蛋白序列測定

第三節(jié)蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的相關(guān)概念肽的命名、書寫及特點(diǎn)測序過程一、相關(guān)概念

1.蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)（Primarystructure）:又稱為共價(jià)結(jié)構(gòu)或化學(xué)結(jié)構(gòu)。它是指蛋白質(zhì)中的氨基酸（殘基）的種類、排列順序及連接方式。

特點(diǎn)：①具有部分雙鍵的性質(zhì),不可以旋轉(zhuǎn)②肽鍵比一般的碳-氧鍵短；③與肽鍵相連的氫原子和氮原子呈反式；

2.肽鍵(peptidebond)一個(gè)氨基酸的α-羧基與另一個(gè)氨基酸的α-氨基縮水形成的酰胺鍵（共價(jià)）鍵，稱為肽鍵。3.肽(peptide)

一個(gè)氨基酸的羧基與另一個(gè)氨基酸的氨基縮水形成的化合物，稱為肽。在蛋白質(zhì)分子中，氨基酸借肽鍵連接起來，形成肽鏈。肽和肽鍵的形成肽單位肽鍵肽平面4.殘基(residue)

肽鏈分子中的每一個(gè)氨基酸，由于相互連接而失去一分子水，與原來的結(jié)構(gòu)相比，分子稍有殘缺，因此通常把肽鏈分子中的每一個(gè)氨基酸單位稱為氨基酸殘基(128/110).二、肽的命名及書寫1.命名：習(xí)慣：按數(shù)量的多少、按來源系統(tǒng)：某氨基酰某氨基?！嘲被?.書寫：從N(H)到C(OH)，具方向性

三字母符號或單字母符號表示，中間用“·”或“-”表示。例如:Gly-Glu-Lys-Ala(甘氨基酰谷氨基酰賴氨基酰丙氨酸)

當(dāng)兩個(gè)氨基酸通過肽鍵相互連接形成二肽，在N端仍然有游離的氨基和C端有游離的羧基，每一端連接更多的氨基酸。氨基酸能以肽鍵相互連接形成長的、不帶支鏈的寡肽和多肽。

多肽仍然有游離的α-氨基和α-羧基。少于10AA稱為寡肽，多于10AA稱為多肽或聚肽。分子量大于10000d稱為蛋白質(zhì)，小于10000d稱為多肽。在生物體中，多肽最重要的存在形式是作為蛋白質(zhì)的亞單位。但是，也有許多分子量比較小的多肽以游離狀態(tài)存在。這類多肽通常都具有特殊的生理功能，常稱為活性肽。實(shí)例：谷胱甘肽(glutathione,GSH)

短桿菌肽;腦啡肽；

促甲狀腺素釋放因子（TRH）

-天冬氨酸-苯丙氨酸甲酯（甜味劑）激素類多肽；抗生素類多肽；蛇毒多肽等。重要的肽GSH的作用解毒作用：與毒物或藥物結(jié)合，消除其毒性作用；參與氧化還原反應(yīng)：作為重要的還原劑，參與體內(nèi)多種氧化還原反應(yīng)；保護(hù)巰基酶的活性：使巰基酶的活性基團(tuán)-SH維持還原狀態(tài)；維持紅細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定：消除氧化劑對紅細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞作用。3.肽的理化特點(diǎn)：①肽鍵的酰氨氫不解離，肽的酸堿性質(zhì)主要決定于肽鍵中的游離末端α-NH2、α-COOH及側(cè)鏈R基上的可解離基團(tuán)；②肽中末端α-羧基的pKa值比游離氨基酸的大，末端α-氨基的pKa值比游離氨基酸的小(?)；③游離的α-氨基、α-羧基和R基可發(fā)生與氨基酸中相應(yīng)的類似反應(yīng)，如茚三酮反應(yīng)等；④蛋白質(zhì)部分水解后所得的肽若不發(fā)生消旋，則具有旋光性，短肽的旋光度約等于組成氨基酸的旋光度之和，較長的肽的旋光度則不是簡單加和。二、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)測定步驟測序前提：樣品必須是均一的(純度大于97%)必須知道它的相對分子量，其誤差允許在10%以內(nèi)

1.測定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目

2.拆分蛋白質(zhì)分子的多肽鏈

3.斷開鏈內(nèi)二硫鍵

4.分析每條多肽鏈的氨基酸組成比及數(shù)目

5.鑒定多肽鏈的N、C瑞殘基

6.裂解多肽成小的肽段

7.測各肽段的氨基酸序列

8.重建完整多肽鏈的一級結(jié)構(gòu)

9.確定二硫鍵的位置測序過程(一)N末端測定二硝基氟苯（DNFB）法：肽游離末端NH2與DNFB反應(yīng)生成DNP-肽→黃色DNP-氨基酸丹磺酰氯（DNS）法：用DNS取代DNFB，生成DNS-氨基酸苯異硫氰酸（PITC）法：生成PTH-氨基酸，從肽上斷裂下來氨肽酶法：外切酶，但效果不好氨肽酶法氨肽酶是一類外切酶，它從肽鏈的N末端逐個(gè)向里切。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶也會遇到N末端氨基封閉，用焦谷氨酸氨肽酶處理。C-末端測定肼解法：最重要的化學(xué)方法，肽與肼反應(yīng)，除C-末端氨基酸游離外，其他氨基酸轉(zhuǎn)變?yōu)榘被狨ｋ禄镞€原法：C-末端氨基酸用硼氫化鋰還原成相應(yīng)的α-氨基醇羧肽酶法：最有效、最常用羧肽酶A羧肽酶B羧肽酶Y羧肽酶C

氨基酸酰肼可以與苯甲醛作用變成水不溶性二苯基衍生物而沉淀

GlnAsnCys等不易測出，末端Arg變成鳥氨酸羧肽酶法本方法目前最有效。從羧基端開始向里逐一水解蛋白質(zhì)羧肽酶A：釋放除Pro，Arg和Lys以個(gè)的所有C-末端殘基羧肽酶B：只水解以堿性Arg和Lys為C-末端的肽鍵羧肽酶C：羧肽酶Y：可以作用于任何一個(gè)C-末端殘基二硫鍵的斷裂氧化法：過甲酸還原法：巰基化合物還原（β-巰基乙醇，二硫蘇糖醇等）

此外還需要加8mol/L尿素或6mol/L的鹽酸胍，使蛋白質(zhì)變性。生成的巰基要用碘乙酸等烷化劑保護(hù)。(三)氨基酸組成的測定：酸水解：是主要方法，同時(shí)輔以堿水解；所得氨基酸不消旋，但Trp全部被破壞，Ser，Thr，Tyr部分破壞，Asn和Gln的酰氨基被水解，生成Asp和Glu,同時(shí)釋放出NH3；堿水解：多數(shù)氨基酸都被破壞，但Trp可定量回收(四)多肽鏈的部分裂解酶裂解胰蛋白酶：專一性強(qiáng)，斷裂Lys或Arg的羧基參與形成的肽鍵糜蛋白酶：斷裂Phe，Trp，Tyr，Leu等疏水氨基酸的羧基參與形成的肽鍵嗜熱菌蛋白酶：專一性差，斷裂Val，Leu，Phe，Tyr，Trp等氨基參與形成的肽鍵胃蛋白酶：在酸性條件穩(wěn)定，肽鍵兩側(cè)均為疏水氨基酸。在確定二硫鍵位置時(shí)常用，專一性與糜蛋白質(zhì)酶類似化學(xué)裂解溴化氰（CNBr）：只斷裂Met羧基形成的肽鍵羥氨（NH2OH）：在pH9時(shí)，專一斷裂Asn-Gly之間的肽鍵，其它條件下不專一

今有一個(gè)七肽，經(jīng)分析它的氨基酸組成是Lys，Pro,Arg,Phe,Ala,Tyr和Ser，該肽未經(jīng)糜蛋白酶處理時(shí)，與DNFB反應(yīng)不產(chǎn)生α-DNP-氨基酸，經(jīng)糜蛋白酶作用后，此肽斷裂成兩肽段。其氨基酸組成分別是Ala,Ser,Tyr和Lys，Pro,Arg,Phe。這兩個(gè)肽段分別與DNFB反應(yīng)可分別生成DNP-Ser和DNP-Lys。此肽與胰蛋白酶反應(yīng)，同樣能生成兩個(gè)肽段，它們的氨基酸組成分別是Arg,Pro和Phe,Tyr,Lys,Ser,Ala。試問此七肽的一級結(jié)構(gòu)序列是怎樣？(五)肽段的氨基酸測序Edman化學(xué)降解法：用Edman試劑PITC與游離氨基作用生成PTH-

氨基酸，并可用各種層析技術(shù)分離；現(xiàn)改用蛋白質(zhì)測序儀。酶解法：利用氨肽酶和羧肽酶，局限性大，有困難質(zhì)譜法：質(zhì)譜儀由核苷酸序列推定法：mRNA，cDNA，推出cDNA的核苷酸序列，然后推測出蛋白質(zhì)的氨基酸序列(六)肽段在多肽鏈中次序的決定(七)二硫鍵位置的確定：對角線電流法：一般采用胃蛋白酶水解原來的含二硫鍵的蛋白質(zhì)。一是胃蛋白酶專一低，切點(diǎn)多，得到含有二硫鍵的肽段較小，易分離鑒定；二是在酸性條件下，有利于防止二硫鍵發(fā)生交換反應(yīng)。

對角線電泳過程：把水解后的混合肽段點(diǎn)到濾紙的中央，在pH6.5條件下進(jìn)行第一向電泳，肽段將按大小及電荷不同分離開，然后把濾紙暴露在過甲酸蒸氣中，使S-S氧化成一對含磺酸基丙氨酸的肽。濾紙旋轉(zhuǎn)90度，在與第一向完全相同的條件下進(jìn)行第二向電泳。這時(shí)大多數(shù)氨基酸的遷移率未變，將位于濾紙的一條對角線上，而含磺基丙氨酸的成對肽段將比原來含二硫鍵的肽小而負(fù)電荷增加，結(jié)果它們都偏離了對角線。

問題：有一個(gè)A肽，經(jīng)酸水解分析得知由Lys、Asp、Glu、Arg、Ala、Val和Tyr組成。當(dāng)A肽與DNFB反應(yīng)后，得DNP-Glu，當(dāng)用羧肽酶處理后得游離Asp。如果我們在實(shí)驗(yàn)中將A肽用胰蛋白酶降解時(shí)，得到三個(gè)肽，其中一種(Arg、Gln、Tyr),在pH6.4時(shí)凈電荷為+1，另一種(Ala、Lys)第三種為（Val和Asn）在pH6.4時(shí)，帶電荷為零。此外，A肽用糜