層析分離技術(shù)

第8章層析分離知識(shí)點(diǎn)：色層分離法的分類及其概念，柱層析技術(shù)，吸附層析技術(shù)，離交層析技術(shù)，生物親和層析技術(shù)，分配層析技術(shù)，凝膠過(guò)濾技術(shù)，電泳技術(shù)，薄板層析技術(shù)。重點(diǎn)：上述各技術(shù)的原理、操作方式、操作過(guò)程、所用裝置和材料的選擇、適用范圍，能夠靈活熟練地運(yùn)用這些技術(shù)。難點(diǎn)：常用層析法的分類及其合理選用。目錄1層析法概述2柱層析3紙層析4薄層層析5吸附層析6分配層析7凝膠過(guò)濾8電泳法9毛細(xì)管電泳10高效液相色譜1層析法概述1.1引言1.2層析的發(fā)展史1.3層析的基本原理及基本概念1.4層析的分類1.5層析劑1.1引言層析原理色譜（層析）法應(yīng)用范圍色譜技術(shù)的提出色譜分離圖示

1.2層析的發(fā)展史年代發(fā)明者發(fā)明的色譜方法或重要應(yīng)用1906Tswett用碳酸鈣作吸附劑分離植物色素。最先提出色譜概念1931Kuhn,Lederer用氧化鋁和碳酸鈣分離a-、b-和g-胡蘿卜素。使色譜法開(kāi)始為人們所重視。1938TaylorUray用離子交換色譜法分離了鋰和鉀的同位素。1941Martin,Synge提出色譜塔板理論；發(fā)明液-液分配色譜；預(yù)言了氣體可作為流動(dòng)相（即氣相色譜）。1952Martin,James從理論和實(shí)踐方面完善了氣-液分配色譜法。1956VanDeemter提出色譜速率理論，并應(yīng)用于氣相色譜。1957基于離子交換色譜的氨基酸分析專用儀器問(wèn)世。1958Golay發(fā)明毛細(xì)管柱氣相色譜。1965Giddings發(fā)展了色譜理論，為色譜學(xué)的發(fā)展奠定了理論基礎(chǔ)。1975Small發(fā)明了以離子交換劑為固定相、強(qiáng)電解質(zhì)為流動(dòng)相，采用抑制型電導(dǎo)檢測(cè)的新型離子色譜法。1981Jorgenson創(chuàng)立了毛細(xì)管電泳法。1.3層析基本概念層析展開(kāi)（development）洗脫液(eluate)

色譜(Chromatograph)。分配系數(shù)洗脫體積：外體積：內(nèi)體積：正相層析：反相層析：1.4層析分類分類原則類型特征據(jù)溶質(zhì)分子與固定相相互作用的機(jī)理不同吸附色譜離子交換色譜疏水作用層金屬螯合色譜共價(jià)作用色譜分配色譜凝膠過(guò)濾親和色譜吸附力不同各物質(zhì)與固定相之間的離子交換能力的不同各物質(zhì)與固定相之間的疏水作用的強(qiáng)弱不同各物質(zhì)與固定相上的金屬離子的絡(luò)合能力的不同巰基化合物的巰基與固定相表面的二硫鍵作用力不同各物質(zhì)在兩液相間的分配系數(shù)不同各物質(zhì)的分子大小或形狀不同利用生物大分子與各種配基的生物識(shí)別能力不同據(jù)實(shí)驗(yàn)技術(shù)

低壓色譜中壓色譜高壓色譜電泳操作壓力小于0.5MPa操作壓力在0.5～5MPa之間操作壓力在5～40MPa之間溶質(zhì)分子在電場(chǎng)中的移動(dòng)速度不同據(jù)固定相的形狀不同柱色譜紙色譜薄層色譜固定相裝在玻璃、不銹鋼或有機(jī)玻璃柱中固定相為以氫鍵與纖維素羥基結(jié)合的水固定相在玻璃平板上鋪成薄層據(jù)流動(dòng)相的物態(tài)不同

氣相色譜液相色譜超臨界流體色譜流動(dòng)相為氣體流動(dòng)相為液態(tài)流動(dòng)相為液態(tài)按操作方式不同

迎頭法頂替法洗脫法將混合物溶液連續(xù)通過(guò)固定相，只有化學(xué)親和力最弱的組分以純粹狀態(tài)最先流出，但其它各組分都不能達(dá)到分離。利用一種化學(xué)親和力比各被結(jié)合組分都強(qiáng)的物質(zhì)來(lái)洗脫，這種物質(zhì)稱為頂替劑。此法處理量大，且各組分分層清楚，但層與層相連，故不能將組分分離完全。將混合液盡量濃縮，使體積縮小，引入固定相的一端，然后用溶劑洗脫，洗脫溶劑可以是原來(lái)溶解混合物的溶劑，也可選用另外的溶劑。吸附色譜與其它色譜法的異同點(diǎn)類型機(jī)理優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)適用范圍吸附色譜化學(xué)、物理吸附操作簡(jiǎn)便易受離子干擾各種生物大分子的分離、脫色、和去熱源凝膠過(guò)濾分子篩的排阻效應(yīng)分辨力高，不會(huì)引起變性各種凝膠介質(zhì)昂貴，處理量有限制分子量有明顯差別的可溶性生物大分子分配色譜溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)相中分配系數(shù)的差異分辨力高，重復(fù)性較好，能分離微量物質(zhì)影響因子多，上樣量太小用于各種生物大分子的分析鑒定親和色譜親和色譜生物大分子與配體之間有特殊親和力分辨力很高一種配體只能用于一種生物大分子，局限性大各種生物大分子聚焦色譜等電點(diǎn)和離子交換作用分辨力高進(jìn)口試制昂貴蛋白質(zhì)和酶1.4層析的分類⑴根據(jù)溶質(zhì)分子與固定相相互作用的機(jī)理不同的分類凝膠過(guò)濾法分配層析法離子交換色層分離法吸附層析法疏水作用色層分離法金屬螯合色層分離法共價(jià)作用色層分離法⑵根據(jù)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的分類低壓層析技術(shù)中壓層析技術(shù)高壓層析技術(shù)電泳法——操作壓力在0.5MPa-5MPa之間——操作壓力在5Mpa-40MPa之間——操作壓力小于0.5MPa——靠溶質(zhì)分子在電場(chǎng)中的移動(dòng)速度不同而分離⑶根據(jù)固定相的形狀不同的分類：

柱層析法紙層析法薄層層析法⑷根據(jù)流動(dòng)相的物態(tài)不同的分類

汽相層析法液相層析法液相層析法⑸操作方式不同的分類迎頭法頂替法洗脫分析法1.5層析劑種類⑴氧化鋁⑵硅膠⑶活性炭⑷瓊脂糖⑸纖維素2柱層析法柱色譜法對(duì)色譜介質(zhì)材料的要求常用柱色譜介質(zhì)的分類柱層析系統(tǒng)的組成柱色譜洗脫方法常用柱色譜介質(zhì)的分類無(wú)機(jī)物色譜介質(zhì)包括：氧化鋁、硅膠、活性炭、膨潤(rùn)土、磷酸鈣(凝膠型和晶型)、氧化鈦和氫氧化鋅凝膠等。聚合物色譜介質(zhì)有：瓊脂糖、葡聚糖、纖維素和聚丙烯酰胺等。

柱色譜洗脫方法

洗脫一般有三種方法：①恒定洗脫法：②逐次洗脫法：③梯度洗脫法：梯度洗脫法是目前最常用的洗脫法。濃度梯度制造器柱色譜系統(tǒng)的組成

色譜介質(zhì)有各種各樣，但柱式色譜系統(tǒng)的組成基本相似，一般由蠕動(dòng)泵、色譜柱、檢測(cè)器、記錄儀以及部分收集器等幾個(gè)部分構(gòu)成(圖2)。

柱式層析系統(tǒng)的組成基本相似。由以下幾個(gè)部分構(gòu)成：A蠕動(dòng)泵B層析柱C裝柱D加試樣E洗脫F檢測(cè)器G部分收集器柱層析系統(tǒng)的組成柱層析裝置圖

緩沖液管柱梯度制造器監(jiān)視器記錄器分劃收集器(1)(2)泵(3)(4)(5)adaptorreservoir膠體裝填膠體A

3紙層析法3.1基本原理3.2操作方法3.3操作步驟小實(shí)驗(yàn)當(dāng)濾紙接觸到溶劑時(shí)，溶液將上升。濾紙上的小圓點(diǎn)是4種不同的氨基酸的混合物。看看接下來(lái)會(huì)發(fā)生什么事情…可以看出1號(hào)氨基酸上升的最高，在濾紙上跑得最快。而4號(hào)氨基酸與濾紙的結(jié)合最緊，因此跑的速度比其他的氨基酸慢。1234這就是紙層析法。對(duì)照上圖，可知道1-4號(hào)的各代表什么氨基酸。紙層析法是分離鑒定蛋白質(zhì)的氨基酸組成的重要工具。

1234甘氨酸半胱氨酸組氨酸纈氨酸紙層析小實(shí)驗(yàn)動(dòng)畫(huà)演示濾紙的選用型號(hào)標(biāo)重(g/m2)厚度(mm)吸水性灰分(%)性能1900.17150-1200.08快速2900.16120-910.08中速3900.1590-600.08慢速41800.34151-1210.08快速51800.32120-910.08中速61800.3090-600.08慢速4薄層層析法4.1薄層層析原理4.2吸附劑及展開(kāi)劑4.3特殊薄層4.4薄層層析操作要點(diǎn)4.5定性分析4.6定量分析4.7薄層層析應(yīng)用4.4薄層層析操作要點(diǎn)鋪板點(diǎn)樣點(diǎn)樣量展開(kāi)顯色注：本部分以操作要點(diǎn)注意事項(xiàng)為主，具體過(guò)程參見(jiàn)咖啡因的分離分析（動(dòng)畫(huà)演示）Doyouunderstand?薄層層析應(yīng)用示例

咖啡因的分離分析（動(dòng)畫(huà)演示）圖1芍藥甙薄層層析掃描圖圖2丹皮酚薄層層析掃描圖5吸附層析法5.1吸附層析定義及原理5.2吸附色層與其他色層分離法的異同點(diǎn)5.3吸附層析的分類5.4無(wú)機(jī)吸附色層分離法5.5疏水作用層析（HIC）5.6金屬螯合層析5.7共價(jià)作用層析法5.8離子交換層析法5.9卡那霉素A、B組分分離純化典型實(shí)例吸附色層與其他色層分離法的異同點(diǎn)吸附層析化學(xué)、物理吸附操作簡(jiǎn)便易受離子干擾各種生物大分子的分離、脫色、和去熱源凝膠層析分子篩的排阻效應(yīng)分辨力高，不會(huì)引起變性各種凝膠介質(zhì)昂貴，處理量有限制分子量有明顯差別的可溶性生物大分子分配層析溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)相中分配系數(shù)的差異分辨力高，重復(fù)性較好，能分離微量物質(zhì)影響因子多，上樣量太小用于各種生物大分子的分析鑒定親和層析親和層析生物大分子與配體之間有特殊親和力分辨力很高一種配體只能用于一種生物大分子，局限性大各種生物大分子聚焦層析等電點(diǎn)和離子交換作用分辨力高進(jìn)口試制昂貴蛋白質(zhì)和酶吸附層析的分類

無(wú)機(jī)材料的吸附色層分離法離子交換色層分離法疏水作用色層分離法共價(jià)作用色層分離法金屬螯合作用色層分離法等作業(yè)名詞解釋：梯度洗脫法、共價(jià)作用層析、免疫親和層析、層析劑的排阻效應(yīng)、分配層析、離子交換層析、凝膠過(guò)濾：2.填空：1)

凝膠過(guò)濾主要應(yīng)用于＿＿＿＿＿＿＿，＿＿＿＿＿＿和＿＿＿＿。凝膠過(guò)濾時(shí)＿＿＿＿＿＿先自柱中流出，凝膠電泳中＿＿＿＿＿運(yùn)動(dòng)速度更快，凝膠電泳是基于＿＿＿＿＿和＿＿＿＿＿雙重機(jī)理，常用的凝膠劑有＿＿＿＿＿＿＿和＿＿＿＿＿＿＿。2)

共價(jià)作用層析主要依靠＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿的原理，吸附層析是基于＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿的機(jī)理，蛋白質(zhì)和離子交換劑的結(jié)合是通過(guò)＿＿＿＿＿＿＿＿＿而結(jié)合，離子交換層析劑有＿＿＿＿＿＿＿和＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿sephadexG-15表示＿＿＿＿＿＿，硅