泛存在于自然界，當(dāng)機(jī)體受創(chuàng)傷時(shí)或新生兒接生時(shí)使用不潔用具斷臍帶，破傷風(fēng)梭菌可侵入傷口生長繁殖，分泌外毒素（痙攣毒素）。該毒素能封閉脊髓抑制性觸突，從而阻止了抑制性突觸末端釋放抑制性沖動的傳遞介質(zhì)，而破壞了正常的抑制性調(diào)節(jié)功能，從而引起骨骼肌強(qiáng)直性痙攣、抽搐，稱為破傷風(fēng)/臍帶風(fēng)。破傷風(fēng)痙攣毒素◆結(jié)構(gòu)及功能菌體內(nèi)時(shí)為一條完整的多肽鏈釋出菌體時(shí)，被裂解為輕鏈（A鏈）重鏈（B鏈）A鏈則具有毒性作用B鏈?zhǔn)桥c神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合的部位阻止抑制性神經(jīng)介質(zhì)的釋放特有的臨床表現(xiàn)全世界每年約有100萬病例發(fā)生，死亡率在20％左右。新生兒破傷風(fēng)又稱為臍帶風(fēng)或閉口風(fēng)，在發(fā)展中國家，死亡率可高達(dá)90％。破傷風(fēng)——角弓反張破傷風(fēng)——苦笑面容（二）微生物學(xué)檢驗(yàn)形態(tài)與染色

細(xì)長，有周鞭毛，能運(yùn)動。無莢膜。芽胞正圓形，比菌體大，位于菌體頂端，使細(xì)菌呈鼓槌狀，為本菌特征。

G+

48h

G-1.微生物特性圖1-5破傷風(fēng)桿菌純培養(yǎng)晚期的鏡下形態(tài)

(48小時(shí)革蘭染色)培養(yǎng)特征

為專性厭氧菌。在血平板上37℃培養(yǎng)48h，始見薄膜狀爬行物生長，伴β溶血。如在皰肉培養(yǎng)基中，肉渣部分消化，微變黑，有少量氣體。生成甲基硫醇及H2S，有腐敗性惡臭味。生化的反應(yīng)

本菌一般不發(fā)酵糖類，能液化明膠。產(chǎn)生H2S，形成吲哚，不還原硝酸鹽，對蛋白質(zhì)有微弱的消化作用。氣液相色譜可檢出的代謝產(chǎn)物有乙酸、丙酸和丁酸、乙醇和丁醇?？乖瓨?gòu)造

本菌有菌體（O）抗原和鞭毛（H）抗原。菌體抗原各型相同，而鞭毛抗原有型的特異性。據(jù)鞭毛抗原不同，可分為10個(gè)血清型。各型菌所產(chǎn)生毒素的生物活性與免疫活性均相同，可被任何型抗毒素中和。抵抗力

本菌繁殖體抵抗力與其他細(xì)菌相似，但芽胞抵抗力甚強(qiáng)，在土壤中數(shù)年不死，煮沸100℃1h可被殺滅，能耐干熱150℃1h，50g/L的石炭酸10～15h。對青霉素、紅霉素、四環(huán)素敏感，磺胺類有抑制作用，對氨基糖苷抗生素耐藥。2.微生物檢驗(yàn)根據(jù)破傷風(fēng)的典型臨床表現(xiàn)即可作出診斷，故一般不作細(xì)菌學(xué)檢查。必要時(shí)可通過直接涂片鏡檢、厭氧培養(yǎng)和毒力試驗(yàn)進(jìn)行微生物檢驗(yàn)。檢驗(yàn)結(jié)果分析與報(bào)告

一般取傷口分泌物涂片、染色，如見到典型的革蘭陽性鼓槌樣菌，即可報(bào)告：“檢出破傷風(fēng)梭菌”。如取標(biāo)本直接涂片、鏡檢，菌體形態(tài)不典型或菌甚少，難以判定時(shí)，則可進(jìn)行分離培養(yǎng)、動物試驗(yàn)，如果試驗(yàn)結(jié)果陽性，則可報(bào)告：“經(jīng)×天培養(yǎng)出破傷風(fēng)梭菌”和“破傷風(fēng)抗毒素試驗(yàn)陽性”。2.產(chǎn)氣莢膜梭菌（一）臨床意義（二）微生物檢驗(yàn)產(chǎn)氣莢膜梭菌是氣性壞疽的主要病原菌。本菌可產(chǎn)生外毒素及多種侵襲性酶類。外毒素有α、β、γ等12種。其中最重要的是α毒素（卵磷脂酶），引起溶血、組織壞死和血管內(nèi)皮損傷，使血管通透性增高，造成水腫。同時(shí)，α毒素還能促使血小板凝聚，導(dǎo)致血栓形成，局部組織缺血。（一）臨床意義所致疾病主要是氣性壞疽，某些型別也可引起食物中毒和壞死性腸炎。也常與兼性厭氧菌混合感染，引起深部膿腫、敗血癥、胸腔的感染等。除產(chǎn)氣莢膜梭菌外，還有諾維梭菌（C.novyi）、敗毒梭菌（C.septicum）和溶組織梭菌（C.histolyticum）等也是氣性壞疽的病原菌。1微生物特性形態(tài)與染色

產(chǎn)氣莢膜梭菌（C.perfringens）又叫魏氏梭菌（C.Welchii），為G+桿菌，兩端鈍圓，單個(gè)或成雙排列，偶見長絲狀。芽胞橢圓形，位于菌體中央或次極端，芽胞直徑不大于菌體，在一般培養(yǎng)時(shí)不易形成芽胞，在無糖培養(yǎng)基中有利于形成芽胞。在機(jī)體內(nèi)可產(chǎn)生明顯的莢膜。無鞭毛。（二）微生物學(xué)檢驗(yàn)圖1-6產(chǎn)氣莢膜梭菌純培養(yǎng)的鏡下形態(tài)

(革蘭染色)培養(yǎng)特征

對厭氧要求不嚴(yán)格，繁殖迅速。培養(yǎng)2h后，在液體培養(yǎng)基深層即有明顯生長；經(jīng)4～6h孵育后出現(xiàn)表面生長。在固體培養(yǎng)基上，經(jīng)24h培養(yǎng)，表面菌落直徑2～4mm，圓形、凸起、光滑、半透明、邊緣整齊、無遷徙生長現(xiàn)象。在血平板上，多數(shù)菌株有雙層溶血環(huán)，有試驗(yàn)表明，內(nèi)環(huán)完全溶血，是由于θ毒素的作用；外環(huán)不完全溶血則是由α毒素所致。在蛋黃瓊脂平板上，菌落周圍出現(xiàn)乳白色混濁圈。是由于此菌產(chǎn)生的卵磷脂酶分解蛋黃中的卵磷脂，可被特異的抗血清所中和，這一現(xiàn)象稱為Nagler反應(yīng)。在庖肉培養(yǎng)基中產(chǎn)生氣體，肉渣呈粉紅色，不被消化。在牛乳培養(yǎng)基中能分解乳糖產(chǎn)酸，使酪蛋白凝固，同時(shí)產(chǎn)生大量氣體（H2與CO2），將凝固的酪蛋白沖成蜂窩狀，并將液面上的凡士林層向上推擠，甚至沖開管口棉塞，氣勢兇猛，稱為“洶涌發(fā)酵”（stormyfermentation），是此菌的特征。生化反應(yīng)

所有型菌株均能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、乳糖和蔗糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣。不發(fā)酵甘露醇或水楊苷；液化明膠，產(chǎn)生H2S，不能消化已凝固的蛋白質(zhì)和血清，吲哚陰性。主要代謝產(chǎn)物為乙酸和丁酸，有時(shí)也形成丁醇。分型

根據(jù)細(xì)菌產(chǎn)生外毒素種類之不同，可將產(chǎn)氣莢膜梭菌分成A、B、C、D、E5個(gè)毒素型。5型中對人致病的主要是A型和C型，A型最常見，引起氣性壞疽和胃腸炎型食物中毒；C型則可引起壞死性腸炎。2.微生物檢驗(yàn)檢驗(yàn)程序標(biāo)本的采集

一般采取創(chuàng)傷深部的分泌物、穿刺物、壞死組織塊；菌血癥時(shí)期的血液、可疑食物。其中壞死組織等固體應(yīng)研磨制成懸液。

標(biāo)本涂片革蘭染色鏡檢皰肉基等血平板可疑菌落涂片革蘭染色鏡檢庖肉培養(yǎng)基動物實(shí)驗(yàn)血斜面生化反應(yīng)牛奶培養(yǎng)基（洶涌發(fā)酵）在創(chuàng)傷標(biāo)本的涂片中不一定經(jīng)常見到產(chǎn)氣莢膜梭菌的莢膜；一般在流產(chǎn)后感染產(chǎn)氣莢膜梭菌的宮頸涂片上較易查見。芽胞不經(jīng)?？吹?。直接涂片鏡檢深部創(chuàng)口取材涂片革蘭陽性大桿菌白細(xì)胞甚少且形態(tài)不典型伴有其它雜菌分離培養(yǎng)與鑒定

厭氧培養(yǎng)本菌對低濃度氧有耐性，生長迅速，故容易分離。標(biāo)本可接種于庖肉培養(yǎng)基或血平板和卵黃瓊脂平板。在庖肉培養(yǎng)基中培養(yǎng)8～10h后，轉(zhuǎn)種于血平板和卵黃瓊脂平板。鑒定1)形態(tài)特征和缺少芽胞，有莢膜特征。2)菌落特征和糖發(fā)酵反應(yīng)，特別是“洶涌發(fā)酵”現(xiàn)象。3)Nagler試驗(yàn)4)動物試驗(yàn)

5)揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的測定產(chǎn)氣莢膜梭菌的重要代謝產(chǎn)物為乙酸和丁酸。6)與其他梭菌的鑒別。“泡沫肝”將培養(yǎng)物0.5-1.0ml，注入家兔或小鼠靜脈內(nèi)，10min后殺死動物，置37℃培養(yǎng)5-8h。如動物軀體膨脹，即行解剖，可見臟器和肌肉內(nèi)有大量氣泡，尤其以肝臟最為明顯，稱為“泡沫肝”檢驗(yàn)結(jié)果分析與報(bào)告厭氧培養(yǎng)有細(xì)菌生長，可根據(jù)形態(tài)染色特點(diǎn)得出初步判斷，然后根據(jù)鑒定依據(jù)各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行最后鑒定，并作出報(bào)告：“厭氧培養(yǎng)有產(chǎn)氣莢膜梭菌生長”。如無細(xì)菌生長，應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)7天，仍無細(xì)菌生長時(shí)，即可報(bào)告：“厭氧培養(yǎng)7天后無細(xì)菌生長”。3.肉毒梭菌（一）臨床意義（二）微生物檢驗(yàn)肉毒梭菌廣泛存在于自然界，土壤中尚可檢出，偶爾存在于動物糞便中。本菌在厭氧條件下可產(chǎn)生極其強(qiáng)烈的外毒素—肉毒毒素。該毒素可以阻止膽堿能神經(jīng)末梢釋放乙酰膽堿，導(dǎo)致肌肉麻痹。重者可死于呼吸困難與心力衰竭。（一）臨床意義這種毒素型食物中毒在中國有10多個(gè)省區(qū)均有發(fā)現(xiàn)，新疆較多。引起食物中毒的食品國外以罐頭、臘腸、香腸等制品為主，國內(nèi)以發(fā)酵豆制品為主（占80％以上），其次為發(fā)酵面制品（占10％左右）。本菌尚可使1歲以下嬰幼兒患嬰兒肉毒癥。此外，也有因肉毒梭菌感染傷口或因手術(shù)改變了胃腸道環(huán)境的成年人由本菌定植而產(chǎn)生肉毒病的報(bào)告。1.微生物特性肉毒梭菌（C.botulinum）分8個(gè)毒素型，其中A、B、E、F型對人致病，A、B型最常見。根據(jù)遺傳特性分為Ⅰ～Ⅳ組，Ⅰ、Ⅱ組可引起人類疾病，Ⅰ組多見。因主要引起人和動物肉毒癥，故名。（二）微生物學(xué)檢驗(yàn)肉毒毒素是目前已知毒物中毒性最強(qiáng)者，其毒性比氰化鉀強(qiáng)

倍，肉毒毒素對人的致死量為0.1～1.0μg。該毒素為蛋白質(zhì)，具有一定的耐熱性，80～90℃加熱5～10min或煮沸1min可破壞。國內(nèi)報(bào)告的大多是A型。各型毒素抗原性不同，只能被同型的抗毒素中和。各型毒素的藥理作用都是相同的。一萬形態(tài)與染色

肉毒梭菌為革蘭陽性粗短桿菌，單獨(dú)或成雙排列，有時(shí)可見短鏈狀。有周身鞭毛，無莢膜。20～25℃時(shí)在菌體次極端形成橢圓形芽胞，芽胞大于菌體，使細(xì)菌呈湯匙狀或網(wǎng)球拍狀。圖1-7肉毒梭菌純培養(yǎng)的鏡下形態(tài)(革蘭染色)培養(yǎng)特性

嚴(yán)格厭氧，在普通瓊脂平板上形成直徑3～5mm不規(guī)則菌落，能產(chǎn)生脂酶，在血平板上有β溶血，在卵黃平板上，菌落周圍出現(xiàn)渾濁圈。能消化肉渣，使之變黑，有腐敗惡臭。生化反應(yīng)

該菌生化特性隨毒素型不同而有所差異。在病原性梭菌中，本菌的特征是發(fā)酵蔗糖，不發(fā)酵乳糖。各型均液化明膠，產(chǎn)生H2S，但不產(chǎn)生吲哚。除G型外均產(chǎn)生脂肪酶，都能溶血，一般不產(chǎn)生卵磷脂酶。氣液相色譜分析，各型均可產(chǎn)生乙酸和丁酸，其它有機(jī)酸則隨型而有所不同。抵抗力

本菌芽胞抵抗力很強(qiáng)，可耐熱100℃1h以上。2.微生物檢驗(yàn)肉毒梭菌引起的食物中毒，其診斷主要通過檢出毒素，因肉毒梭菌本身并不致病。一般在檢查毒素的同時(shí)作細(xì)菌分離培養(yǎng)，并檢測分離細(xì)菌產(chǎn)生毒素的能力和性質(zhì)。檢驗(yàn)程序（見書本）標(biāo)本的采集

無菌抽取患者血液，分離血清，從患者血清中檢出毒素是最直接最有效的方法。其次應(yīng)采取的標(biāo)本是患者糞便，從中檢出毒素，分離肉毒梭菌，也很有助于臨床診斷。從中毒媒介食品中檢出毒素最容易，采取可疑食品作為送檢標(biāo)本頗為重要。外傷感染性肉毒中毒患者的傷口壞死組織或滲出液也可供作檢驗(yàn)標(biāo)本。供作食品衛(wèi)生檢驗(yàn)的標(biāo)本主要是罐頭食品、發(fā)酵食品以及其它需要檢驗(yàn)的食品，包括毒素檢出或細(xì)菌分離鑒定。標(biāo)本直接檢查

因本菌主要靠肉毒毒素致病，故直接涂片鏡檢意義不大。分離培養(yǎng)與鑒定分離培養(yǎng)

本菌要獲得純培養(yǎng)比較困難。常用增菌方法，以促進(jìn)混合培養(yǎng)物中肉毒梭菌的生長和毒素的產(chǎn)生，再經(jīng)動物接種和保護(hù)性試驗(yàn)，以證明毒素的性質(zhì)。毒素的型別鑒定，須用分型血清作中和試驗(yàn)和反向間接血凝試驗(yàn)。鑒定①涂片鏡檢為革蘭陽性次極端芽胞，呈湯匙狀。②厭氧，消化肉渣且變黑，產(chǎn)生惡臭味。③菌落邊緣有皺褶。④肉毒素檢測試驗(yàn)陽性。⑤與其他梭菌鑒別見書。檢驗(yàn)結(jié)果分析與報(bào)告若從標(biāo)本或培養(yǎng)物中檢出肉毒毒素，則可報(bào)告：“從××中檢出肉毒毒素”，有肯定診斷價(jià)值。標(biāo)本37℃厭氧培養(yǎng)48～72h后，若有菌生長，經(jīng)分離培養(yǎng)后，如符合鑒定依據(jù)，可報(bào)告：“厭氧培養(yǎng)有肉毒梭菌生長”，并同時(shí)作毒素測定。如無菌生長，應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)7d，仍無菌生長時(shí)，即可報(bào)告：“經(jīng)7d厭氧培養(yǎng)無肉毒梭菌生長”。4.艱難梭菌（一）臨床意義（二）微生物檢驗(yàn)（一）臨床意義艱難梭菌是人和動物腸道寄生菌，在幼兒的糞便中最常見，為腸道正常菌群的成員。此菌對氨芐青霉素、頭孢菌素、林可霉素、氯林可霉素、紅霉素、四環(huán)素耐藥。長期使用這些抗生素，引起菌群失調(diào)，造成假膜性結(jié)腸炎。

臨床表現(xiàn)為腹瀉、腹痛、伴有全身中毒癥狀，常較嚴(yán)重，有時(shí)可致死。除假膜性結(jié)腸炎外，艱難梭菌尚可引起腎盂腎炎、腦膜炎、腹腔及陰道感染、菌血癥和氣性壞疽等。近年日益重視。1.微生物特性艱難梭菌（C.difficile）是梭菌屬中的一種專性厭氧菌，對氧十分敏感，很難分離培養(yǎng)，故名。形態(tài)與染色本菌為粗長桿菌，大小約1.3～1.6μm×3.6～6.4μm，能運(yùn)動或不能運(yùn)動，運(yùn)動性菌株為周毛菌。芽胞為卵圓形，位于菌體次極端，無莢膜，革蘭染色陽性，但培養(yǎng)2d后有轉(zhuǎn)為陰性趨向。（二）微生物學(xué)檢驗(yàn)圖1-8艱難梭菌純培養(yǎng)的鏡下形態(tài)(革蘭染色)培養(yǎng)特性

本菌為嚴(yán)格的專性厭氧菌，用常規(guī)的厭氧培養(yǎng)法不易生長。生長最適溫度為30～37℃。在血瓊脂、牛心腦浸液瓊脂及CCFA（cycloserine-cefoxitin–fructose-agar）等平板上，經(jīng)48h培養(yǎng)后，菌落直徑3～5mm，圓形，略凸起，白色或淡黃色、不透明、邊緣不整齊、表面粗糙。在血平板上不溶血，在卵黃瓊脂平板上不形成乳濁環(huán)。CCFA平板上的菌落，在紫外線照射下，可見黃綠色熒光。本菌經(jīng)肉湯培養(yǎng)2d以上，菌體有溶融現(xiàn)象。生化反應(yīng)

不分解蛋白質(zhì)，發(fā)酵葡萄糖、果糖、甘露醇，產(chǎn)酸。水解七葉苷，液