RNA 干擾技術(shù)及其應(yīng)用

葛芹玉學(xué)習(xí)科學(xué)研究中心RNA干擾技術(shù)及其應(yīng)用RNA干擾技術(shù)(RNAinterference)RNAi（RNAinterference，RNA干擾）

近年來的研究表明，將與mRNA對應(yīng)的正義RNA和反義RNA組成的雙鏈RNA(dsRNA)導(dǎo)入細(xì)胞，可以使mRNA發(fā)生特異性的降解，導(dǎo)致其相應(yīng)的基因沉默。這種轉(zhuǎn)錄后基因沉默機制(post-transcriptionalgenesilencing,PTGS)被稱為RNA干擾（RNAi）。

RNAi相關(guān)技術(shù)是研究轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的有效工具，可用于功能基因組學(xué)研究以及基因治療等臨床用途。RNA是生物體內(nèi)最重要的物質(zhì)基礎(chǔ)之一，它與DNA和蛋白質(zhì)一起構(gòu)成生命的框架。但長久以來，RNA分子一直被認(rèn)為是小角色。它從DNA那兒獲得自己的順序，然后將遺傳信息轉(zhuǎn)化成蛋白質(zhì)。然而，一系列發(fā)現(xiàn)表明——這些小分子RNA事實上操縱著許多細(xì)胞功能。它可通過互補序列的結(jié)合反作用于DNA，從而關(guān)閉或調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。甚至某些小分子RNA可以通過指導(dǎo)基因的開關(guān)來調(diào)控細(xì)胞的發(fā)育時鐘。RNAi技術(shù)利用雙鏈小RNA高效、特異性降解細(xì)胞內(nèi)同源mRNA從而阻斷靶基因表達(dá)，使細(xì)胞出現(xiàn)靶基因缺失的表型。近年來研究表明，將與mRNA對應(yīng)的正義RNA和反義RNA組成的雙鏈RNA（dsRNA）導(dǎo)入細(xì)胞，可以使mRNA發(fā)生特異性降解，導(dǎo)致其相應(yīng)的基因沉默。這種轉(zhuǎn)錄后基因沉默機制(post-transcriptionalgenesilencing,PTGS)被稱之為RNA干擾（RNAi）RNA干擾技術(shù)(RNAinterference)研究發(fā)現(xiàn)，雙鏈RNA是RNAi的觸發(fā)物，引發(fā)與之互補的單鏈RNA(

ssRNA,single-strandedRNA)的降解。經(jīng)過Dicer(一種具有RNAaseIII活性的核酸酶)的加工，細(xì)胞中較長的雙鏈RNA(30個核苷酸以上)首先被降解形成21～25個核苷酸的小分子干擾核糖核酸(siRNA，shortinterferingRNA)，并有效地定位目標(biāo)mRNA。siRNA是引發(fā)轉(zhuǎn)錄后基因沉默中序列特異性RNA降解的重要中間媒介，它具有特殊的結(jié)構(gòu)特征，即5’端磷酸基團和3’端的羥基，其兩條鏈的3’端各有兩個堿基突出于末端。由siRNA中的反義鏈參與指導(dǎo)合成被稱為RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RISC）的核蛋白體，再由RISC介導(dǎo)切割目的mRNA分子中與siRNA反義鏈互補的區(qū)域，從而實現(xiàn)干擾靶基因表達(dá)的功能。

雙鏈RNA（dsRNA）對基因表達(dá)的阻斷作用被稱為RNA干擾（RNAinterference，RNAi）。

雙鏈RNA（dsRNA）經(jīng)酶切后會形成很多小片段，siRNA和miRNA。

siRNA一旦與信使RNA(mRNA)中的同源序列互補結(jié)合，會導(dǎo)致mRNA失去功能，即不能翻譯產(chǎn)生蛋白質(zhì)，也就是使基因“沉默”了。1990年，為加深矮牽牛花(petunias)的紫色，Jorgensen等導(dǎo)入了一個強啟動子控制的色素基因?？墒墙Y(jié)果與預(yù)期相反，許多花瓣顏色并未加深，反而呈雜色甚至白色。這是由于轉(zhuǎn)基因和同源的內(nèi)源基因的表達(dá)都被抑制了，Jorgensen把這個現(xiàn)象命名為共抑制(cosuppression)1、RNA干擾現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)1990年RichJorgensen在矮牽?；ㄖ邪l(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因沉默。1998年，F(xiàn)ire發(fā)現(xiàn)線蟲的RNA干擾現(xiàn)象。mex-3RNAAcontrol:notstainedB:wtC:wt+antisenseRNAD:wt+dsRNA1995年，康奈爾大學(xué)的SuGuo博士用反義RNA阻斷線蟲基因表達(dá)的試驗中發(fā)現(xiàn)，反義RNA（antisenseRNA和正義RNA（senseRNA）都阻斷了基因的表達(dá)，他們對這個結(jié)果百思不得其解。直到1998年，AndrewFire的研究證明，在正義RNA阻斷了基因表達(dá)的試驗中，真正起作用的是雙鏈RNA。這些雙鏈RNA是體外轉(zhuǎn)錄正義RNA時生成的。于是提出了RNAi這個詞。2002年，Zernicka-Coetz等用雙鏈RNA注射小鼠受精卵和著床前的胚胎，結(jié)果發(fā)現(xiàn)導(dǎo)入的雙鏈RNA可以特異性的抑制C-mos，E-cadherin和GFP基因的表達(dá)。JudyLieberman和PremlataShankar首先向公眾宣布了在動物中利用RNAi技術(shù)治療疾病的研究進展。同樣在2002年，科學(xué)家研究了酵母和四膜蟲兩種生物體的RNAi現(xiàn)象，他們發(fā)現(xiàn)RNAi對染色體的形狀有著極大的控制作用。RNAi能永久性關(guān)閉或刪除一部分DNA，而不只是簡單地使DNA暫時沉默。2004年，Tomoko和他的同事們發(fā)現(xiàn)一種小dsRNA能夠作用于神經(jīng)基因的表達(dá)，并且能在轉(zhuǎn)錄水平上直接誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化。這種RNA在基因轉(zhuǎn)錄水平上直接參與調(diào)控，它被命名為smRNA。RNAi廣泛存在于自然界隨后，RNAi現(xiàn)象被廣泛地發(fā)現(xiàn)于真菌、擬南芥、水螅、渦蟲、錐蟲、斑馬魚等大多數(shù)真核生物中。這種存在揭示了RNAi很可能是出現(xiàn)于生命進化的早期階段。隨著研究的不斷深入，RNAi的機制正在被逐步闡明，而同時作為功能基因組研究領(lǐng)域中的有力工具，RNAi也越來越為人們所重視。2001年Elbashir等《Nature》上首次報道通過21個核苷酸的siRNA成功地在哺乳動物培養(yǎng)細(xì)胞中誘導(dǎo)特異性基因沉默。2、RNA干擾的機制RNAi=RNAinterferencesiRNA=smallinterferingRNAsiRNP=smallinterferingRibonucleoproteinRISC=RNAInducedSilencingComplex越來越多的研究人員開始采用小分子干擾RNA（smallinterferingRNAs，siRNAs）來抑制特定的哺乳動物基因表達(dá)。siRNA即為能夠以同源互補序列的mRNA為靶目標(biāo)并將其降解而介導(dǎo)RNA干擾途徑的短片斷雙鏈RNA分子。如何設(shè)計有效的siRNA一直是當(dāng)前RNAi研究的熱點話題，不同的實驗室有不同的結(jié)果。RNAi作用機制體外實驗結(jié)果的提示體外實驗表明：RNAi反應(yīng)中，加入的dsRNA被切割為21-23核苷酸長的RNA片段，后者會使目的mRNA被切割為21-23核苷酸長的片段。從已經(jīng)發(fā)生RNAi的果蠅S2細(xì)胞中，Hammond等人部分純化了一種核酸酶，該核酸酶具有序列特異性，它僅降解與引起RNAi的dsRNA具有同源序列的mRNA。那么這種核酸酶是如何確定哪些mRNA該降解而哪些不該呢？由于在純化該核酸酶時，可以共分離出21-23核苷酸長的dsRNA片段，這暗示該核酸酶對mRNA的切割有可能是以這些片段作模板指導(dǎo)進行的。根據(jù)以上的實驗結(jié)果，人們提出一種RNAi作用的簡單模型。RNAi作用的簡單模型當(dāng)dsRNA導(dǎo)入細(xì)胞后，被一種dsRNA特異的核酸內(nèi)切酶識別，切割成21-23核苷酸長的小片段，這些片段可與該核酸酶的dsRNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合，并且作為模板識別目的mRNA。識別之后，mRNA與dsRNA的有義鏈發(fā)生鏈互換，原先dsRNA中的有義鏈被mRNA代替，從酶-dsRNA復(fù)合物中釋放出來，而mRNA則處于原先的有義鏈的位置。核酸酶在同樣位置對mRNA進行切割，這樣又產(chǎn)生了21-23核苷酸長的dsRNA小片段，與核酸酶形成復(fù)合物，繼續(xù)對目的mRNA進行切割，從而使目的基因沉默，產(chǎn)生RNAi現(xiàn)象。通過遺傳分析的方法，目前已從線蟲中已分離到RDE-2,RDE-3和Mut-7等RNAi相關(guān)的基因。RNAi研究的一般技術(shù)路線一般設(shè)計原則（1）從mRNA的AUG起始密碼開始，尋找“AA”二連序列，并記下其3'端的19個堿基序列，作為潛在的siRNA靶位點。有研究結(jié)果顯示GC含量在30%—50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更為有效。（2）將潛在的序列和相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫（人，或者小鼠，大鼠等等）進行比較，排除那些和其他編碼序列/EST同源的序列。例如使用BLAST.（3）選出合適的目標(biāo)序列進行合成。通常一個基因需要設(shè)計多個靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。負(fù)對照一個完整的siRNA實驗應(yīng)該有負(fù)對照。作為負(fù)對照的siRNA應(yīng)該和選中的siRNA序列有相同的組成，但是和mRNA沒有明顯的同源性。通常的做法是將選中的siRNA序列打亂，同樣要檢查結(jié)果以保證它和其他基因沒有同源性。3、制備siRNAs的方法

（1）化學(xué)合成;

（2）體外轉(zhuǎn)錄;

（3）用RNaseIII消化長片斷雙鏈RNA制備siRNA。這種方法——制備一份混合有各種siRNAs“混合雞尾酒”

,siRNA混合物中有許多不同的siRNAs，通常能夠保證目的基因被有效地抑制。盡管化學(xué)合成是最貴的方法，但是卻是最方便的——研究人員幾乎不需要做什么工作。許多公司都可以根據(jù)用戶要求提供高質(zhì)量的化學(xué)合成siRNA。主要的缺點包括價格高，定制周期長，特別是有特殊需求的。由于價格比其他方法高，為一個基因合成3-4對siRNAs的成本就更高了，比較常見的做法是用其他方法篩選出最有效的序列再進行化學(xué)合成。最適用于：已經(jīng)找到最有效的siRNA的情況下，需要大量siRNA進行研究；不適用于：篩選siRNA等長時間的研究，主要原因是價格因素。化學(xué)合成法體外轉(zhuǎn)錄相對化學(xué)合成法而言成本比較低，是一種性價比高的篩選siRNAs的好方法。更重要的是能夠更快的得到siRNAs。值得一提的是體外轉(zhuǎn)錄得到的siRNAs只要較低的濃度就可以達(dá)到化學(xué)合成siRNAs較高濃度得到的效果。不足之處：實驗的規(guī)模受到限制，雖然一次體外轉(zhuǎn)錄合成能提供足夠做數(shù)百次轉(zhuǎn)染的siRNAs，但是反應(yīng)規(guī)模和量始終有一定的限制。最適用于：篩選siRNAs，特別是需要制備多種siRNAs，化學(xué)合成的價格成為障礙時。不適用于：實驗需要大量的，一個特定的siRNA；長期研究。用RNaseIII消化長片斷雙鏈RNA制備siRNA

其他制備siRNA的方法的缺陷是需要設(shè)計和檢驗多個siRNA序列以便找到一個有效的siRNA。這種方法——制備一份混合有各種siRNAs“混合雞尾酒”

就可以避免這個缺陷。這個方法是選擇通常是200—1000堿基的靶mRNA模版，用體外轉(zhuǎn)錄的方法制備長片斷雙鏈dsRNA

，然后用RNaseIII(orDicer)在體外消化，得到一眾siRNAs“混合雞尾酒”。在除掉沒有被消化的dsRNA后，這個siRNA混合物就可以直接轉(zhuǎn)染細(xì)胞，方法和單一的siRNA轉(zhuǎn)染一樣。由于siRNA混合物中有許多不同的siRNAs，通常能夠保證目的基因被有效地抑制。4、RNA干擾的技術(shù)流程siRNA（SmallinterferingRNA）的設(shè)計與合成siRNA的體內(nèi)、體外轉(zhuǎn)運RNAi的檢測（核酸及蛋白水平）siRNA的一般結(jié)構(gòu)：哺乳動物：21-23bpdsRNA

其它生物：更長的片段dTdT（UU）（UU）dTdT4.1siRNA的設(shè)計與合成設(shè)計流程（選擇siRNA靶位點）從轉(zhuǎn)錄本AUG起始密碼子開始，搜尋下游AA序列，記錄跟每個AA3’端相鄰的19個核苷酸作為候選的siRNA靶位點；根據(jù)5‘和3’非翻譯區(qū)（UTR)及靠近起始密碼子（75個堿基之內(nèi)）等富含調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合位點區(qū)域來設(shè)計siRNA。將候選靶位點與相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫比較，去掉哪些與其它編碼序列同源的靶序列。設(shè)計陰性對照：陰性對照siRNA應(yīng)與siRNA的核苷酸組成相同但沒有與基因組明顯同源的序列。一般通過改變siRNA核苷酸順序并經(jīng)同源序列比較確證而得。5’UTRCD8ORF3’UTRCD8siRNAsCD8mRNA5’UTRCD4ORF3’UTRCD4mRNACD4siRNAsmRNA被干擾的區(qū)域效應(yīng)++化學(xué)合成體外轉(zhuǎn)錄（載體/反應(yīng)體系）DICER/RNaseIII消化dsRNAsiRNA表達(dá)框架(siRNAexpressioncassettes，SECs)質(zhì)粒載體體內(nèi)轉(zhuǎn)錄病毒載體體內(nèi)轉(zhuǎn)錄siRNA的合成體外轉(zhuǎn)錄expressionsiRNA表達(dá)框架siRNA表達(dá)框架

siRNA表達(dá)框架(siRNAexpressioncassettes，SECs)是一種由PCR得到的siRNA表達(dá)模版，能夠直接導(dǎo)入細(xì)胞進行表達(dá)而無需事前克隆到載體中。這個方法最早是由Castanotto采用，包括一個RNApolIII啟動子，一段發(fā)夾結(jié)構(gòu)siRNA，一個RNApolIII終止位點。和siRNA表達(dá)載體不同的是，SECs不需要載體克隆、測序等頗為費時的步驟，可以直接由PCR得到，不用一天的時間。因此，SECs成為篩選siRNA的最有效工具，甚至可以用來篩選在特定的研究體系中啟動子和siRNA的最適搭配！siRNA表達(dá)框架如果在PCR兩端添加酶切位點，那么通過SECs篩選出的最有效的siRNA后，可以直接克隆到載體中構(gòu)建siRNA表達(dá)載體。構(gòu)建好的載體可以用于穩(wěn)定表達(dá)siRNA和長效抑制的研究。這個方法的主要缺點是PCR產(chǎn)物很難轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。如果有適合的新型轉(zhuǎn)染試劑能提高SEC的轉(zhuǎn)染效率的話，那問題就可以解決了。另外，沒有克隆到載體中的PCR片斷并不適于大規(guī)模制備。最適用于：篩選siRNA序列，在克隆到載體前篩選最佳啟動子；不適用于：長期抑制研究。如果克隆到載體后就可以了

72hourspost-transfection,thecellswereassessedusingnuclearstainingwithDAPIandimmunofluorescenceusingac-FOSantibody.Non-transfectedcells(NT)aswellascellstransfectedwithanSECexpressinganegativecontrolsiRNA(scramble)demonstratewild-typelevelsofc-FOS.Therelativelevelofreductioningeneexpressionwasquantifiedandisprovidedinthebargraph.

VariableReductioninTargetGeneExpressionUsingSECswithDifferentPromoters.siRNAExpressionCassettesfeaturingthemouseU6(Mo-U6),humanU6(Hu-U6),andhumanH1(Hu-H1)promotersandencodingac-fos-specifichairpinsiRNAweretransfectedintoHeLacells.

制備siRNA5種不同方法的比較4.2siRNA的體內(nèi)、體外轉(zhuǎn)運機械法比如顯微注射和基因槍（biolisticparticle）電轉(zhuǎn)法脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染細(xì)胞siRNAs需要進入細(xì)胞后才能對蛋白的表達(dá)進行抑制，因此將其高效地轉(zhuǎn)入細(xì)胞也是研究成功與否的關(guān)鍵步驟。例如，一個siRNA對某個特定基因表達(dá)的抑制效率是90%，但是其轉(zhuǎn)染效率只有10%，那么總的抑制率只有9%。目前傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)染方法與試劑的效果都不是很理想。但是有專門的RNA轉(zhuǎn)染試劑，其原理也是基于脂質(zhì)體技術(shù)，可用于多種真核細(xì)胞的RNAi研究。4.3RNAi的檢測（核酸及蛋白水平）RNAi的效果分析可從mRNA和蛋白質(zhì)兩方面進行：mRNA：RT-PCR；定量PCR；Northern雜交等。蛋白質(zhì)：Western雜交；ELISA；免疫熒光等。細(xì)胞的代謝過程，生理生化系數(shù)等表型參數(shù)的變化是RNAi效果最終和最大的體現(xiàn)。5、RNA干擾的應(yīng)用研究基因功能的新工具線蟲和果蠅的全部基因組序列已測試完畢，發(fā)現(xiàn)大量未知功能的新基因，RNAi將大大促進對這些新基因功能的研究。與傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)相比，這一技術(shù)具有投入少，周期短，操作簡單等優(yōu)勢。開展基因治療的新策略

RNAi具有抵抗病毒入侵，抑制轉(zhuǎn)座子活動，防止基因序列過量增殖等作用，因此可以利用RNAi現(xiàn)象產(chǎn)生抗病毒的植物和動物，并可利用不同病毒轉(zhuǎn)錄序列中高度同源區(qū)段相應(yīng)的dsRNA抵抗多種病毒。進行藥物篩選的工具（1）在功能基因組中的應(yīng)用在功能基因組研究中，需要對特定基因進行功能喪失或降低突變，以確定其功能。由于RNAi具有高度的序列專一性，可以特異地使特定基因沉默，獲得功能喪失或降低突變，因此RNAi可以作為一種強有力的研究工具，用于功能基因組的研究。將功能未知的基因的編碼區(qū)（外顯子）或啟動子區(qū)，以反向重復(fù)的方式由同一啟動子控制表達(dá)。這樣在轉(zhuǎn)基因個體內(nèi)轉(zhuǎn)錄出的RNA可形成dsRNA，產(chǎn)生RNA干涉，使目的基因沉默，從而進一步研究目的基因的功能--RNAi技術(shù)。根據(jù)所選用序列的不同，可將其分為編碼區(qū)RNAi和啟動子區(qū)RNAi技術(shù)。

編碼區(qū)RNAi技術(shù)自1998年在線蟲中發(fā)現(xiàn)RNAi現(xiàn)象以來，以基因編碼區(qū)為靶序列的編碼區(qū)RNAi技術(shù)已用于線蟲功能基因組的研究。最初這種技術(shù)是通過注射或浸泡等方法直接導(dǎo)入到線蟲的性腺或早期胚胎中。這些方法雖然可以關(guān)閉目的基因的表達(dá)，產(chǎn)生突變表型，但這種表型變化卻不能遺傳。這種早期的RNAi技術(shù)可以用于研究與胚胎發(fā)育有關(guān)的基因的功能，但由于細(xì)胞分裂造成dsRNA的稀釋，使得這種方法在研究成體的基因功能時有一定的局限性。為彌補早期RNAi技術(shù)的上述不足，Tavernarakis等對RNAi技術(shù)進行了改進，將目的基因的靶序列以反向重復(fù)的方式，由熱激啟動子控制在轉(zhuǎn)基因生物中表達(dá)。熱激處理后，反向重復(fù)序列在細(xì)胞內(nèi)開始轉(zhuǎn)錄，其產(chǎn)物會形成具發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)的dsRNA，從而產(chǎn)生RNAi，使目的基因沉默。這種改進的RNAi技術(shù)與傳統(tǒng)的RNAi技術(shù)相比，具有明顯的優(yōu)點：首先轉(zhuǎn)基因可以遺傳給后代，有利于突變的分析；其次dsRNA可以被誘導(dǎo)產(chǎn)生，RNAi能夠在發(fā)育特定階段出現(xiàn)，從而使研究發(fā)育早期必需基因在發(fā)育晚期的功能成為可能；另外，當(dāng)用細(xì)胞特異性啟動子控制dsRNA的表達(dá)時，可以研究特定基因在不同器官中的功能。KennerdellJ.R.和CarthewR.W.用GAL4/UAS系統(tǒng)控制dsRNA在果蠅中的表達(dá)，實現(xiàn)了誘導(dǎo)性或細(xì)胞特異性控制RNAi的發(fā)生。

編碼區(qū)RNAi技術(shù)隨著應(yīng)用RNAi技術(shù)研究線蟲功能基因組工作的開展，研究人員對該技術(shù)在植物中應(yīng)用的可能性進行了探索。加州理工大學(xué)的ChuangC.F.和MegerowitzE.M.使用此技術(shù)研究了擬南芥的AG,CLV3,AP1,PAN四個開花相關(guān)基因。結(jié)果表明使用RNAi技術(shù)可以產(chǎn)生功能喪失或降低突變體，其表型與以前通過其它方法鑒定的突變體類似。RNA原位雜交表明，RNAi突變體的目的mRNA顯著降低。該結(jié)果說明RNAi技術(shù)亦可以成為功能基因組研究中的有力工具。編碼區(qū)RNAi技術(shù)啟動子區(qū)RNAi技術(shù)M.F.Mett等證明含有啟動子區(qū)的dsRNA在植物體內(nèi)同樣被切割成21-23核苷酸長的片段，這種dsRNA可使內(nèi)源相應(yīng)的DNA序列甲基化，從而使啟動子失去功能，使其下游基因沉默。由于多基因家族的各成員之間高度同源，因而使用編碼區(qū)RNAi技術(shù)很難將各個成員區(qū)分開來研究，而多基因家族內(nèi)的啟動子序列通常比編碼區(qū)變化大，采用啟動子區(qū)RNAi技術(shù)有望將多基因家族的各個成員區(qū)分開來研究。這樣綜合編碼區(qū)RNAi技術(shù)和啟動子區(qū)RNAi技術(shù)的信息即可更全面地了解多基因家族地各成員的功能。RNAi現(xiàn)象存在的廣泛性遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過人們的預(yù)期，對此問題的深入研究結(jié)果將為進化的觀點提供有力佐證。與其它幾種進行功能喪失或降低突變的技術(shù)相比，RNAi技術(shù)具有明顯的優(yōu)點，它比反義RNA技術(shù)和同源共抑制更有效，更容易產(chǎn)生功能喪失或降低突變。而且通過與細(xì)胞特異性啟動子及可誘導(dǎo)系統(tǒng)結(jié)合使用，可以在發(fā)育的不同時期或不同器官中有選擇地進行，與T-DNA技術(shù)造成的功能永久性缺失相比，這是更受科學(xué)家偏愛的。作為一種新的、強有力的研究工具，RNAi在功能基因組學(xué)領(lǐng)域呈現(xiàn)出巨大的應(yīng)用前景，成為當(dāng)今研究領(lǐng)域最引人注意的話題之一。相對于基因敲除技術(shù)(knockout)，RNAi具有快速、有效、容易操作和序列特異性強等優(yōu)點，被稱為基因抑制(knockdown)技術(shù)，是研究特定基因功能的有效方法。因此，在某種程度上可以替代操作復(fù)雜和費用昂貴的基因敲除技術(shù)。啟動子區(qū)RNAi技術(shù)（2）在基因治療中的應(yīng)用

治療HIV感染由于RNAi是機體中古老而天然的抗病毒機制，HIV病毒感染是我們亟待解決的問題，將RNAi技術(shù)應(yīng)用于艾滋病治療是順理成章之事。針對HIV病毒研究有Jacque等設(shè)計的抑制HIV1長末端重復(fù)序列、附件基因vif和nef表達(dá)的siRNA，Lee等針對rev轉(zhuǎn)錄子設(shè)計的siRNA及Novina等]針對HIV病毒gag基因設(shè)計的siRNA，其基本策略都是選擇HIV病毒或宿主細(xì)胞基因為靶點。治療肝炎病毒感染JudeLieberman等已經(jīng)成功地利用RNAi技術(shù)治愈了實驗鼠的肝炎。他們干擾的目標(biāo)是“凋亡相關(guān)蛋白質(zhì)（FAS）基因”。FAs存在于細(xì)胞表面，它能夠啟動細(xì)胞的自殺程序。據(jù)認(rèn)為，許多肝病是由于病毒、免疫系統(tǒng)失?；蚵跃凭卸炯せ盍薋As基因所導(dǎo)致的。JudeLieberman等給實驗鼠尾部血管注入旨在“沉默”FAs基因的siRNA，發(fā)現(xiàn)有90％的肝細(xì)胞接收到了這種RNA分子，F(xiàn)As蛋白質(zhì)的產(chǎn)量變成原先的十分之一。結(jié)果，未接受RNAi治療的實驗鼠有40％在３天內(nèi)死亡。而40只接受過治療的實驗鼠有33只活了下來，10天后研究人員檢查這些實驗鼠的肝部，發(fā)現(xiàn)完全正常。

治療腫瘤

多種癌基因可以作為靶點設(shè)計相對應(yīng)的siRNA

。Brummelkamp等用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將siRNA導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞中,特異性抑制了癌基因kras(v12)的表達(dá)。對急性髓性白血病的研究已經(jīng)取得了樂觀的結(jié)果。Scher等以引起慢性髓性白血病和bcrab1陽性急性成淋巴細(xì)胞白血病的bcrab1癌基因為靶基因,設(shè)計了對應(yīng)的siRNA,并獲得了87%的有效抑制率。Wilda等用siRNA抑制白血病bcr/abl融合基因表達(dá)也取得了成功。因此基于RNAi技術(shù)的抗腫瘤治療藥物開發(fā)潛力巨大。

siRNA表達(dá)載體

多數(shù)的siRNA表達(dá)載體依賴3種RNA聚合酶III啟動子(polIII)中的一種，操縱一段小的發(fā)夾siRNA在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)。包括的人源和鼠源的U6啟動子和人H1啟動子。之所以采用RNApolIII啟動子是由于它可以在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)更多的小分子RNA，而且它是通過添加一串（3到6個）U來終止轉(zhuǎn)錄的。使用這類載體，需要2段編碼短發(fā)夾RNA序列的DNA單鏈，退火，克隆到相應(yīng)載體的polIII啟動子下游。由于涉及到克隆，這個過程需要幾天的時間，同時也需要經(jīng)過測序以保證克隆的序列是正確的。不過幸好載體容易大量擴增，這個優(yōu)點足以彌補所有缺陷，特別是當(dāng)載體在實驗中確實有效的時候。siRNA表達(dá)載體siRNA表達(dá)載體的優(yōu)點在于這是眾多方法中唯一可以進行長期研究的方法——帶有抗生素標(biāo)記的載體可以在細(xì)胞中持續(xù)抑制靶基因的表達(dá)，持續(xù)數(shù)星期甚至更久。即使是對轉(zhuǎn)染帶有篩選標(biāo)記質(zhì)粒的細(xì)胞進行瞬時篩選，也有助于富集帶質(zhì)粒的細(xì)胞。這也可以幫助解決一些難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞由于轉(zhuǎn)染效率低造成的問題。開始研究逆轉(zhuǎn)錄病毒和其他病毒載體用于siRNA表達(dá)，其優(yōu)勢在于可以直接高效率感染細(xì)胞進行基因沉默的研究，避免由于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率低而帶來的種種不便。最適用于：已知一個有效的siRNA序列，需要維持較長時間的基因沉默，或者需要用抗生素篩選能表達(dá)siRNA的細(xì)胞，長期研究。不適用于：篩選siRNA序列（其實主要是指需要多個克隆和測序等較為費時、繁瑣的工作）

Followingtransfection,thecellswereselectedwithhygromycin.Threeweeksfollowingselection,thecellswereanalyzedforGFPexpressionbyfluorescencemicroscopy.Green:GFP.Blue:DAPIstainednuclei.GFPlevelswereremarkablyreduced(94%)incellstransfectedwiththeGFPsiRNA-encodingpSilencer2.1-U6hygrosiRNAExpressionVectorascomparedtothosetransfectedwithan"empty"siRNAexpressionvector.

HeLacellsexpressingcycle3GFPweretransfectedwithpSilencer2.1-U6hygrocontaininganinsertencodingansiRNAtargetingcycle3GFPorpSilencer2.1-U6hygrowithoutansiRNA-encodinginsert.6、內(nèi)源性RNAi機制及其作用多年來，生物學(xué)家認(rèn)為RNA在生命過程中的作用僅僅是將遺傳信息從DNA傳遞到蛋白，就象蜂群中的雄蜂般沒有創(chuàng)意。